王文靜，甘 震，石緒根，宋水林，郭德康，陳麗林，況衛(wèi)剛

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045）

【研究意義】枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）隸屬于薔薇科（Rosaceae）、枇杷屬（Eriobotrya），其栽培歷史已超過2 000年，別名又叫蘆橘、蘆枝、金丸、炎果、焦子。其易于栽培種植，適應(yīng)性較強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)效益高，果實(shí)不僅營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨(dú)特，而且具有潤肺、抗炎、止咳平喘、健胃潤脾等功效，因而深受國內(nèi)外消費(fèi)者喜愛，從而成為了世界性精美果品之一[1]。枇杷在30多個(gè)國家和地區(qū)均有分布和栽培[2-3]，其中我國枇杷的栽培面積和總產(chǎn)量均居于世界首位。枇杷在浙江、福建、江西等地廣泛種植，其中安義枇杷是江西省特產(chǎn)，歷史悠久。由于具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，枇杷逐漸成為栽培區(qū)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展的支柱產(chǎn)業(yè)之一。但是，枇杷從種植、采收到果實(shí)的貯存、運(yùn)輸?shù)日麄€(gè)過程中都會(huì)受到各種病害的危害。常見的有灰斑病、輪紋病、炭疽病、葉尖焦枯病、圓斑病等，這些病害會(huì)導(dǎo)致樹勢(shì)早衰、果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)下降，成為限制枇杷產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的主要因素[4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)外關(guān)于枇杷病害的研究很多，Perell等[5]從培養(yǎng)物及分生孢子形態(tài)特征、致病性測(cè)定等方面將阿根廷枇杷灰斑病致病菌鑒定為Pestalotiopsis guepinii。Chen等[6]從中國安徽省涇縣枇杷灰斑病病樣上分離到致病菌，通過形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)技術(shù)將其鑒定為P. theae。Xiao等[7]研究結(jié)果表明安徽省黃山市枇杷灰斑病的病原為Pestalotiopsis microspora。日本的相關(guān)學(xué)者認(rèn)為P. eriobotryfolia、P. funerea、P. adusta、P. eugeniae、P. longiaristata均可引起枇杷灰斑病[8]。研究學(xué)者對(duì)福建[9]、貴州[10]等地枇杷病害研究表明，病原菌Ascochyta eriobotryae可導(dǎo)致枇杷輪紋病。而對(duì)于枇杷炭疽病的病原，研究結(jié)果表明Colletotrichum acutatum和C. siamense均可導(dǎo)致枇杷炭疽病的發(fā)生[11]。炭疽菌屬種類多樣，存在多個(gè)復(fù)合種，如C. gloeosporioides復(fù)合種、C. acutatum復(fù)合種和C. magnum復(fù)合種等。這些炭疽菌形態(tài)特征不穩(wěn)定，很難通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定[12]。ITS作為用于真菌鑒定的DNA條形碼，對(duì)很多真菌種類鑒定效果較好，但是很難將炭疽菌復(fù)合種區(qū)分開[13]。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，不同的分子標(biāo)記如ACT，TUB2，GPDH和ApMat (APN2/MAT-IGS)等用于炭疽菌的鑒定中，使得鑒定結(jié)果更為準(zhǔn)確[14]。張丹華等[15]研究表明，不同地域枇杷病害的病原菌可能不一致。鑒于炭疽菌種類多樣，寄主范圍廣泛，我國枇杷種植分布又較廣，因而有必要對(duì)枇杷上的炭疽病菌種類進(jìn)一步研究。【本研究切入點(diǎn)】近年來，枇杷炭疽病發(fā)生越來越重，但是對(duì)于引起江西枇杷炭疽病的病原尚缺乏研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究擬對(duì)對(duì)江西省宜春市枇杷炭疽病病原進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步采用菌絲生長速率法分別測(cè)定了6種不同藥劑對(duì)枇杷炭疽病菌的室內(nèi)毒力，以期為病害的綜合防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

枇杷炭疽病病葉采自江西省宜春市上高縣果園。

1.2 供試藥劑

30%苯甲·嘧菌酯懸浮劑（陜西標(biāo)正作物科學(xué)有限公司）；75%戊唑?嘧菌酯水分散性粒劑（上海綠澤生物科技有限責(zé)任公司）；50%咪鮮胺錳鹽可濕性粉劑（蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司）；75%肟菌?戊唑醇水分散性粒劑（拜爾股份公司）；400 g/L氟硅唑乳油（江門市大光明農(nóng)化新會(huì)有限公司）；1%申嗦霉素懸浮劑（江蘇好收成韋恩農(nóng)化股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1病原菌分離培養(yǎng)采用組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離，在超凈工作臺(tái)內(nèi)將刀片滅菌后切取病葉病斑交界處組織塊，每片葉片取1～2個(gè)。將病樣組織用體積分?jǐn)?shù)為70%酒精浸泡30 s、0.1%的升汞浸泡2min、無菌水沖洗3次，將消毒后的病樣組織置于滅菌的濾紙上晾干，置于PDA培養(yǎng)基上，在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每天觀察，待病樣組織中長出菌絲后及時(shí)純化，保存4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2病原菌鑒定將經(jīng)過純化處理的病原菌進(jìn)一步培養(yǎng)，等菌絲長出后，拍照記錄菌落正反面形態(tài)。同時(shí)制作臨時(shí)玻片，在顯微鏡下察看其分生孢子形態(tài)特征，并測(cè)量其大小。

將純化后的真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，采用生工生物真菌DNA提取試劑盒（貨號(hào)B518259）提取其基因組。選取炭疽菌ApMat引物CgDL_F6（5'-AGTGGAGGTGCGGGACGTT-3'）和CgMAT1_F2（5'-TGATGTATCCCGACTACCG-3'）[16]對(duì)真菌的ApMat區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μL：基因組DNA 2 μL，CgDL_F6 1 μL，CgMAT1 F2 1 μL，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL。

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物之后，將PCR產(chǎn)物送到生工生物工程（上海）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序獲得的結(jié)果提交至NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，得到鑒定結(jié)果。

1.3.3室內(nèi)毒力測(cè)定本研究選取生產(chǎn)上常用的防治炭疽病菌的藥劑，苯甲·嘧菌酯、戊唑·嘧菌酯、咪鮮胺錳鹽、肟菌·戊唑醇、氟硅唑、申嗦霉素，進(jìn)行各藥劑室內(nèi)毒力測(cè)定。用菌絲生長速率法測(cè)定不同殺菌劑對(duì)枇杷炭疽病病原菌菌絲生長的影響。將藥劑推薦的使用濃度作為初始濃度，用無菌水將各殺菌劑10倍梯度稀釋，配置成6個(gè)不同溶度的母液。用移液器吸取2 mL的不同濃度的供試藥劑母液，分別加入到18 mL滅菌的PDA培養(yǎng)基，充分混勻后倒入培養(yǎng)皿中，配制成不同濃度的含藥培養(yǎng)基。用無菌打孔器在枇杷炭疽病菌菌落邊緣處打孔取5 mm的菌餅，接種在含藥PDA平板的中央，以未加入藥劑的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)3次。接種后置于24 ℃恒溫箱中倒置培養(yǎng)，待對(duì)照組菌餅長至整個(gè)培養(yǎng)皿的2/3時(shí)，用十字交叉法測(cè)量供試菌株在不同濃度藥劑平板上的菌落直徑，按照下列公式計(jì)算供試藥劑在不同藥劑濃度下的菌絲生長抑制率。

利用SPSS軟件求出抑制率機(jī)率值（y）與濃度對(duì)數(shù)（x）之間的毒力回歸方程、抑制中濃度EC50值及相關(guān)系數(shù)（r）。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷炭疽病癥狀

炭疽病在枇杷整個(gè)生長期都可以發(fā)生，主要危害葉片和果實(shí)，在果實(shí)儲(chǔ)藏運(yùn)輸期間也可發(fā)生。本研究通過田間對(duì)葉片癥狀進(jìn)行了觀察，葉片受害初期病斑呈褐色，圓形或近圓形，后期病斑邊緣呈現(xiàn)暗褐色，中央變?yōu)榛野咨?，田間受害癥狀如圖1。

圖1 枇杷炭疽病葉片發(fā)病癥狀

2.2 病原菌鑒定

對(duì)分離到的真菌進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)其菌落呈現(xiàn)灰白色，隨后顏色逐漸加深，在PDA培養(yǎng)基上于25 ℃、黑暗環(huán)境條件下培養(yǎng)7 d后，菌絲長滿整個(gè)培養(yǎng)皿，后期菌落上出現(xiàn)桔紅色的分生孢子團(tuán)（圖2）。顯微鏡觀察到該菌分生孢子單胞、卵圓形、透明，兩端鈍圓，大小為（13.6～16.5）μm×（5.8～7.1）μm。通過查詢相關(guān)文獻(xiàn)，認(rèn)為該真菌形態(tài)特征與果生炭疽菌一致[17]。

圖2 枇杷炭疽病菌菌落特征和分生孢子形態(tài)

對(duì)所獲得的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示，所得的電泳條帶明亮且單一，與Marker 2000比較，擴(kuò)增獲得的片段大小約在750～1 000 bp（圖3）。利用CgDL_F6和CgMAT1_F2引物對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，經(jīng)NCBI比對(duì)，結(jié)果顯示其序列與果生炭疽菌（Colletotrichum fructicola）的相似性和一致性均為100%。

圖3 供試菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 幾種殺菌劑對(duì)枇杷炭疽病菌的室內(nèi)毒力比較

由表1可見，6種殺菌劑對(duì)枇杷炭疽病菌均表現(xiàn)出一定的抑制效果，但對(duì)菌絲生長的抑制效果不同，毒力差異較大。從藥劑的EC50來看1%申嗦霉素SC抑菌效果最強(qiáng)，其EC50為0.014 mg/L；其次是30%苯甲·嘧菌酯SC、50%咪鮮胺錳鹽WP和400 g/L氟硅唑EC，也表現(xiàn)出較好的抑制效果，EC50分別為0.020，0.021，0.026 mg/L；而75%戊唑·嘧菌酯WDG和75%肟菌·戊唑醇WDG表現(xiàn)出的抑菌活性一般，其EC50分別為0.560 mg/L和0.405 mg/L。

表1 6種殺菌劑對(duì)枇杷炭疽病菌的毒力

3 討論與結(jié)論

炭疽菌屬（Colletotrichum）真菌可以危害200多種植物，是重要的植物病原真菌。該真菌在自然界分布普遍，國內(nèi)外有關(guān)炭疽病菌危害的報(bào)道屢見不鮮。由炭疽菌屬引起的枇杷炭疽病危害嚴(yán)重，制約枇杷產(chǎn)業(yè)鏈的健康發(fā)展。研究表明引起枇杷炭疽病的病原菌種類多樣，Cao等[18]研究表明Colletotrichum acutatum能夠引起枇杷采后果實(shí)炭疽病，李小霞等[19]基于ITS序列分析，認(rèn)為引起貴州枇杷炭疽病的病原為膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides），Wu等[20]基于多基因序列分析結(jié)果表明，成都枇杷果實(shí)炭疽病病原為C. nymphaeae。本研究通過對(duì)江西省宜春市上高縣枇杷炭疽病進(jìn)行調(diào)查取樣，基于ApMat基因序列分析，結(jié)果表明病原菌為果生炭疽菌（C. fructicola）。

為了篩選合適的藥劑用于田間枇杷炭疽病菌的防治，本研究利用生產(chǎn)上常用的6種殺菌劑對(duì)分離獲得的枇杷炭疽病菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定。結(jié)果表明，6種殺菌劑對(duì)病原菌的生長均有一定程度的抑制效果。1%申嗦霉素抑菌效果最好，其次為30%苯甲·嘧菌酯、50%咪鮮胺錳鹽、400 g/L氟硅唑。申嗪霉素是由熒光假單胞菌M18分泌的一種抗菌素，同時(shí)具有廣譜抑制植物病原菌并促進(jìn)植物生長作用的雙重功能的殺菌劑，具有廣譜、高效的特點(diǎn)，對(duì)多種病原真菌、細(xì)菌具有較好的抑制效果，尤其是在跟其它藥劑配比時(shí)表現(xiàn)出良好的增效作用[21]。苯甲·嘧菌酯、咪鮮胺錳鹽和氟硅唑是生產(chǎn)上用于防治炭疽病較好的藥劑，具有很好的應(yīng)用潛力。后續(xù)需要進(jìn)一步對(duì)這幾種藥劑的田間效果進(jìn)行試驗(yàn)，同時(shí)在田間生產(chǎn)使用過程中進(jìn)行藥劑輪換使用，以避免產(chǎn)生抗藥性。