王雪飛，許 穎，信 悅，李文娣，吳 健(1.哈爾濱商業(yè)大學 藥物工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150076；2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱 150076)

趕黃草是赤水河流域的天然草本科植物，其果實部分極少，大部分都是莖和葉，對于趕黃草相關(guān)的諸多記載中，明代朱肅的《救荒本草》是對趕黃草記錄最早的[1].趕黃草雖然在世界分布廣，但目前主要的種植地區(qū)在四川等地，再就是有且僅有在中國，將趕黃草應用為藥用植物.趕黃草不僅屬于當?shù)卣诘闹兴幉?，而且還具有悠久的食用歷史[2].由于趕黃草的藥理作用豐富且有效成份以及活性物質(zhì)繁多，逐漸的引起了世界范圍科學家的興趣.趕黃草的去除黃疸的功效也與名字有關(guān)，這是因為民間傳聞趕黃草對黃疸性肝炎有奇特的作用[3].趕黃草是一種廣泛存于民間的用于治療和預防各種肝病的有效藥物，根據(jù)歷史記錄和現(xiàn)代研究，趕黃草也被編錄到各種藥物典籍當中，在古代治療方法中常用來治病救人，故而有著“神仙草”[4]的美稱.趕黃草的研究及其發(fā)展過程中依舊存在些難以解決的問題，主要是一些研究深度與技術(shù)發(fā)展的問題，解決方案應根據(jù)實際情況分析，目前的解決方法主要是制度的完善、質(zhì)量標準的把控以及深入加強基礎研究和其他領(lǐng)域的發(fā)展，投入更多精力與時間.據(jù)相關(guān)文獻表明，趕黃草藥效作用具有廣泛臨床意義，但有關(guān)本實驗的相關(guān)研究課題尚未全面[5-6].在目前趕黃草的所有研究中，均只有針對其保肝作用黃酮類化學成份進行研究[7]，然而對趕黃草的其他化學成分的分析研究不足，并缺乏一定的準確性和系統(tǒng)性.

黃酮類化合物的提取方法有很多，實驗主要針對回流和超聲兩種提取方法，通過正交試驗對其工藝進行優(yōu)化[8-10]，采用聚酰胺樹脂對總黃酮的純化實驗條件進行篩選[11-12]，為日后趕黃草總黃酮類化合物提取以及富集純化等實驗研究提供數(shù)據(jù)依據(jù).

1 實驗儀器與材料

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(亞榮生化儀器廠)；Cintra10型紫外分光光度儀(UV8100, 萊伯泰科儀器有限公司)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(金城國勝實驗儀器廠)；JP-030ST超聲清洗機(潔盟清潔設備有限公司).

趕黃草(四川瀘州古藺地區(qū))；聚酰胺( 上海源葉生物公司) ；無水乙醇(中藥集團試劑有限公司)；蘆丁(RS03951020，詩丹德生物有限公司)；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(金山化學試劑有限公司).

趕黃草采購于四川瀘州市古藺縣，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學陳寧副研究員鑒定為虎耳草科扯根菜屬植物趕黃草.

2 趕黃草總黃酮的提取實驗

2.1 試驗方法

2.1.1 蘆丁標準曲線及回歸方程的建立

稱取蘆丁標準品2.5 mg，用60%的乙醇配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的標準品溶液.

移液槍精密吸取0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL溶液分別放入6只10 mL的容量瓶中，加入60%乙醇使溶液體積達到5.0 mL，加入5%NaNO2溶液0.3 mL搖勻后靜置5 min；再加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL搖勻后靜置5 min，再加入1.0 mol/LNaOH溶液4.0 mL混勻，最后用60%乙醇定容到10 mL，放置15 min后各組溶液以0.0 mL溶液為空白對照在波長510 nm處分別測得各溶液吸光度.

2.1.2 單因素實驗

1)料液比

稱取3份趕黃草粗粉各5 g，根據(jù)料液比(1∶10、1∶15、1∶20)加入不同體積的60%乙醇溶液于蒸餾燒瓶中，待80 ℃恒溫水浴條件穩(wěn)定后，連接提取實驗器材，提取1 h.經(jīng)趕黃草三次平行提取實驗，將提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，再定容，打開紫外分光光度儀，510 nm處測定提取液吸光度(以下實驗均設此數(shù)值測定)，對三次測定結(jié)果取平均值，整理后繪圖.如圖1可知最佳條件的料液比為1∶15.

圖1 料液比

2)乙醇體積分數(shù)

依據(jù)1)實驗條件下乙醇體積分數(shù)分別為50%、60%、70%的乙醇溶液，對三次測定結(jié)果取平均值，整理后繪圖.如圖2可知最佳條件的乙醇體積分數(shù)為60%.

圖2 乙醇體積分數(shù)

3)提取時間

依據(jù)1)實驗條件下提取不同時間分別為0.5、1、1.5 h提取.三次測定結(jié)果取平均值整理后繪圖.如圖3可知最佳提取時間為1 h.

圖3 提取時間

4)提取溫度

依據(jù)1)實驗條件下提取溫度為40、60、80 ℃，溫度穩(wěn)定后連接回流提取裝置.三次測定結(jié)果取平均值整理后繪圖.如圖4可知最佳提取溫度為80 ℃.

圖4 提取溫度

2.1.3 回流提取正交試驗

據(jù)單因素實驗，建立趕黃草回流提取正交試驗因素及水平，見表1.

表1 回流提取正交試驗因素與水平表

2.1.4 超聲提取法與正交試驗

通過查閱文獻以及趕黃草的超聲預實驗,建立正交試驗表，超聲法選定乙醇體積分數(shù)(A)、超聲提取時間(B)、料液比(C)、溫度(D)等進行試驗,多次定容測定吸光度，取一組計算化合物中含黃酮的量.

根據(jù)最佳提取條件和正交試驗表，實驗每次獲得三次煎煮液，合并，分別定容乙醇水溶液，料液比分別為1∶20、1∶25、1∶30，測得吸光度，填入表中進行對比.超聲提取正交試驗因素和水平，見表2.

表2 超聲提取正交試驗因素與水平表

2.2 實驗結(jié)果

2.2.1 蘆丁標準曲線及回歸方程的建立

各組以0.0 mL溶液為空白對照，在510 nm處測得各溶液吸光度，以吸光度(A)為縱坐標，質(zhì)量濃度(C)為橫坐標繪制標準曲線如圖5.

最后得出回歸方程式：A=13.289C(C為蘆丁標準液質(zhì)量濃度mg/mL；A為吸光度值；相關(guān)系數(shù)R2=0.997 3)，

圖5 蘆丁標準曲線

2.2.2 回流提取的正交試驗

據(jù)表1設立正交試驗，記錄數(shù)據(jù).結(jié)果見表3，方差分析見表4.

對表3進行數(shù)據(jù)分析，R的大小順序反應了實驗因素的影響程度，四種因素對趕黃草的含黃酮量有不同的影響.據(jù)表4分析，在方差影響因素從大到小排序；料液比、提取溫度、乙醇體積數(shù)、回流時間.在順序中，排在前面兩種影響因素，具有顯著影響.

表3 回流提取正交試驗結(jié)果表

表4 回流方差分析表

綜合以上正交試驗數(shù)據(jù)可知，最終得到的趕黃草黃酮類化合物最優(yōu)回流提取條件以及影響因素的大小，其條件為；料液比、提取溫度為、乙醇體積分數(shù)、提取時間四種因素各為1∶15、60℃、60%、1 h.

2.2.3 超聲提取的正交試驗

根據(jù)表2，建立正交試驗.結(jié)果如下:超聲正交試驗見表5，方差分析見表6.

表5 超聲提取正交試驗結(jié)果表

表6 超聲方差分析表

對表5進行數(shù)據(jù)分析，據(jù)以上實驗原理，影響因素從大到小為：料液比、提取溫度、乙醇體積分數(shù)和超聲時間.據(jù)表6分析，在超聲方差影響因素排序，從大到小為：乙醇體積分數(shù)、提取時間、料液比和提取溫度.最佳超聲提取條件分別為60%，50 min，1∶25和50 ℃.

綜上所述,回流法為總黃酮提取的最佳工藝.本實驗采用乙醇，其溶劑是對人體無害的提取劑，利用合適的含乙醇量水溶液能夠有效地提高藥材中的有效成分的溶解度.

在本次實驗研究中，比較了趕黃草總黃酮提取的兩種實驗，旨在簡化工藝，提高提取效率，為今后的趕黃草黃酮類化合物的研究提供基礎數(shù)據(jù).

3 趕黃草總黃酮純化工藝研究

3.1 聚酰胺的預處理

稱取一定量的聚酰胺，放入潔凈干燥的柱子中，稱量定量蒸餾水加入柱中浸泡12 h后，放出蒸餾水計算保留體積，用4～7倍保留體積的無水乙醇沖柱，無水乙醇沖洗后用蒸餾水沖洗至柱中無醇味，后用上述相同體積的5%NaOH溶液沖柱，NaOH溶液沖洗后用蒸餾水沖洗至中性，再用體積分數(shù)為10%CH3COOH溶液沖柱，分數(shù)為用蒸餾水沖洗至中性，沖洗后可直接使用或烘干備用.

3.2 干法上樣

稱取趕黃草干浸膏用蒸餾水溶解后，少量多次的拌入一定比例的聚酰胺樹脂中，直至浸膏溶液完全吸附于聚酰胺上，保證拌樣后聚酰胺為干燥狀態(tài)，將拌樣后的聚酰胺均勻撒在聚酰胺柱上層后繼續(xù)均勻撒少許聚酰胺作為保護層，加壓趕走柱中氣泡，平鋪一層棉花覆蓋聚酰胺，加入沸石壓在棉花上層進行穩(wěn)固.

3.3 實驗方法

3.3.1 聚酰胺的靜態(tài)吸附

稱取30～60目、60～80目、80～100目聚酰胺樹脂各15 g，放入250 mL錐形瓶中，稱取干浸膏1 g加水溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容.定容后轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，放入空氣浴振蕩器中震蕩10 h.取上清液按照標準曲線測定溶液中含黃酮量，代入吸附率公式計中計算總黃酮在三種不同規(guī)格的聚酰胺中的靜態(tài)吸附率.

吸附率(%)=(MW-C1×V1)/MW×100%

其中：V1為錐形瓶中上清液的體積(mL)，C1為上清液總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)，M為趕黃草干浸膏質(zhì)量(mg)，W為浸膏中的總黃酮的百分含量(%).

3.3.2 聚酰胺的動態(tài)吸附與解吸

稱取30～60目、60～80目、80～100目聚酰胺樹脂各15 g，測得保留體積約30 mL，干法上柱，依據(jù)3.3.1方法配制浸膏溶液，拌樣3 g聚酰胺樹脂，120 mL蒸餾水以自然流速沖洗，取3 mL洗脫液根據(jù)標準曲線計算洗脫出的水溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，代入吸附率公式中計算聚酰胺的動態(tài)吸附率.

水洗脫后采用70%的乙醇210 mL繼續(xù)以自然流速沖洗，取3 mL洗脫液根據(jù)標準曲線計算洗脫出的水溶液中總黃酮質(zhì)量濃度，代入解析率公式中計算總黃酮在不同規(guī)格聚酰胺中的動態(tài)解析率.

解析率(%)=(MW-C1×V1)/MW×100%

其中：V1為錐形瓶中上清液的體積(mL)，C1為上清液總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)，M為趕黃草干浸膏質(zhì)量(mg)，W為浸膏中的總黃酮的百分含量(%).

3.3.3 溶液pH值的選擇

稱取五組預處理的聚酰胺各15 g，分別加入250 mL錐形瓶中，依據(jù)3.3.1方法，分別用pH值1、2、3、4、5的水溶解配制浸膏溶液，稱取3 g聚酰胺拌樣，加入錐形瓶中，放入空氣浴振蕩器中震蕩1.5 h.取上清液3 mL按照標準曲線測定溶液中含總黃酮量，代入吸附率公式計算不同質(zhì)量濃度的聚酰胺靜態(tài)吸附率.

3.3.4 裝柱比例的選擇

依據(jù)3.3.1方法配制浸膏溶液，后拌樣3 g聚酰胺樹脂，按照1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25的比例精密稱取預處理后的聚酰胺5、10、15、20、25 g，用7倍保留體積的蒸餾水過柱沖洗，收集流分測定吸光度，按照標準曲線測定溶液中含總黃酮量.

3.3.5 拌樣比例的選擇

稱取預處理后的聚酰胺15 g五組，加入定量蒸餾水浸泡12 h，計算聚酰胺保留體積約30 mL，依據(jù)3.3.1方法配制浸膏溶液，分別按照1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5拌樣聚酰胺，晾干后裝柱，分別量取210 mL蒸餾水沖洗聚酰胺柱，收集流分測定吸光度，按照標準曲線測定溶液中含總黃酮量.

3.3.6 洗脫溶劑pH值的選擇

稱取預處理后的聚酰胺15 g五組分別裝柱，稱取五份1 g趕黃草干浸膏，依據(jù)3.3.1方法配制浸膏溶液拌樣3 g聚酰胺，晾干上柱，再用210 mL的pH值為4、6、8、10、12的70%乙醇沖洗，每30 mL收集洗脫液，測定洗脫液的吸光度并按照標準曲線測定溶液中含總黃酮量，代入解析率公式中計算動態(tài)解析率.

3.3.7 乙醇體積分數(shù)及用量的選擇

稱取預處理后的聚酰胺15 g五組分別裝柱，稱取五份1 g趕黃草干浸膏用蒸餾水溶解后分別拌樣3 g聚酰胺，晾干上柱，再用210 mL的不同體積分數(shù)的乙醇沖洗，乙醇體積分數(shù)分別為10%、30%、50%、70%、90%，每30 mL收集一次洗脫液，測定吸光度并按照標準曲線測定溶液中含總黃酮量，代入解析率公式中計算動態(tài)解析率.

3.4 實驗結(jié)果

3.4.1 聚酰胺的靜態(tài)吸附

三種規(guī)格的聚酰胺對總黃酮的靜態(tài)吸附率分別為82.66%、91.08%、88.35%，結(jié)果如圖6.

圖6 不同規(guī)格聚酰胺吸附率

3.4.2 聚酰胺的動態(tài)吸附與解吸

三種規(guī)格的聚酰胺吸附率分別為78.26%、82.34%、80.15%，結(jié)果表明60～80目聚酰胺對總黃酮的吸附率最高.

計算總黃酮在不同規(guī)格聚酰胺中的動態(tài)解析率的結(jié)果分別為72.92%、79.47%、70.53%.根據(jù)靜態(tài)吸附實驗與動態(tài)吸附實驗的結(jié)果顯示，最終選擇的吸附劑為60～80目的聚酰胺樹脂.結(jié)果如圖7、8.

圖7 不同規(guī)格聚酰胺吸附率

圖8 不同規(guī)格聚酰胺解析率

3.4.3 溶液pH值的選擇

測定上清液的吸光度，依據(jù)標準曲線測定溶液中含總黃酮量，代入吸附率公式中計算靜態(tài)吸附率，根據(jù)計算結(jié)果得出溶液pH值為4時的聚酰胺吸附效果最好. 見圖9.

圖9 不同溶液pH值吸附率結(jié)果

3.4.4 裝柱比例的選擇

測定洗脫液的吸光度，按照標準曲線測定溶液中含總黃酮量，根據(jù)計算結(jié)果得出拌樣比例為1∶3時聚酰胺吸附總黃酮最好.結(jié)果如圖10.

3.4.5 拌樣比例的選擇

測定洗脫液吸光度，按照標準曲線測定溶液中含總黃酮量，根據(jù)計算結(jié)果得出拌樣比例為1∶3時聚酰胺吸附總黃酮最好.結(jié)果如圖11.

圖11 不同拌樣比例吸附率結(jié)果

3.4.6 洗脫溶劑pH值的選擇

測定洗脫液的吸光度并按照標準曲線測定溶液中含總黃酮量，代入解析率公式中計算動態(tài)解析率，根據(jù)計算結(jié)果選擇pH值為8的洗脫劑對趕黃草總黃酮進行洗脫，結(jié)果如圖12.

圖12 不同pH值的洗脫液吸附率結(jié)果

3.4.7 乙醇體積分數(shù)及用量的選擇

根據(jù)解析率公式計算動態(tài)解析率的結(jié)果選擇70%的乙醇體積分數(shù)對趕黃草總黃酮進行洗脫，并且當洗脫劑用量為3倍保留體積時總黃酮的動態(tài)解析率最大，因此洗脫劑用量需要大于3倍量保留體積，結(jié)果如圖13.

圖13 不同乙醇體積分數(shù)及不同洗脫體積對總黃酮解析率結(jié)果

3.5 驗證試驗

稱取3組預處理后的聚酰胺(60～80目)15 g，將其分別裝柱.稱取3份1 g趕黃草干浸膏用pH值為4的蒸餾水溶解后分別拌樣3 g聚酰胺，晾干后裝入潔凈干燥的柱中，再用pH值為8的70%體積分數(shù)乙醇沖洗210 mL，在60 mL乙醇洗脫后開始收集流分，測定其吸光度并按照標準曲線測定溶液中含總黃酮量，代入解析率公式中計算動態(tài)解析率，根據(jù)所得結(jié)果取平均值為68.82%，RSD值為0.29%，并且純化后的趕黃草浸膏中含總黃酮量增加了14.74%，說明聚酰胺樹脂純化趕黃草中的含總黃酮量穩(wěn)定有效.

4 結(jié) 語

通過本實驗最終確定了回流提取趕黃草中總黃酮的最佳條件以及影響因素：料液比>提取溫度為>乙醇體積分數(shù)>提取時間，四種因素各為1∶15、60 ℃、60%、1 h.在順序中，排在前面兩種影響因素具有顯著影響.超聲提取方法的結(jié)果表明：乙醇的體積分數(shù)>提取時間>料液比>提取溫度，各因素分別為60%，50 min，1∶25和50 ℃.而聚酰胺純化黃酮實驗的結(jié)果是：60～80目聚酰胺樹脂、溶液pH值為4、裝柱比例1∶15、拌樣比例1∶3、洗脫溶劑pH值為8、乙醇體積分數(shù)為70%并且用量大于3倍保留體積.

本次實驗研究不僅進行對兩種提取方法進行了條件優(yōu)化，而且對于聚酰胺純化的條件也進行了篩選，為以后的相關(guān)實驗提供基礎依據(jù).