杜天北，權(quán)茹君，聶承冬，鄧 斌，溫 靜(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，哈爾濱 150076)

結(jié)腸炎是直腸、結(jié)腸黏膜的非特異性炎癥病變，多因自身免疫反應(yīng)、感染、遺傳、精神等因素而引發(fā).其主要癥狀是腹瀉、腹痛、黏液便和膿血便，嚴(yán)重者甚至大便秘結(jié)，并且伴有虛弱、乏力等癥狀，容易反復(fù).槐花丸是一味治風(fēng)劑，具有涼血止血之效，主治腸風(fēng)下血，與現(xiàn)代病癥結(jié)腸炎癥狀相符[1]，選自宋代醫(yī)方《雞峰普濟(jì)方》卷十.方劑由槐花一兩、蒲黃半兩、地榆半兩、卷柏半兩和干姜一分組成，用法是每服一錢，水一盞，煎數(shù)沸，不拘時候服.《滇南本草》中記載槐花“味苦、澀，性寒，功多大腸經(jīng)”，槐花能夠涼血清肝、止血瀉火，具有一定的抗炎作用[2]；《本草匯言》中記載“蒲黃，性涼而利，能潔膀胱之原，清小腸之氣，故小便不通，前人所必用也”，王自梁等[3]發(fā)現(xiàn)了蒲黃具有抗炎活性；根據(jù)《中藥大辭典》記載，地榆具有“涼血止血、清熱解毒”的功效，并且近些年有相關(guān)研究[4]發(fā)現(xiàn)地榆具有一定的抗炎作用；《本草求真》中記載“卷柏，其治有分生熟.生則微寒，力能破血通經(jīng)，故治癥瘕淋結(jié)等癥”，Sunmin等[5]發(fā)現(xiàn)卷柏中的部分炔酚類成分具有良好的抗炎活性；《唐本草》記載干姜“治風(fēng)，下氣，止血，宣諸絡(luò)脈，微汗”，陳琛等[6]用代謝組學(xué)的方法探索了干姜對潰瘍性結(jié)腸炎的作用.綜上，槐花丸是治療結(jié)腸炎的經(jīng)典方劑，但對其方劑的主要作用成分和靶點以及結(jié)腸炎疾病基因之間的關(guān)系探索仍然比較匱乏.

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能夠方便的篩選有效成分，預(yù)測藥物和疾病的靶點，并對相關(guān)信號通路進(jìn)行探索，反映藥物的作用機(jī)制和信號通路，為提高藥物的治療效果和提高藥物開發(fā)與試驗的效率打下基礎(chǔ).中藥復(fù)方的作用機(jī)制比較復(fù)雜，傳統(tǒng)研究方法進(jìn)展較為緩慢，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門新興學(xué)科，其研究方法具有整體、系統(tǒng)、動態(tài)等諸多優(yōu)點，能夠很好的滿足中醫(yī)藥與現(xiàn)代藥理學(xué)靠近的需求[7]，為中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展提供了新的研究方向.

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對槐花丸治療結(jié)腸炎的主要成分、作用靶點及信號通路等方面做了相關(guān)檢索與分析，目的是對槐花丸治療結(jié)腸炎的作用機(jī)制進(jìn)行探索，為其他學(xué)者研究槐花丸及其臨床應(yīng)用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件

本研究涉及到的數(shù)據(jù)庫有TCMSP(https://tcmspw.com/tcmspsearch.php)，ETCM(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php)，PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)，Uniprot(https://www.uniprot.org)，OMIM Entry Search(https://omim.org/)，GeneCards(https://www.genecards.org/)，TTD Database(https://bigd.big.ac.cn/databasecommons/)，MalaCard(https://www.malacards.org/)，Venny 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，STRING (https://string-db.org/)，DAVID Bioinformatics Resources 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)，KEGG Mapper(https://www.genome.jp/kegg/mapper.html)；軟件有ChemOffice2018, Cytoscape 3.7.2

1.2 槐花丸主要成分的篩選

應(yīng)用Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology(TCMSP)和The Encyclopedia of Traditional Chinese Medicine(ETCM)數(shù)據(jù)庫，分別找到槐花、蒲黃、地榆、卷柏和干姜含有的化合物，并以O(shè)B(口服生物利用度)≥30%和DL(藥物相似性)≥0.18 作為條件，在數(shù)據(jù)庫中篩選出主要成分，并對組成槐花丸的藥物的主要成分進(jìn)行補(bǔ)充，最終確認(rèn)槐花丸的主要成分.

1.3 槐花丸主要成分抗炎靶點的篩選

利用TCMSP，ETCM和PubChem數(shù)據(jù)庫分別獲取槐花、蒲黃、地榆、卷柏、干姜中主要成分的作用靶點，然后用Swiss Target Prediction對作用靶點進(jìn)行預(yù)測補(bǔ)充，其中species選擇Homo sapiens(智人)，其余參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)進(jìn)行靶點預(yù)測.將所有主要成分進(jìn)行預(yù)測、篩選和去重之后，使用Uniport數(shù)據(jù)庫對得到的信息進(jìn)行矯正，選擇“Homo sapiens”為條件篩選出人類靶點，最終作為槐花丸主要成分的預(yù)測靶點.本研究主要探索槐花丸對結(jié)腸炎的作用，故以“colitis”為關(guān)鍵詞，在OMIM Entry Search、GeneCards、TTD Database、MalaCards數(shù)據(jù)庫中收集結(jié)腸炎相關(guān)基因，使用Venny 2.1平臺將檢索到的結(jié)腸炎相關(guān)基因與槐花丸主要成分預(yù)測靶點對應(yīng)的基因進(jìn)行映射，繪制韋恩圖，篩選出共同基因，進(jìn)而確認(rèn)槐花丸治療結(jié)腸炎的作用靶點.

1.4 槐花丸治療結(jié)腸炎的作用成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將確定的槐花丸治療結(jié)腸炎的作用靶點與槐花丸主要成分作用靶點取交集，對應(yīng)出槐花丸治療結(jié)腸炎的有效成分，使用Cytoscape (3.7.2) 軟件，導(dǎo)入槐花丸治療結(jié)腸炎的作用成分和治療結(jié)腸炎的作用靶點的數(shù)據(jù)和屬性表格，構(gòu)建“成分-靶點”相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，網(wǎng)絡(luò)圖中的node(節(jié)點)分別表示作用成分和作用靶點.作用成分與作用靶點之間的相互關(guān)系以edge(邊)表示.基于網(wǎng)絡(luò)拓樸學(xué)的原理，選擇Free Degree(網(wǎng)絡(luò)節(jié)點拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)特征值 “自由度”)與最大自由度，篩選出核心網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而篩選出槐花丸治療結(jié)腸炎的活性成分.

1.5 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將篩選得到的槐花丸治療結(jié)腸炎的作用靶點對應(yīng)的基因?qū)隨tring平臺，選擇種屬為Homo sapiens，設(shè)置最低相互作用閾值為最高“Highest confidence”>0.9，其他參數(shù)不變，獲得槐花丸治療結(jié)腸炎的蛋白與蛋白相互關(guān)系網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)，下載為.tsv格式，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2篩選數(shù)據(jù)，并按照“Degree”的大小進(jìn)行排序分類.

1.6 核心靶點富集分析與可視化(GO and KEGG分析)

使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8平臺對槐花丸治療結(jié)腸炎的作用靶點進(jìn)行Gene ontology (GO)和信號通路(KEGG)的富集分析，之后通過Omicshare平臺繪制柱形圖和高級氣泡圖對通路進(jìn)行可視化分析.使用KEGG Mapper做出信號通路(KEGG)熱圖.

2 實驗結(jié)果

2.1 槐花丸主要成分的篩選

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫，以O(shè)B(口服生物利用度)≥30%和DL(藥物相似性)≥0.18 作為條件，在數(shù)據(jù)庫中篩選出槐花、蒲黃、地榆、卷柏和干姜的主要成分，再使用ETCM數(shù)據(jù)庫對組成槐花丸的藥物的主要成分進(jìn)行補(bǔ)充，最終經(jīng)過篩選去重共得到57個主要成分.

2.2 槐花丸主要成分抗炎靶點的篩選

通過TCMSP，ETCM和PubChem數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction對槐花丸57個主要成分的作用靶點進(jìn)行預(yù)測，將所有主要成分進(jìn)行預(yù)測、篩選和去重之后，共得到619個基因靶點.在OMIM Entry Search、GeneCards、TTD Database、MalaCards數(shù)據(jù)庫中收集結(jié)腸炎相關(guān)基因，去重后共得到659個疾病靶點基因，將結(jié)腸炎相關(guān)基因與槐花丸靶點基因進(jìn)行映射，繪制韋恩圖，見圖1，得到共同靶點110個，確定為槐花丸治療結(jié)腸炎的靶點基因,部分靶點信息見表1.

圖1 成分靶點-疾病靶點映射韋恩圖

Table 1 Common targets of drug component-disease

2.3 槐花丸治療結(jié)腸炎的作用成分-作用靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

以110個結(jié)腸炎靶點基因作為槐花丸治療結(jié)腸炎的作用靶點，對應(yīng)出槐花丸治療結(jié)腸炎的作用成分54個.建立槐花丸作用成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，見圖2.共有164個節(jié)點，26732條邊，其中54個綠色節(jié)點代表槐花丸治療結(jié)腸炎的有效成分，110個黃色節(jié)點代表結(jié)腸炎疾病靶點，26732條邊代表槐花丸治療結(jié)腸炎的作用成分與作用靶點的相互作用.根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓樸學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)得到化合物的中位度數(shù)為9，篩選出度值(Degree)> 9的26個化合物，這些化合物是槐花丸治療結(jié)腸炎的活性成分.見表2.

圖2 槐花丸治療結(jié)腸炎作用成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

圖3 槐花丸治療結(jié)腸炎的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

槐花丸治療結(jié)腸炎的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)見圖3，將數(shù)據(jù)下載為.tsv格式，導(dǎo)入Cytoscape3.7.2篩選，按照“Degree”的大小進(jìn)行排序分類，條件設(shè)置為Degree >8，共篩選出46個靶點，部分核心靶點及拓?fù)鋮?shù)見表3，這些蛋白作用較強(qiáng)，在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用.

表2 槐花丸治療結(jié)腸炎的活性成分

表3 核心靶點及拓?fù)鋮?shù)

2.5 核心靶點富集分析與可視化(GO and KEGG分析)

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對槐花丸治療結(jié)腸炎的核心靶點進(jìn)行GO分析和KEGG分析，根據(jù)FDR<0.05，篩選出BP Bioprogress(細(xì)胞生物過程.如：粘附、遷移、凋亡、周期等)310個，CC cell components(細(xì)胞組成.如：細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)等)27個，MF Molicular Function(分子功能)73個，Pathway 91條，根據(jù)Count進(jìn)行排序，每種取前10個，見圖4，分析結(jié)果中細(xì)胞生物過程富集的基因數(shù)最多，F(xiàn)DR值較低，說明槐花丸主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生物過程(如：粘附、遷移、凋亡、周期等)治療結(jié)腸炎.對91條Pathway進(jìn)行KEGG分析，其中包括Hepatitis B、TNF signaling pathway、Rheumatoid arthritis和Inflammatory mediator regulation of TRP channels等多條抗炎通路，根據(jù)靶標(biāo)命中數(shù)量排序?qū)?1條通路進(jìn)行分析，做可視化處理，得到圖5.

圖4 槐花丸的GO分析

圖5 槐花丸的KEGG分析

2.6 通路分析

根據(jù)KEGG通路分析，91條通路均與結(jié)腸炎有關(guān)，Hepatitis B通路共有12個靶基因；TNF signaling pathway通 路 共 有 11個靶 基 因；Rheumatoid arthritis通 路共有5個靶 基 因、Inflammatory mediator regulation of TRP channels通 路共有5個靶 基 因等.從數(shù)據(jù)可以看出槐花丸可能還對Proteoglycans in cancer、Prolactin signaling pathway、Toxoplasmosis等有作用，見圖6，通路-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò).槐花丸和Hepatitis B信號通路的靶點表示圖，見圖7.

圖6 槐花丸通路-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖7 槐花丸和Hepatitis B信號通路的相關(guān)靶點表示圖

3 討 論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究槐花丸治療結(jié)腸炎的作用機(jī)制.通過以上技術(shù)得到槐花丸的54個主要成分，運用網(wǎng)絡(luò)拓樸學(xué)的方法，篩選出26個(Apigenin、Isocryptomerin、Arachidonic acid、Kaempferol、Sexangularetin、Isorhamnetin、Quercetin等)抗炎活性較好的活性成分，其可能作用于STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、TNF和VEGFA等關(guān)鍵靶點，并參與91條信號通路；其中Hepatitis B信號通路與槐花丸治療結(jié)腸炎作用有密切聯(lián)系.

本研究篩選出來的活性成分中，芹菜素(Apigenin)、異柳杉素(Isocryptomerin)、山奈酚(Kaempferol)等黃酮類化合物已經(jīng)被相關(guān)文獻(xiàn)證實具有抗炎活性，其中，劉琴等[8]通過分析促炎細(xì)胞因子(iNOS、COX-2和AP-1)的表達(dá)，確定芹菜素(Apigenin)能顯著抑制促炎細(xì)胞因子和AP-1蛋白的表達(dá)，包括一氧化氮的產(chǎn)生，證實了芹菜素的抗炎作用；張雅雯等[9]發(fā)現(xiàn)山奈酚(Kaempferol)具有抗炎作用.李林蔓等[10]發(fā)現(xiàn)槲皮素(Quercetin)可通過提高Treg細(xì)胞分化、降低Th17細(xì)胞分化進(jìn)而恢復(fù)Th17/Treg平衡以及提高HO-1的表達(dá)水平和活性，從而改善急性喉炎模型大鼠喉部組織的炎性.柳澤深等[11]發(fā)現(xiàn)花生四烯酸(Arachidonic acid)可通過影響膜受體活性調(diào)節(jié)基因表達(dá)；Li等[12]發(fā)現(xiàn)Isorhamnetin可抑制OGD與MGO對于人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用，該保護(hù)作用與其抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡機(jī)制有關(guān).郭麗等[13]發(fā)現(xiàn)銀杏雙黃酮(Ginkgetin)對高糖刺激HMEC炎癥反應(yīng)有明顯的干預(yù)作用,其機(jī)制可能與抑制NF-kB信號通路活化,從而降低炎癥反應(yīng)水平有關(guān)；Liu等[14]發(fā)現(xiàn)銀杏雙黃酮(Ginkgetin)可減輕炎癥，氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡；曹園等[15]發(fā)現(xiàn)Tamariscina ester顯示出對氟康唑、酮康唑的抗念珠菌活性的體外增效作用.Tanaka等[16]發(fā)現(xiàn)3-O-galloylprocyanidin B-3具有止血作用[17-20].

綜上所述，槐花丸中含有的黃酮類成分可能是其治療結(jié)腸炎的主要有效成分，分別與STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、TNF、VEGFA等靶點相關(guān)聯(lián)起到治療作用，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和網(wǎng)絡(luò)拓樸學(xué)的方法，總結(jié)了槐花丸治療結(jié)腸炎的主要成分、主要作用成分、活性成分、核心靶點及信號通路.通過繪制藥物成分-疾病靶點網(wǎng)絡(luò)、藥物蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)等多條途徑，對槐花丸治療結(jié)腸炎的作用機(jī)制進(jìn)行了研究和初探，為其他研究提供了線索和材料，其實際作用機(jī)制還有待進(jìn)一步實驗驗證.