董小君，甘 媛，蔡明星，夏修文，陳橋橋,3，丁 斗,**

(1.遵義醫(yī)藥高等?？茖W校 中醫(yī)學系，貴州 遵義 563006;2.成都中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院，四川 成都 610075;3.內江衛(wèi)生與健康職業(yè)學院 基礎醫(yī)學部，四川 內江 641000)

ENS(Enteric nervous system, ENS)是位于腸壁的內在神經(jīng)，由腸系膜和黏膜下神經(jīng)叢兩個網(wǎng)絡組成，被認為是自主神經(jīng)系統(tǒng)除交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)外的第三部分。黏膜下神經(jīng)叢中的神經(jīng)回路負責協(xié)調腸道分泌物；而腸系膜神經(jīng)叢主要負責協(xié)調腸平滑肌的收縮和松弛，這些收縮和松弛涉及腸道運動模式。胃腸功能的適當調整要求兩個神經(jīng)叢保持完整，并與靶細胞保持健康的相互作用[1]。腸道運動反射包括調節(jié)胃排空，腸道傳輸速率[2]和促進營養(yǎng)吸收的消化生理過程，均由ENS神經(jīng)元調節(jié)。ENS可通過釋放相應的神經(jīng)遞質來影響興奮性和抑制性神經(jīng)元，控制腸道平滑肌的收縮和放松，幫助腸道吸收和消化營養(yǎng)物質。國外研究表明，飲食不均衡且熱量過多參與ENS的改變，導致肥胖發(fā)生。肥胖在中醫(yī)上屬虛實夾雜、本虛標實之證，實者主責之痰，虛者主責之脾[3]。采用益氣祛痰針法，可以振奮脾陽，升清降濁，除濕化痰，達健脾益氣、祛痰除濕之效，提高脾胃運化功能，積極調動臟腑各組織器官協(xié)調運作，減少痰濕脂膏積聚，促進脂質代謝，降脂減肥[4]。以往的研究主要集中在單純電針改善腸道運動的中樞和外周神經(jīng)通路的作用上，對ENS的作用和機制還沒有深入的研究。本實驗將研究益氣祛痰針法如何整體調控肥胖小鼠ENS，影響腸道的運動和消化吸收。

1 材 料

1.1 實驗動物

8周齡SPF級C57BL/6J雄性小鼠90只，體重(21.09±0.72)g，購自成都達碩實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(川)2015-030。本實驗方案通過成都中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會批準，遵循實驗動物倫理委員會指導原則。

1.2 材料和儀器

南京建成生物工程研究所提供的總膽固醇(CHO)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒、HDL-C試劑盒和LDL-C試劑盒(批號：20181009)，5-HT試劑盒、P物質試劑盒、VIP試劑盒(批號：20181203)，BLUEGREN公司提供的瘦素(LP)試劑盒(批號：E03A0038)、脂聯(lián)素(ADPN)試劑盒(批號：E03A0125)，華佗牌G6805-Ⅲ型電針儀、一次性針灸針(蘇州天協(xié)針灸器械有限公司)、轉輪式切片機(徠卡-2016，德國)、TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機(常州市中威電子儀器有限公司)、BMJ-Ⅲ型包埋機(常州郊區(qū)中威電子儀器廠)、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)、數(shù)碼三目攝像顯微鏡(BA400Digital，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)、圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0(美國Media Cybernetics公司)等。

2 治療方法

2.1 造模方法

90只C57BL/6J實驗小鼠置于成都中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院實驗中心動物房內進行飼養(yǎng)，恒定溫度為(23±2)℃，相對濕度為(50±2)%。光照-黑暗周期各半，8:00～20:00開燈，20:00～8:00關燈。小鼠每籠5只，采取自由獲取食物和水的方式。用高脂飼料喂養(yǎng)10周，配方為豬油32 %，酪蛋白26 %，麥芽糖糊精16 %，蔗糖9 %，纖維素6 %，其他11 %，購買于北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證編號：SCXK(京2014—0008)。每周定期測量小鼠的體重和體長，第8周開始評價模型，篩出體重大于同時間點正常組體重的20 %，且Lee's指數(shù)大于正常組平均Lee's指數(shù)20 %的肥胖小鼠40只，造模成功率約為 51.30 %。隨機分為模型組、電針治療14 d組、電針治療21 d和電針治療28 d組。

2.2 分組及干預方法

造模成功后在未做任何處理的12只正常小鼠中，隨機選取10只作為空白對照組(N組)，將40只肥胖小鼠隨機分為模型組(M組)、電針干預14 d組(A 14組)、電針干預21 d組(A 21組)和電針干預28 d組(A 28組)，每組10只動物。電針干預組(A 14、A 21和A 28)所選穴位參照余曙光、郭義主編的2016版《實驗針灸學》，斜刺天樞3 mm，斜刺關元3 mm，直刺足三里3 mm，直刺三陰交3 mm，行益氣祛痰針法，得氣后，接通華佗牌G6805-Ⅲ型電針儀，選擇疏密波，強度2 mA，以局部輕微抖動為度，留針10 min，每日1次，左右交替取穴，正常組與模型組以相同方式固定10 min，不予針刺干預。

2.3 指標檢測

2.3.1 益氣祛痰針法對實驗小鼠體重、Lee's指數(shù)、血脂和肥胖因子的影響

每周定期測量體重和體長，依公式計算Lee's指數(shù)：體重(1/3)×1 000/體長。干預結束后，禁食不禁水8 h以上，采用摘眼球取血，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清CHO、TG、LP和ADPN含量，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

2.3.2 益氣祛痰針法對實驗小鼠小腸傳輸率(ITR%)的影響

制備出5 % 濃度的活性炭阿拉伯明膠懸混液，以0.01 mL/g體重的劑量進行灌胃。活性炭懸混液給藥30 min后處死實驗小鼠。通過活性炭在腸中遷移的長度，從幽門到其最遠端的距離來測量小腸傳輸能力。用活性炭的移動距離占小腸總長度的百分比來估算ITR%值。ITR%=碳末從幽門傳輸其最遠端距離(cm)/小腸總長度(cm)×100 %。

2.3.3 益氣祛痰針法對實驗小鼠腸神經(jīng)HE病理的影響

固定小腸經(jīng)全自動脫水機脫水，包埋，切片后如下操作：切片脫蠟至水，蘇木精染色10 min～20 min，自來水沖洗1 min～3 min，鹽酸酒精分化5 s～10 s，自來水沖洗1 min～3 min，放入50 ℃的溫水中或弱堿性水溶液返藍，直到出現(xiàn)藍色為止，自來水沖洗1 min～3 min，放入85 %的酒精3 min～5 min，伊紅染色3 min～5 min，水洗3 s～5 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，以上標本均按病理檢驗SOP程序進行。脫水、修剪、包埋、切片、染色、封片等，最后鏡檢。

2.3.4 益氣祛痰針法對實驗小鼠空腸組織SP、5-HT和VIP含量影響

干預結束后，禁食不禁水8 h以上，無菌條件下打開腹腔，理出小腸?？漳c組織勻漿后用ELISA法檢測空腸組織中的5-HT、VIP和P物質的含量。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結 果

3.1 益氣祛痰針法對實驗小鼠體重和Lee's指數(shù)的影響

采用益氣祛痰針法電針干預后，益氣祛痰針法干預各組體重均值都極顯著低于肥胖模型組(P<0.001)。益氣祛痰針法干預各組比較，A 21組體重均值極顯著低于A 14組(P<0.001)，A 28組體重均值顯著低于A 14組(P<0.01)。Lee's指數(shù)可以衡量肥胖程度，與普通飲食組比較，肥胖模型組的指數(shù)最高，有極顯著性差異(P<0.001)。經(jīng)干預后，益氣祛痰針法各組的Lee's指數(shù)與肥胖模型組相比都出現(xiàn)極顯著性下降(P<0.001)。干預的不同時間所對應的Lee's指數(shù)具有統(tǒng)計學差異，與干預14 d比較，益氣祛痰針法干預21 d和28 d的指數(shù)顯著下降(P<0.01)。見表1。

表1 益氣祛痰針法對各組實驗小鼠Lee's指數(shù)的影響

3.2 益氣祛痰針法對實驗小鼠血脂和肥胖因子的影響

如圖1(A)所示，M組血脂四項中的CHO和TG含量極顯著高于N組(P<0.001)，但肥胖模型實驗鼠的HDL-C含量極顯著低于普通飲食實驗鼠(P<0.001)。經(jīng)益氣祛痰針法干預后，與M組相比，干預各組的CHO明顯降低(P<0.01)，干預各組的TG下降尤為明顯，具有極顯著性差異(P<0.001)，且益氣祛痰針法干預21 d和28 d與干預14 d比較，差異具有統(tǒng)計學意義。血脂中的HDL-C經(jīng)益氣祛痰針法干預后，只有A 21組和A 28組的含量上升，與M組相比有極顯著性差異(P<0.01)，各干預組組間與A 14組比較，僅A 21組出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05)。

血清瘦素如圖1(B)所示，與N組比較，M組血清含量顯著性升高(P<0.001)。經(jīng)電針干預后，和M組對比，益氣祛痰針法各組血清含量均降低，A 14有極顯著性差異(P<0.01)，而A 21組和A 28組的干預差異更明顯(P<0.001)。

血清脂聯(lián)素方面圖1(C)，與N組比較，M組血清含量最低，有顯著性差異(P<0.001)。經(jīng)益氣祛痰針法干預后，電針干預各組血清含量逐漸上升，和M組相比有極顯著性差異(P<0.001)，并呈時間干預依賴性，與A 14組比較，A 21組和A 28組的血清含量上升有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖1 各組實驗小鼠血脂和脂肪因子含量

3.3 益氣祛痰針法對實驗小鼠ITR的影響

如圖2所示，普通飲食組實驗小鼠ITR(86.46±3.17)最快，與肥胖模型組(65.03±4.71)相比有極顯著性差異(P<0.001)。益氣祛痰針法治療后，各電針干預組的ITR增快，與肥胖模型組比較，有極顯著性差異(P<0.001)。益氣祛痰針法干預21 d(76.79±2.57)和28 d(77.28±3.66)，同干預14 d(72.98±4.55)比較，具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

圖2 各組實驗小鼠小腸傳輸率(ITR%)

3.4 益氣祛痰針法對實驗小鼠腸神經(jīng)病理HE病理的影響

如圖3(A)所示，普通飲食組實驗小鼠的神經(jīng)纖維肌層肌纖維排列整齊，在腸壁肌層環(huán)肌和縱肌之間可見大量的神經(jīng)纖維，神經(jīng)纖維排列致密，肌層之間未見明顯的間隙，神經(jīng)纖維相對肌層組織透光度較強，著色偏淺，神經(jīng)纖維未見明顯的病理變化。肥胖模型實驗小鼠肌纖維水腫、變性，排列紊亂，透光度增強，細胞核碎裂或溶解消失，橫肌和縱肌分界不明顯，神經(jīng)纖維結構不清晰，神經(jīng)細胞數(shù)量減少，纖維排列紊亂，神經(jīng)細胞核大小不一，形態(tài)不規(guī)則。益氣祛痰干預各組神經(jīng)纖維出現(xiàn)局灶性的病變，局灶性神經(jīng)纖維水腫，間隙增寬，神經(jīng)細胞核固縮，嗜堿性增強，正常部位神經(jīng)纖維排列致密，細胞核著色偏淺。通過4級評分法定性腸神經(jīng)確定病理評分，如圖3(B)所示，(1)輕微(+)：記1分，少量神經(jīng)細胞水腫和變性；(2)輕度(++)：記2分，局灶性神經(jīng)纖維水腫，間歇性變寬；(3)中度(+++)：記3分，神經(jīng)纖維水腫，排列紊亂，細胞核結構變化和細胞形態(tài)改變；(4)嚴重(++++)：記4分，神經(jīng)纖維結構不清楚，神經(jīng)細胞數(shù)量減少，細胞核大小不同，細胞形態(tài)不規(guī)則。肥胖模型組腸神經(jīng)病理評分最高，與普通飲食組相比，均有極顯著差異(P<0.001)。通過益氣祛痰針法干預后，與肥胖模型組相比，各電針干預組的病理評分下降，有顯著或極顯著差異(P<0.05或P<0.01)。

圖3 各組實驗小鼠空腸神經(jīng)HE染色

3.5 益氣祛痰針法對實驗小鼠空腸神經(jīng)遞質含量的影響

如圖4所示，空腸組織里的P物質(SP)和五羥色胺(5-HT)含量在M組中最低，和N組比較，有極顯著差異(P<0.001)。益氣祛痰針法干預后，和M組比較，各電針干預組的空腸SP和5-HT含量有不同程度的提高，有極顯著性差異(P<0.001或P<0.01)。各益氣祛痰針法干預組組間比較，僅A 28組的空腸SP含量相對A 14組比較有極顯著性差異(P<0.01)?？漳c組織里的血管活性P物質(VIP)含量在M組中最高，和N組比較，有極顯著性差異(P<0.001)。空腸組織里的VIP含量，肥胖抵抗小鼠明顯低于肥胖模型小鼠，相比較有極顯著差異(P<0.001)。益氣祛痰針法干預后，和M組比較，各電針干預組的空腸VIP含量隨干預時間逐步降低，有極顯著性差異(P<0.001和P<0.05)。

圖4 各組實驗小鼠空腸神經(jīng)遞質含量

4 討 論

實驗結果表明，益氣祛痰針法在刺激關元、足三里、天樞和三陰交穴后，可提高腸胃運動功能并有可能改善ENS損害。ENS中的興奮性和抑制性神經(jīng)元協(xié)調腸道的收縮和舒張功能，提高腸道傳輸率，降低肥胖模型小鼠的體重和脂肪含量。ENS神經(jīng)元將信號傳遞至興奮性運動神經(jīng)元，導致P物質和5-HT釋放，引起腸道肌肉收縮。ENS神經(jīng)元將信號傳遞至抑制性運動神經(jīng)元，釋放VIP，從而引起腸道肌肉松弛。營養(yǎng)物質長時間停留在小腸，加重ENS負擔，增強小腸吸收。益氣祛痰針法對關元、足三里、天樞和三陰交刺激影響了腸神經(jīng)元的功能，恢復了腸道收縮肌和松弛肌之間的協(xié)調性并修復了受損的ENS，從而改善了胃腸動力。

ENS是一個大而復雜的周圍神經(jīng)系統(tǒng)，整合調控腸道內分泌、免疫、腸道菌群等，廣泛控制腸道結構重塑與功能[5]。進食后，食糜引起的機械變形和腸腔化學的改變激活了相互聯(lián)系的內在感覺神經(jīng)元和機械敏感腸神經(jīng)元網(wǎng)絡[6]，產(chǎn)生的動作電位被傳導至與內在感覺神經(jīng)元的突觸連接至中間神經(jīng)元以及神經(jīng)支配肌肉的興奮性或抑制性運動神經(jīng)元[7]。ENS可通過釋放相應的神經(jīng)遞質來控制興奮性和抑制性神經(jīng)元，控制腸道平滑肌的收縮和放松，幫助腸道吸收和消化營養(yǎng)物質，影響機體的消化吸收，直接參與肥胖的發(fā)病。國外研究表明，飲食不均衡且熱量過多參與ENS的改變，導致肥胖發(fā)生[8]。實驗模型表明，長期攝入高脂飲食會導致肌腸神經(jīng)元和Cajal間質細胞的功能和結構損傷，與肥胖小鼠肌間神經(jīng)叢的神經(jīng)病變相關，破壞神經(jīng)回路，引起腸道運動障礙癥狀[9]。

大量研究發(fā)現(xiàn)，針刺治療肥胖不僅是多途徑多靶點作用，而且還直接作用于神經(jīng)系統(tǒng)，如電針可上調肥胖大鼠抑食肽α-MSH和CART，下調促食肽NPY[10]，通過電針天樞、三陰交等穴位，能降低下丘腦TSC1啟動子甲基化程度，引起體重下降[11]。天樞穴淺層分布于第9～11胸神經(jīng)前支的外側皮支和前皮支。關元通過調控下丘腦β-內啡肽與強啡肽含量而達到鎮(zhèn)痛作用。足三里上理胃脘脹、中理腹部不適、下理小腹病痛，通過系統(tǒng)調節(jié)神經(jīng)功能而調節(jié)胃腸動力、增進食欲、幫助消化。三陰交平衡皮質、皮質下邊緣系統(tǒng)和小腦疼痛腦區(qū)活性，啟動5-羥色胺、阿片肽等鎮(zhèn)痛物質釋放，全面調整大腦皮層的興奮狀態(tài)，緩解疼痛與緊張情緒[12]。中醫(yī)學認為，肥胖的病因，多責之于脾胃功能失調形成痰濕，《黃帝內經(jīng)》云:“諸濕腫滿，皆屬于脾”。因形體肥胖之人，多嗜膏粱厚味，酒食無度，損傷脾胃。一旦脾氣虛弱，失于散布精氣，則必然導致津液輸布異常[13]，氣虛而痰濕生。若腎氣不足則無法溫養(yǎng)脾土，致使脾失健運，水谷精微積滯，形成膏脂[14]。馮楚瞻在《馮氏錦囊秘錄》曰：“雖然人但知痰之標在脾，而不知痰之本更在于腎。蓋痰者水也，有腎虛不能制水，水泛為痰，是無火制痰，痰清而稀，脾、腎皆可導致痰濕為患”[15]。依據(jù)《靈樞·經(jīng)脈》：“盛則瀉之，虛則補之”原則，遵循《石室秘錄》中“治肥人之病也。肥人多痰，乃氣虛也。虛則氣不能運行，故痰生之。則治痰焉可僅治痰哉，必須補其氣，而后帶消其痰為得耳”的方法，采用益氣祛痰針法，達健脾祛痰之效，恢復陰平陽秘的狀態(tài)。