吳凡 梁爽 彭龍 蘇宇清 梁延連 莊乃保

Rh血型系統(tǒng)是人類最復(fù)雜的血型系統(tǒng)。在臨床輸血中，Rh血型系統(tǒng)的重要性僅次于ABO血型系統(tǒng)。其中D抗原具有很強(qiáng)的免疫原性，是Rh血型系統(tǒng)中最主要的抗原。臨床上根據(jù)個(gè)體是否存在RhD抗原分為RhD陽(yáng)性和RhD陰性。大部分個(gè)體的RhD抗原采用直接試管法即可檢出。少部分用直接試管法檢測(cè)為陰性，通過(guò)間接抗人球蛋白試驗(yàn)才可檢出，這些個(gè)體為血清學(xué)弱D表型或RhD變異型（包括弱D、一些部分D等）。我們收集38例直接試管法檢測(cè)陰性，微柱凝膠卡間接抗人球蛋白法檢測(cè)陽(yáng)性的血清學(xué)弱D表型獻(xiàn)血者血液樣本進(jìn)行RhCcEe表型與RHD基因型分析，研究深圳地區(qū)血清學(xué)弱D表型獻(xiàn)血者RHD基因多態(tài)性。報(bào)道如下。

材料與方法

1 一般資料 篩選2019年4月～2021年2月深圳市血液中心85 862名首次獻(xiàn)血者中直接試管法檢測(cè)RhD陰性樣本，血樣于靜脈采集5 mL，4 ℃保存于EDTA抗凝管中。

2 試劑與儀器 抗-D IgM+IgG血型定型試劑（批號(hào)：517178）為加拿大Dominion公司產(chǎn)品；anti-D（批號(hào)：BMI1804B）為英國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；抗-D單克隆IgG抗體、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e單克隆IgM抗體血型定型試劑、抗IgG，C3d抗人球蛋白檢測(cè)試劑（批號(hào)分別為：20190826、20193001、20193101、20193202、20183302、20195001）為上海血液生物公司產(chǎn)品；樣本稀釋液（ID-Diluent 2，批號(hào)：057610001）和微柱凝膠低離子抗人球蛋白卡（LISS/Coombs，批號(hào)：50531.48.17）均為美國(guó)Bio-rad 公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒（Blood DNA Purification Kit，批號(hào)：106412）為美國(guó)Promega 公司產(chǎn)品；人類紅細(xì)胞RhD血型變異體基因分型試劑盒（批號(hào)：K202005004）為天津秀鵬公司產(chǎn)品。KA-2 2 0 0免疫血液學(xué)用離心機(jī)為日本KUBOTA公司產(chǎn)品；ID-Incubator 37 SI保溫箱和ID-Centrifuge 12 SII臺(tái)式離心機(jī)均為瑞士Diamed AG公司產(chǎn)品；MAXWELL 16 DNA提取儀為美國(guó)Promega 公司產(chǎn)品；ProFlex PCR System為美國(guó)Life technologies公司產(chǎn)品； EP-1 0 1 9電泳儀為美國(guó)Embitec公司產(chǎn)品；FluorChem R 多功能成像分析系統(tǒng)為美國(guó)ProteinSimple公司產(chǎn)品。

3 方法

2.2.6.3 發(fā)病條件。土壤溫度和含水量是影響光葉紫花苕斑枯病2個(gè)主要的環(huán)境因素。該病的最適生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃。春旱、秋澇，發(fā)病較嚴(yán)重。

4RHD基因外顯子測(cè)序分析 對(duì)5例PCR-SSP法無(wú)法識(shí)別RhD變異型的樣本進(jìn)行RHD基因的所有外顯子測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，其分別為R H D*w e a kD type 95（c.730G＞C，p.Ala244 Pro）；RHD*D C C（c.6 7 7 C＞A，p.A l a 2 2 6 A s p）；R H D*DFR 1（c.5 0 5A＞C、c.5 0 9T＞G、c.5 1 4A＞T，p.Met 1 6 9Leu、p.Met 1 7 0Arg、p.Ile 1 7 2Phe）；RHD*weak D type 50（c.727T＞A，p.Tyr243 Asn）以及RHD*IVS9-1C（c.1228-1G＞C）（表2）。其中RHD*weak D type 50在中國(guó)漢族人群中首次發(fā)現(xiàn)。RHD*IVS9-1C為RHD基因第9內(nèi)含子-1位的純合突變（c.1228-1G＞C）尚未被ISBT（International Society of Blood Transfusion，國(guó)際輸血協(xié)會(huì)）數(shù)據(jù)庫(kù)收錄。該等位基因的序列數(shù)據(jù)已提交GenBank，登記號(hào)為MT755965。另外RHD*weak partial 15 /RHD*DEL1雜合型經(jīng)測(cè)序再次確認(rèn)（圖3）。5RHD雜合型分析 38例樣本中37例樣本可檢出Rh融合盒子，1例RHD*weak partial 15/RHD*DEL1雜合型樣本未能檢測(cè)出Rh融合盒子（圖4，表2）。

在處理城市精明增長(zhǎng)與蔓延發(fā)展的關(guān)系時(shí)，最重要的就是把握城市建設(shè)發(fā)展中二者的“度”，從而更好地實(shí)現(xiàn)城市可持續(xù)發(fā)展。下文筆者繼續(xù)從城市規(guī)模角度入手，列舉正確把握精明增長(zhǎng)與蔓延發(fā)展關(guān)系的相關(guān)建議：

3.2 基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及RHD基因檢測(cè)：取300 μL全血加入Blood DNA Purification Kit DNA提取試劑盒樣本槽中，采用MAXWELL 16 DNA提取儀自動(dòng)化提取全血DNA。每份DNA 溶于300 μL DNA buffer。測(cè)定所提取的DNA 濃度，低于2 ng/μL的DNA不能用于以下實(shí)驗(yàn)。使用人類紅細(xì)胞RhD基因分型試劑盒，采用聚合酶鏈反應(yīng)-序列特異性引物技術(shù)（PCR-SSP）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：96℃預(yù)變性2 min ；然后96 ℃變性20 s，68 ℃退火1 min，循環(huán)5次；96 ℃變性20s，65 ℃退火50 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)10次；96 ℃變性20 s，62 ℃退火50 s，72℃延伸45 s，循環(huán)18次；最后72 ℃延伸5 min，降溫至4 ℃完成擴(kuò)增。2.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)。采用Kendall's tau-b相關(guān)分析，比較RhD變異型與RhCcEe表型的相關(guān)性，計(jì)算相關(guān)系數(shù)，分析探討是否存在相關(guān)以及相關(guān)的方向。Kendall's tau-b相關(guān)系數(shù)取值范圍在[-1,+1]，負(fù)值代表負(fù)相關(guān)，正值代表正相關(guān)，0則代表不存在相關(guān)關(guān)系。以P＜0.05為顯著相關(guān)。

表1 RHD基因編碼區(qū)擴(kuò)增和測(cè)序反應(yīng)引物

3.3RHD基因外顯子測(cè)序及RHD雜合型分析：測(cè)定RHD基因的10個(gè)外顯子序列，擴(kuò)增及測(cè)序引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[1]，引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系為（20 μL）：DNA 1 μL、上下游引物（10 μM）各1 μL、高保真酶MIX 10 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min； 95 ℃變性40 s，62 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)40次；最后72 ℃延伸5 min，降溫至4 ℃完成擴(kuò)增。引物合成和測(cè)序均由廣州艾基生物技術(shù)有限公司完成，將測(cè)序結(jié)果與參比序列Genebank BN000065進(jìn)行比對(duì)。特異性擴(kuò)增Rh融合盒子，判斷檢測(cè)樣本是否存在RHD基因的缺失，由天津秀鵬生物技術(shù)有限公司完成。

寄生蟲侵入宿主機(jī)體后首先表現(xiàn)IgM上升，IgM是一種大分子抗體，相對(duì)分子質(zhì)量最大，故稱之為巨球蛋白，IgM能清除血流中的原蟲顆粒，為一種凝集性抗體，是直接、間接凝集實(shí)驗(yàn)的診斷要素。張永紅等[12]在小鼠腹腔接種棘球蚴原頭節(jié)后，在未發(fā)育形成囊泡前30 d能測(cè)到低效價(jià)的IgM血清抗體，90 d后隨著囊泡不斷長(zhǎng)大，IgM開始降低。本研究中HAE患者血清IgM抗體較正常對(duì)照組降低，考慮包蟲在宿主體內(nèi)長(zhǎng)期寄生，宿主的免疫抑制，導(dǎo)致IgM下降。

結(jié) 果

1992 年，RHD基因的cDNA被克隆[2]，隨后的十幾年里，從基因結(jié)構(gòu)與功能方面探索RhD血型的研究進(jìn)展迅速，特別是各地區(qū)人群RHD基因多態(tài)性的研究[3-7]為RHD等位基因的核苷酸序列提供了豐富的信息。根據(jù)國(guó)際輸血協(xié)會(huì)（ISBT）等位基因命名表，目前已確認(rèn)的RhD變異型等位基因有3 0 0多種[8]，其中我國(guó)已發(fā)現(xiàn)有64種[9]。RHD*weak partial 15、RHD*DVI.3、RHD*DEL1是我國(guó)漢族人群中主要的RhD變異型等位基因[9]。RHD*weak partial 15約占RhD變異型的22.7%[10]，其變異位置在RHD基因第6外顯子、第9跨膜區(qū)（c.845G＞A，p.Gly282Asp），其突變可能影響了膜的整合，進(jìn)而影響RhD蛋白和D抗原的合成表達(dá)。RHD*DVI.3是RHD基因第3～6外顯子被RHCE基因相應(yīng)的部分替換形成的雜交基因（RHD-RHCE(3-6)-RHD），約占RhD變異型的.7%[10]。RHD*weak partial 15和RHD*DVI.3可通過(guò)間接抗人球蛋白法檢出。DEL型個(gè)體RhD抗原的表達(dá)明顯下降，血清學(xué)方法一般只能通過(guò)吸收放散實(shí)驗(yàn)才能檢出。但吸收放散實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，并不作為常規(guī)檢測(cè)方法，國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)明確診斷DEL型的標(biāo)準(zhǔn)，大部分實(shí)驗(yàn)室常常將DEL型標(biāo)記為RhD陰性。中國(guó)漢族人的RhD陰性率為0.34%[11]。綜合近年來(lái)相關(guān)文獻(xiàn)，DEL型在我國(guó)漢族RhD陰性個(gè)體的比率約為30%[11-13]。中國(guó)人群兩項(xiàng)具有大樣本的綜合性遺傳研究顯示[13-14]，95.4%（436/457）具有DEL表型的中國(guó)個(gè)體為RHD*DEL1。RHD*DEL1是RHD基因第9外顯子末位1處堿基同義突變（1227G＞A，K409K），導(dǎo)致RNA轉(zhuǎn)錄后在內(nèi)含子剪切時(shí)，第9內(nèi)含子的識(shí)別位點(diǎn)“左”移至第8內(nèi)含子，由此將“第8內(nèi)含子+第9外顯子+第9內(nèi)含子”一起識(shí)別為一個(gè)“超大”內(nèi)含子，“總是”被錯(cuò)誤剪切，因此不能表達(dá)正常的RhD蛋白。隨著商業(yè)化抗體試劑效價(jià)和靈敏度的提高，一些抗原表達(dá)量較高的DEL型也可用間接抗人球蛋白法檢出弱陽(yáng)性。本研究PCR-SSP法所采用的檢測(cè)試劑盒通過(guò)中國(guó)人群常見的RhD變異型設(shè)計(jì)，可初步篩查包括RHD*weak partial 15、RHD*DVI.3、RHD*DEL1在內(nèi)的16種RhD變異型。RHD基因的兩端存在兩個(gè)具有98.6%同源性的區(qū)域，即Rh盒子序列。當(dāng)RHD基因全缺失時(shí)，兩端Rh盒子融合為融合盒子。若樣本可檢出融合盒子，說(shuō)明至少存在一條染色體RHD基因全缺失。本研究38例樣本中，1例RHD*weak partial 15/RHD*DEL1雜合型樣本未能檢測(cè)出Rh融合盒子，說(shuō)明其不存在RHD基因全缺失。其余37例樣本均可檢出Rh融合盒子，可推測(cè)其一條染色體存在RhD變異型基因，另一條染色體為RHD基因全缺失。

2 PCR擴(kuò)增及RHD基因檢測(cè)（PCR-SSP法） 利用PCR-SSP方法分析RHD基因編碼區(qū)，3 8例樣本中15例為RHD*weak partial 15（15/38，39.5%）；1 1例為R H D*D E L 1（1 1/3 8，2 8.9%）；5例為RHD*DVI.3（5/38,13.2%）；1例為RHD*weak D type 61（1/38，2.6%）；1例為RHD*weak partial 15/ RHD*DEL1雜合（1/38，2.6%）；5例采用PCRSSP法未能確認(rèn)RhD變異型（5/38,13.2%）（圖1，表2）。

目前，慈王村發(fā)展散養(yǎng)珍珠草雞產(chǎn)業(yè)的主要威脅：在冬天，茶園、農(nóng)家樂(lè)處于淡季，散養(yǎng)雞的銷售量也有所下降，這種依賴于其他產(chǎn)業(yè)發(fā)展的銷售模式存在被動(dòng)性，擴(kuò)展銷路刻不容緩。

圖1 RHD基因檢測(cè)（PCR-SSP法）結(jié)果

3 RhD變異型與RhCcEe表型相關(guān)性分析 38個(gè)樣本中PCR-SSP法共確認(rèn)4種RhD變異型，其RhCcEe血型清學(xué)表型分別為RHD*weak partial 15：ccEe（1 3/1 5）、c c E E（1/1 5）、C c E e（1/1 5）；R H D*D E L 1：C C e e（8/1 1）、C c e e（3/8）；R H D*D V I.3：C c e e（4/5）、C c E e（1/5）；RHD*weak partial 15 / RHD*DEL1雜合：CcEe（1/1）；RHD*weak D type 6 1：CcEe（1/1）（表2）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，RHD*weak partial 15與RhCcEe抗原相關(guān)系數(shù)分別為：-0.685（P＜0.01）、0.440（P＜0.01）、0.727（P＜0.01）、-0.193（P＞0.05）；RHD*DEL1與RhCcEe抗原相關(guān)系數(shù)分別為：0.645（P＜0.01）、-0.760（P＜0.01）、-0.682（P＜0.01）、0.112（P＞0.05）；RHD*DVI.3與R h C c E e抗原相關(guān)系數(shù)分別為：0.3 6 9（P＜0.05）、0.201（P＞0.05）、-0.299（P＞0.05）、0.064（P＞0.05）。RHD*weak D type 61為個(gè)例，不參與統(tǒng)計(jì)分析（圖2）。

圖2 RhD變異型與RhCcEe表型相關(guān)性熱圖

3.1 RhD陰性確認(rèn)及RhCcEe抗原檢測(cè)：使用3種不同生產(chǎn)廠家的抗-D定型試劑，根據(jù)抗體性質(zhì)采用直接試管法或微柱凝膠卡間接抗人球蛋白法檢測(cè)RhD抗原。部分樣本加做熱吸收放散試驗(yàn)。直接試管法檢測(cè)RhCcEe抗原。

圖3 RHD基因外顯子測(cè)序結(jié)果

圖4 RHD雜合型檢測(cè)結(jié)果

討 論

1 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果 8 5 8 6 2名首次獻(xiàn)血者中抗-D（IgM）抗體試劑直接試管法檢測(cè)陰性樣本609例，其中38例樣本抗-D（IgG）抗體試劑微柱凝膠卡間接抗人球蛋白法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性或弱陽(yáng)性?？梢蓸颖炯幼鰺嵛辗派⒃囼?yàn)，結(jié)果均為強(qiáng)陽(yáng)性。3 8例樣本中RhCcEe表型結(jié)果為：ccEe（17/38）、Ccee（8/38）、CCee（8/38）、CcEe（4/38）、ccEE（1/38）。

深圳是一座“移民”城市，人口來(lái)自全國(guó)各地，本研究結(jié)果顯示深圳地區(qū)血清學(xué)弱D表型獻(xiàn)血者的RHD基因結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)多態(tài)性，主要為RHD*weak partial 1 5（3 9.5%）、RHD*DEL 1（2 8.9%）、RHD*DVI.3（1 3.2%），基本符合中國(guó)人群分布特征。本研究進(jìn)一步證實(shí)中國(guó)人群RhD變異型的分子背景非常復(fù)雜。除了以上3種我國(guó)漢族人群主要的RhD變異型等位基因，本研究還發(fā)現(xiàn)RHD*weakD type 61、RHD*weak D type 95、RHD* DCC、RHD* DFR1、RHD*weak D type 50以及尚未被ISBT數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的RHD*IVS9-1C（c.1228-1G＞C）等位基因各1例。上海、廣州等地[10,15-16]曾有RHD*weak D type 61、RHD*weak D type 95、RHD* DCC、R H D* D F R 1的研究，均為個(gè)例報(bào)道。2 0 0 6年，Doescher等在GenBank提交RHD*weak D type 50等位基因序列數(shù)據(jù)（AM234631.1），之后各地再無(wú)相關(guān)報(bào)道。本研究的發(fā)現(xiàn)為后續(xù)進(jìn)行該等位基因進(jìn)一步的深入研究提供樣本基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)的1例新等位基因RHD*IVS9-1C（c.1228-1G＞C）與已知的RHD*01N.77（c.1228-1G＞A）等位基因的突變位置一致，但核苷酸取代不同[17]。RHD*01N.77被ISBT分類為RhD陰性，而本研究結(jié)果顯示新等位基因樣本與試劑3（上海血液生物公司抗-D單克隆IgG抗體）在微柱凝膠卡間接抗人球蛋白法中呈弱陽(yáng)性反應(yīng)，且熱吸收放散試驗(yàn)結(jié)果呈強(qiáng)陽(yáng)性。該位點(diǎn)核苷酸突變導(dǎo)致RhD變異型的發(fā)生機(jī)制有待我們后續(xù)進(jìn)一步深入研究。

Rh血型抗原由位于1號(hào)染色體短臂1p34.3-1p36.1上2個(gè)緊密連鎖高度同源的RHD基因和RHCE基因編碼，其基因序列同源性高達(dá)93.8%，長(zhǎng)度分別為57 295 bp和57 831 bp，均含有10個(gè)外顯子、9個(gè)內(nèi)含子。RHD基因和RHCE基因各編碼417個(gè)氨基酸，2個(gè)基因緊密連鎖串聯(lián)排列，方向相反，3'端面對(duì)面相隔約30 000 bp[2]。RHD基因編碼RhD多肽，RHCE基因編碼RhCcEe多肽。1998年，WAGNER FF等研究發(fā)現(xiàn)DVI 3型為CDe單倍體，主要表現(xiàn)為Ccee表型[18]。隨著研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)78%的弱D 15型個(gè)體表現(xiàn)為ccEe表型[19]。DEL表型也與C抗原陽(yáng)性表型具有高度相關(guān)性。一項(xiàng)為期6年的研究表明，在歐洲獻(xiàn)血人群中紅細(xì)胞表達(dá)C抗原的個(gè)體為DEL表型的情況明顯高于其他RhD陰性人群[7]。超過(guò)83%的“亞洲型”DEL表現(xiàn)為Ccee表型[20]，其機(jī)制為RHCE基因中的C和/或E等位基因與RHD基因順式串聯(lián)從而進(jìn)一步抑制了D蛋白的表達(dá)。本研究通過(guò)相關(guān)性分析，結(jié)果顯示RHD*weak partial 15與RhE抗原（相關(guān)系數(shù)為0.727，P＜0.01）、RHD*DEL1與RhC抗原（相關(guān)系數(shù)為0.645，P＜0.01）存在顯著正相關(guān)。本研究中RHD*DVI.3樣本數(shù)量較少，其統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果需進(jìn)一步加大數(shù)據(jù)量予以確認(rèn)。

熱量傳遞可描述為能量由高溫體傳遞至低溫體的過(guò)程。與電學(xué)的歐姆定理相似，由傅里葉導(dǎo)熱定律，傳導(dǎo)的熱量可用溫度的比例關(guān)系定量描述為[7]

綜上所述，本研究所獲得的血清學(xué)弱D表型獻(xiàn)血者的RHD基因結(jié)構(gòu)頻率可以粗略反映其在中國(guó)人群中的分布。由于RHD*weak partial 15與RhE抗原、RHD*DEL1與RhC抗原的相關(guān)性，RhC抗原和RhE抗原的血清學(xué)檢測(cè)可以有效篩選我國(guó)主要的RhD變異型，為后續(xù)進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突