周 晶 孫 侃 周忠義 王傳旗 苗彥軍

（1深圳市北林苑景觀及建筑規(guī)劃設(shè)計(jì)院有限公司，518038，廣東深圳；2牙克石市草原工作站，022150，內(nèi)蒙古牙克石；3西藏農(nóng)牧學(xué)院，860000，西藏林芝）

西藏是我國西南邊陲重要的生態(tài)屏障，為披堿草屬（Elymus）牧草主要分布區(qū)之一。青藏高原自然環(huán)境嚴(yán)酷，寒冷干燥的氣候條件對牧草的生存、產(chǎn)量和品質(zhì)都有很大影響[1]。藏北地區(qū)草畜矛盾突出，草地退化嚴(yán)重，而干旱是制約藏北高寒草原植被修復(fù)和人工草地建植的關(guān)鍵因素。因此，亟需培育出耐旱性強(qiáng)的鄉(xiāng)土植物品種。

垂穗披堿草（E.nutans）為禾本科披堿草屬多年生牧草和生態(tài)草，是西藏鄉(xiāng)土禾草植物中的優(yōu)勢草種之一，對西藏高寒地區(qū)人工草地建植和天然草地植被修復(fù)具有重要意義。在旱區(qū)和缺水區(qū)，水分是影響植物生長發(fā)育的重要生態(tài)因子。植物對干旱脅迫的響應(yīng)主要表現(xiàn)在外部形態(tài)和內(nèi)部生理代謝方面。例如，植物通過減緩生長速率[2]、將更多的生物量分配到根部[3]、降低株高[4]、減少葉面積[5]、提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量[6]和抗氧化酶活性[7]等方式應(yīng)對干旱脅迫環(huán)境。目前，關(guān)于垂穗披堿草耐旱性的研究主要集中于萌發(fā)期或幼苗期階段。馬青枝等[8]研究表明，聚乙二醇（PEG-6000）溶液對披堿草（E.dahuricus）萌發(fā)率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)等具有抑制作用，且其開始發(fā)芽天數(shù)和發(fā)芽高峰期均被推遲。但也有不同研究結(jié)果，余芳玲等[9]研究發(fā)現(xiàn)，50g/L PEG-6000處理有利于垂穗披堿草種子萌發(fā)。在垂穗披堿草苗期耐旱性研究中，張小嬌等[10]研究認(rèn)為，干旱脅迫影響垂穗披堿草光合作用以及物質(zhì)代謝，主要表現(xiàn)為葉綠素含量降低，脯氨酸、丙二醛和可溶性糖含量增加。干旱脅迫也影響垂穗披堿草的抗氧化清除系統(tǒng)。王傳旗等[11]研究表明，干旱脅迫14d后，垂穗披堿草葉片脯氨酸含量和過氧化氫酶活性下降。在垂穗披堿草耐旱性研究中，多是針對垂穗披堿草單個生育期進(jìn)行單項(xiàng)機(jī)理研究。然而，干旱對植物的影響不僅是巨大的，而且表現(xiàn)在不同生長階段。因此，本文從垂穗披堿草萌發(fā)期和幼苗期2個階段入手，選取西藏那曲市班戈縣和索縣2個地區(qū)的2份野生垂穗披堿草為研究材料，同時以巴青垂穗披堿草為對照材料，探討垂穗披堿草在萌發(fā)期和幼苗期對干旱脅迫的生理響應(yīng)，為選育耐旱性強(qiáng)的垂穗披堿草新品種提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與區(qū)域概況

野生垂穗披堿草種子于2016年9月采自西藏那曲市班戈縣和索縣。班戈縣屬高原亞寒帶半干旱季風(fēng)氣候區(qū)，寒冷干燥，無絕對無霜期；年均氣溫0℃左右，年均日照2850h，年降水量289～390mm，年均蒸發(fā)量1993.40～2104.10mm。索縣屬高原亞寒帶季風(fēng)氣候，冬春季多大風(fēng)，年無霜期僅40d左右；年均氣溫-2℃，年均日照 2477.20h，年降水量572.90mm，年均蒸發(fā)量1460～1550mm[12]。采集的種子風(fēng)干后于4℃保存。巴青垂穗披堿草（馴化品種）作為對照材料。材料來源見表1。

表1 材料與來源Table 1 Materials and source status

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 萌發(fā)期試驗(yàn) 隨機(jī)選取垂穗披堿草種子各600粒，放入70%乙醇溶液中浸泡2min，用超純水沖洗備用[13]。配制水勢為 0.00、-0.10、-0.20、-0.40、-0.80和-1.00MPa的PEG-6000溶液[14]。采用紙上發(fā)芽法，培養(yǎng)皿中鋪雙層無菌濾紙，加5mL對應(yīng)的PEG-6000溶液。每個培養(yǎng)皿中排25粒種子。每個處理4次重復(fù)。種子萌發(fā)試驗(yàn)在PXZ智能光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行，發(fā)芽條件為30℃/20℃（晝溫/夜溫），光周期12h，光照強(qiáng)度4000lx。以芽長達(dá)到種子長度的 1/2作為種子發(fā)芽的判定標(biāo)準(zhǔn)[15]。試驗(yàn)周期15d，為保證處理組的滲透勢不變，每隔2d稱重1次，用超純水補(bǔ)充蒸發(fā)的水分。

1.2.2 幼苗期試驗(yàn) 在西藏農(nóng)牧學(xué)院教學(xué)實(shí)習(xí)基地取土，拌入適量腐熟羊糞，于105℃烘箱中烘3h。將土壤（約3kg）裝入花盆中（20cm×15cm×25cm），播種100粒。3葉齡時開始間苗，保證每盆有50株幼苗；待苗齡為5葉期時進(jìn)行干旱脅迫。采用停水處理的方法模擬干旱脅迫環(huán)境，并于試驗(yàn)前 1d對每盆材料進(jìn)行充分供水（作為對照組），干旱脅迫后每7d取樣一次，共取樣3次，每個處理3次重復(fù)。取樣部位為垂穗披堿草主莖向上第4片葉。

1.3 測定指標(biāo)與方法

萌發(fā)率（germination percentage，GP）=（第15天發(fā)芽種子數(shù)/100）×100%；發(fā)芽指數(shù)（germination index，GI）=∑（Gt/Dt），Gt指第 t天的種子發(fā)芽數(shù)，Dt指相對應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)[16]；活力指數(shù)（vigor index，VI）=發(fā)芽指數(shù)×Sx，Sx 為平均根長[17]；根芽長（root and bud length，cm）：從每個處理隨機(jī)取15株幼苗進(jìn)行測量，取平均值。

采用電導(dǎo)法測定相對電導(dǎo)率（relative conductivity，REC）[18]；采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量[18]；采用NBT還原法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性[19]；采用愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性[19]；采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（catalase，CAT）活性[19]。

1.4 耐旱性綜合評價

隸屬函數(shù)公式：U(Xi)＝(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)。其中，U(Xi)為隸屬函數(shù)值；Xi為某指標(biāo)的測定值；Xmin和Xmax為某指標(biāo)的最小值和最大值。

隸屬度：依據(jù)隸屬函數(shù)公式求得垂穗披堿草相關(guān)指標(biāo)在干旱處理下的具體隸屬函數(shù)值，然后將每份材料抗旱性指標(biāo)的隸屬函數(shù)值累加求平均值[20]。隸屬度劃分標(biāo)準(zhǔn)[21]：0.6～0.7為強(qiáng)抗，定為Ⅰ級；0.4～0.6為較抗，定為Ⅱ級；0.3～0.4為弱抗，定為Ⅲ級；隸屬度＜0.3為不抗或易感，定為Ⅳ級。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Tukey’HSD檢驗(yàn)樣本間的顯著性，用回歸分析來確定相關(guān)指標(biāo)與干旱脅迫時間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下垂穗披堿草種子萌發(fā)特性

由表2可知，隨著滲透勢的降低，巴青垂穗披堿草的GP、GI和VI呈先升后降趨勢，而Ⅰ號和Ⅱ號的GP、GI和VI呈下降趨勢。-0.10MPa處理下，巴青垂穗披堿草種子 GP、GI和 VI均高于0.00MPa處理，但差異不顯著。-0.20MPa處理下，Ⅰ號和Ⅱ號的 VI較 0.00MPa處理顯著下降（P＜0.05）。-0.40MPa處理下，與0.00MPa處理相比，巴青垂穗披堿草的GI和VI顯著下降（P＜0.05）；Ⅰ號和Ⅱ號的GP和GI下降顯著（P＜0.05），VI極顯著下降（P＜0.01）。-0.80MPa處理下，與0.00MPa處理相比，巴青垂穗披堿草 GP顯著下降（P＜0.05），VI極顯著下降（P＜0.01）。

表2 干旱脅迫對垂穗披堿草種子萌發(fā)的影響Table 2 Effects of drought stress on seed germination of E.nutans

由表3可知，隨著滲透勢的降低，巴青垂穗披堿草根芽比呈上升趨勢，Ⅰ號和Ⅱ號根長、芽長呈下降趨勢。與0.00MPa處理相比，-0.10MPa處理下，巴青垂穗披堿草根長增加，但差異不顯著，之后隨著滲透勢降低而下降。-0.40MPa處理下，Ⅰ號和Ⅱ號芽長較 0.00MPa顯著下降（P＜0.05）。-0.80MPa處理下，巴青垂穗披堿草芽長較0.00MPa顯著下降（P＜0.05）。-1.00MPa處理下，Ⅰ號和Ⅱ號根長較0.00MPa顯著下降（P＜0.05），幼苗根芽比顯著上升（P＜0.05）。

表3 干旱脅迫對垂穗披堿草幼苗生長的影響Table 3 Effects of drought stress on growing of E.nutans seedlings

采用隸屬函數(shù)法對Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草萌發(fā)期相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，其隸屬度依次為0.522、0.495 和 0.554（表 4）。

表4 干旱脅迫下垂穗披堿草種子萌發(fā)期屬函數(shù)值及隸屬度Table 4 Subordinate function value and subordinate degree of E.nutans under drought stress at germination stage

2.2 干旱脅迫下垂穗披堿草幼苗生理特征

逆境脅迫下，REC和MDA含量是鑒定植物細(xì)胞膜損傷程度的重要指標(biāo)。隨著干旱脅迫天數(shù)的增加，幼苗葉片REC和MDA含量呈上升趨勢（表5）。與0d相比，干旱脅迫第7天，Ⅰ號葉片MDA含量顯著上升（P＜0.05），REC極顯著上升（P＜0.01）；Ⅱ號葉片REC顯著上升（P＜0.05），MDA含量極顯著上升（P＜0.01）；巴青垂穗披堿草葉片REC和MDA含量顯著上升（P＜0.05）。與0d相比，干旱脅迫第14天，Ⅰ號葉片MDA含量極顯著上升（P＜0.01），Ⅱ號葉片REC極顯著上升（P＜0.01），巴青垂穗披堿草葉片REC和MDA含量極顯著上升（P＜0.01）。通過線性回歸方程分析，干旱脅迫天數(shù)與Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草葉片MDA 含量關(guān)系分別為y=11.59x–5.20（R2=0.89）、y=12.18x–0.74（R2=0.86）和y=10.60x–6.07（R2=0.94）；干旱脅迫天數(shù)與Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草葉片 REC的關(guān)系分別為y=12.88x+1.98（R2=0.90），y=16.79x–2.85（R2=0.99）和y=14.17x–8.15（R2=0.99）。

表5 干旱脅迫對幼苗細(xì)胞膜損傷程度的影響Table 5 Effects of drought stress on cell membrane damage degree of seedlings

幼苗葉片SOD、POD和CAT活性均隨干旱脅迫天數(shù)的增加而升高，并分別在干旱第21天出現(xiàn)了小幅度下降現(xiàn)象（表6）。與0d相比，干旱脅迫第7天，3個材料葉片SOD、POD和CAT活性顯著上升（P＜0.05）；干旱脅迫第14天，葉片SOD活性極顯著上升（P＜0.01）。通過多項(xiàng)式回歸方程分析，干旱脅迫天數(shù)與Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草葉片 SOD活性關(guān)系分別為y=-6.87x2+50.11x–18.37（R2=0.88）、y=-4.38x2+36.21x–15.47（R2=0.92）和y=-4.63x2+40.9x–3.87（R2=0.88）；干旱脅迫天數(shù)與Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草葉片POD活性關(guān)系分別為y=-22.81x2+164.17x–31.97（R2=0.95）、y=-4.38x2+36.21x–15.47（R2=0.92）和y=-13.03x2+96.58x+99.17（R2=0.96）；干旱脅迫天數(shù)與Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草葉片 CAT活性關(guān)系分別為 y=-3.36x2+22.74x–9.22（R2=0.99）、y=-24.45x2+163.32x–25.98（R2=0.97）和y=-2.42x2+21.4x–2.17（R2=0.92）。

表6 干旱脅迫下幼苗葉片抗氧化酶活性變化Table 6 Changes of antioxidant enzyme activities in seedling leaves under drought stress

采用隸屬函數(shù)法對Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草幼苗期相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)行了綜合評價，其隸屬度依次為0.591、0.580和0.598（表7）。

表7 垂穗披堿草幼苗期隸屬函數(shù)值及隸屬度Table 7 Subordinate function value and subordinate degree of E.nutans at seedling stage

3 討論

3.1 種子萌發(fā)對干旱脅迫的生理響應(yīng)

本研究中，-0.10MPa處理下，巴青垂穗披堿草種子GP、GI和VI均高于0.00MPa處理，說明低濃度的PEG-6000溶液有利于巴青垂穗披堿草種子萌發(fā)。其原因可能是低滲透勢引發(fā)了種子內(nèi)部相關(guān)酶的活性，從而提高了種子萌發(fā)率[22]。這與王傳旗等[23]研究結(jié)果一致。王傳旗等[24]研究表明，高濃度的PEG-6000溶液滲透勢抑制了垂穗披堿草種子萌發(fā)，本研究也證實(shí)了這一點(diǎn)，-0.20MPa及以下水分虧缺條件下，巴青垂穗披堿草種子萌發(fā)受到了抑制。本研究中，PEG-6000抑制了Ⅰ號和Ⅱ號種子萌發(fā)，主要表現(xiàn)為隨著PEG-6000滲透勢的降低，GP、GI和VI呈下降趨勢。

在干旱或缺水區(qū)，水分是限制植物生長的主要生態(tài)因子，為適應(yīng)干旱脅迫環(huán)境，植物會調(diào)整器官的生長[25]。巴青垂穗披堿草芽長隨著PEG-6000滲透勢的降低而持續(xù)下降，但其根長在-0.10MPa處理下高于0.00MPa。表明低濃度PEG-6000溶液處理下，巴青垂穗披堿草將更多的生物量分配到根部，以促使其向地下更深處生長，這是垂穗披堿草適應(yīng)干旱環(huán)境的重要方式，同時對其在西藏半干旱地區(qū)的生存延續(xù)具有重要的生物學(xué)意義。此結(jié)果與王傳旗等[26]在西藏野生老芒麥種子萌發(fā)對溫度和水分的響應(yīng)中的研究結(jié)果相類似。此外，本研究中，PEG-6000滲透脅迫對垂穗披堿草幼苗地上部分生長的抑制作用大于地下部分。這與汪建軍等[27]研究結(jié)果類似。

3.2 幼苗對干旱脅迫的生理響應(yīng)

隨著干旱脅迫天數(shù)的增加，幼苗葉片 REC不斷升高，原因可能是細(xì)胞脫水導(dǎo)致其質(zhì)膜變形，使細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)外滲所致[28]。Sclote等[29]研究表明，植物細(xì)胞膜脂過氧化程度會隨干旱脅迫時間的延長而增加。本試驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果，隨著干旱脅迫天數(shù)的增加，幼苗葉片MDA含量呈上升趨勢，并在干旱脅迫至第21天時最大。隨著干旱脅迫天數(shù)的增加，幼苗REC和MDA含量呈上升趨勢，表明垂穗披堿草幼苗已經(jīng)受到了干旱脅迫的傷害。

幼苗葉片SOD、POD和CAT活性隨著干旱脅迫天數(shù)的增加而升高，并在干旱脅迫至第14天時，均達(dá)到了最高水平。這與許令明等[30]對花葉蘆竹（Arundodonaxvar.versicolor）和許愛云等[31]對苜蓿（Medicagosativa）的研究結(jié)果類似。表明干旱脅迫下，垂穗披堿草啟動了體內(nèi)的抗氧化清除系統(tǒng)，并通過提高保護(hù)酶活性來適應(yīng)不利的干旱脅迫環(huán)境，這也是垂穗披堿草適應(yīng)干旱環(huán)境的重要途徑之一。當(dāng)干旱脅迫至21d時，幼苗SOD、POD和CAT活性均出現(xiàn)了小幅度的下降現(xiàn)象。這可能是干旱脅迫天數(shù)超過了垂穗披堿草對干旱脅迫的耐受期，使其葉片細(xì)胞內(nèi)的各種代謝出現(xiàn)紊亂所致。

4 結(jié)論

適宜巴青垂穗披堿草種子萌發(fā)的 PEG-6000滲透勢范圍為0.00～-0.10MPa。干旱脅迫第14天為Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草幼苗耐旱的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，第21天為其耐旱的極限。供試的3份垂穗披堿草萌發(fā)期和幼苗期隸屬度均介于0.4～0.6，屬于Ⅱ級（較抗）。綜上，Ⅰ號、Ⅱ號和巴青垂穗披堿草可作為西藏鄉(xiāng)土禾草植物抗旱性育種的重要種質(zhì)材料，但鑒于植物抗旱性的復(fù)雜性和提高西藏旱區(qū)牧草生產(chǎn)的緊迫性，應(yīng)積極組織對其進(jìn)行長期系統(tǒng)的綜合研究。