段振盈 徐新玉 李 星 李在峰 馬 駿 姚占軍

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/華北作物種質(zhì)資源研究與利用教育部重點實驗室，071001，河北保定；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/河北省病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，071001，河北保定；3中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，100193，北京）

由葉銹菌（Pucciniatriticina）引起的小麥葉銹病是氣傳性真菌病害，其危害性大、易侵染且傳播距離遠(yuǎn)[1]。葉銹菌秋季侵染幼苗并向臨近傳播，以菌絲體潛伏在葉片內(nèi)或以夏孢子越冬，待溫度適宜，菌絲體或夏孢子便開始復(fù)蘇產(chǎn)生新孢子侵染寄主，導(dǎo)致病害發(fā)生和流行[2-3]。病害發(fā)生年份減產(chǎn)5%～15%，流行年份減產(chǎn) 40%甚至更高[4-6]。據(jù)統(tǒng)計，我國每年小麥種植面積約0.23億hm2，葉銹病發(fā)生面積約0.15億hm2，特別是西南、西北和長江中下游麥區(qū)發(fā)生嚴(yán)重[7]。受氣候變化和耕種方式改變的影響，我國葉銹菌生理小種多樣性呈增加趨勢，各小麥主產(chǎn)區(qū)都存在多個葉銹菌流行小種，其中分布較廣、危害較大的是THTT、THTS、THSS、PHTT和THKS[8]。當(dāng)前，該病害防治主要依靠合理的抗病品種布局、栽培管理和藥劑施用等措施[9]。由于藥劑防治耗時耗力，增加農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，且污染環(huán)境。因此，通過雜交育種聚合抗病基因來培育新的抗病品種[10-11]是抑制小麥葉銹病流行的重要途徑[12]。

我國小麥品種資源豐富，可從中篩選出優(yōu)秀的抗源材料。目前，利用基因推導(dǎo)和分子標(biāo)記檢測相結(jié)合是鑒定小麥抗病基因最快速便捷的方法。鄭慧敏等[13]在70份小麥品種（系）中利用12個與已知抗葉銹病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，結(jié)合基因推導(dǎo)和系譜分析，推導(dǎo)出Lr1、Lr2a、Lr26、Lr3ka、Lr11、Lr17、Lr30、Lr10等15個抗葉銹病基因，并篩選出 39份慢銹品種，可為小麥抗葉銹病育種提供抗源材料；張林等[14]利用基因推導(dǎo)法對山東省12個主栽小麥品種（系）進(jìn)行抗葉銹性基因分析，推導(dǎo)出Lr1、Lr16、Lr26、Lr37等抗葉銹病基因；焦悅等[15]在來自國外的50個小麥品種（系）中推導(dǎo)出Lr1、Lr26、Lr34、Lr37等8個抗葉銹病基因，并篩選出19個慢銹品種（系）。通過對國內(nèi)外小麥生產(chǎn)品種進(jìn)行基因推導(dǎo)分析，明確其中的抗葉銹病基因及篩選出慢銹性品種，為今后品種的合理布局和抗病育種提供理論支持。

隨著小麥葉銹病抗性研究的不斷發(fā)展，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)100多個抗葉銹病基因，正式命名至Lr79[16]。其中Lr10、Lr14a、Lr16、Lr17、Lr26、Lr34、Lr35和Lr36等基因在田間已基本喪失抗病性，僅Lr9、Lr19、Lr24、Lr38、Lr45、Lr78和Lr79等仍具有良好的抗病性[17]，因此鑒定小麥品種中含有的抗葉銹病基因，對培育抗葉銹病品種具有重要意義。本研究利用苗期基因推導(dǎo)法、分子標(biāo)記檢測與系譜分析對 12個小麥品種進(jìn)行抗葉銹病基因檢測，成株期根據(jù)田間病情指數(shù)篩選出慢銹性品種。

1 材料與方法

1.1 材料

供試小麥材料及菌株為12個小麥品種、35個含已知抗葉銹病基因的近等基因系、感病對照品種鄭州5389、成株慢銹對照品種SAAR、19個不同毒性的葉銹菌生理小種和田間接種所用的混合生理小種（THTT、THTS和PHTT），均由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)小麥葉銹菌研究室保存并提供，所用菌株均由流行菌株在溫室中分離純化獲得。葉銹菌生理小種依據(jù)Long[18]提出的葉銹菌密碼命名系統(tǒng)進(jìn)行命名。

1.2 方法

1.2.1 苗期侵染及基因推導(dǎo) 35個近等基因系、感病對照品種鄭州5389和12個小麥品種經(jīng)催芽后種植于溫室育苗穴盤中，待小麥生長至一葉一心時，采用掃抹法接種19個不同毒性的葉銹菌生理小種，依據(jù)Roelfs等[19]的分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗葉銹病鑒定，并根據(jù)Dubin等[20]提出的方法進(jìn)行基因推導(dǎo)?；蛲茖?dǎo)法以Flor[21]提出的基因?qū)蚣僬f為原理，依據(jù)不同葉銹菌生理小種對 35個近等基因系的侵染型來鑒別生理小種的毒性譜，并將相同的生理小種接種到待測品種，通過待測品種對這些菌系的抗感表現(xiàn)推導(dǎo)其含有的抗性基因。

1.2.2 分子標(biāo)記檢測 用 CTAB 法[22]提取供試材料的小麥幼葉全基因組 DNA，參照 Sharp等[23]的方法，使用分光光度計測定其濃度和純度，稀釋至40～50ng/μL的PCR工作液，利用12個與已知抗葉銹病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行檢測。20μL PCR反應(yīng)體系為2μL DNA模板、2μL引物、10μL 2×TaqPCR Mix和6μL ddH2O。反應(yīng)程序及引物序列見表1。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳或12%非變性聚丙酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測。試驗獨(dú)立重復(fù)2次。

表1 分子標(biāo)記的引物序列及PCR擴(kuò)增程序Table 1 Primer sequences and PCR amplification programs

1.2.3 成株期抗性調(diào)查 2017和2018年10月下旬將12個小麥品種、感病對照品種鄭州5389和慢銹對照品種 SAAR采用人工撒種條播[35]于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田（115.47°E，38.85°N）。小麥返青后（約4月初）進(jìn)行接種，將菌種（THTT、THTS和PHTT）混合后用0.03%吐溫20制成0.3～0.5g/L孢子懸浮液，用噴霧法接種于誘發(fā)行，接種后覆膜，黑暗保濕 14～16h，揭去地膜后自然生長。待鄭州5389發(fā)病嚴(yán)重度至50%時進(jìn)行第1次調(diào)查[36]，記錄苗期侵染型、發(fā)病普遍率和嚴(yán)重度，并計算病情指數(shù)[37]，之后每隔1周調(diào)查1次，直至感病對照品種鄭州5389嚴(yán)重度高于90%，一般調(diào)查3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥苗期侵染結(jié)果

參考Colin等[38]的方法進(jìn)行基因推導(dǎo)（表2），攜帶Lr2c、Lr3、Lr16、LrB、Lr3bg、Lr23和Lr33的載體品系對 19個生理小種均表現(xiàn)為感病，晉麥2148、小偃6號、溫麥6號這3個品種的抗性譜與其相同或相似，尚不能確定其中是否含有抗葉銹病基因。平陽27、石特14、煙農(nóng)15這3個供試品種對葉銹菌生理小種均表現(xiàn)為抗病，含有已知抗葉銹病基因Lr9、Lr19、Lr24、Lr28、Lr29、Lr42、Lr47和Lr51的載體品系對葉銹菌生理小種均表現(xiàn)為抗病，但平陽27的表現(xiàn)型高于Lr9、Lr19、Lr28、Lr47和Lr51載體品系的表現(xiàn)型，推測平陽 27中不含Lr9、Lr19、Lr28、Lr47和Lr51；且對菌種PHGL、TGKS和PHTS的表現(xiàn)型高于Lr24和Lr29的載體品系，推測其不含Lr24和Lr29；對菌種FHSQ、PHDQ、PHGL、TGKS和PHTS的表現(xiàn)型高于Lr42的載體品系，推測其不含Lr42；同理推測出石特14、煙農(nóng) 15中均不含有Lr9、Lr24、Lr19、Lr28、Lr29、Lr42、Lr47和Lr51。這3個品種在接種19個葉銹菌生理小種后表現(xiàn)出良好的抗性，可能含有其他未知基因，無法依靠現(xiàn)有的近等基因系推斷出其含有的抗葉銹病基因。石新 828僅對菌種 TGKS表現(xiàn)為抗病，對其他小種均表現(xiàn)為感??；濟(jì)南 2號對FHDQ①、FHGQ②、TGKS、FHJS②生理小種均表現(xiàn)為抗病，對其他小種均表現(xiàn)為感病；碧螞 4號對FHJR、FGBQ、FHDQ①、FHGQ②、FHJT、TGKS、FHJS②和FHDQ②表現(xiàn)為抗病，對其他小種表現(xiàn)為感病；碧螞1號對FGKQ和FGBQ 2個生理小種表現(xiàn)為抗病，對其他小種表現(xiàn)為感病。這4個品種對19個葉銹病生理小種的抗性譜與任一載體品系的抗性譜均不相同，推斷其可能含有其他未知抗病基因。百農(nóng)3217及Lr1的載體品系對PHDQ、TGKS生理小種均表現(xiàn)為感病，但百農(nóng)3217的抗性譜較寬，因此推測百農(nóng)3217中含有Lr1和其他未知基因。泰山 1號及Lr26的載體品系對 FGKQ、FGBQ、TGKS表現(xiàn)為抗病，且泰山1號的抗性譜較寬，推測泰山1號中含有Lr26和其他未知抗病基因。

表2 35個載體品系、12個供試品種及感病對照品種鄭州5389對19個菌系苗期抗性鑒定結(jié)果Table 2 The results of identification of resistance of 35 vector lines, 12 tested varieties and the control variety Zhengzhou 5389 to 19 pathotypes of P.triticina at seedling stage

續(xù)表2 Table 2 (continued)

2.2 分子標(biāo)記檢測結(jié)果

通過12個與已知抗葉銹病基因緊密連鎖的STS和 SCAR分子標(biāo)記進(jìn)行分析。分子標(biāo)記檢測結(jié)果（圖1）顯示，在供試品種中擴(kuò)增出與Lr34（150bp）、Lr37（259bp）、Lr1（760bp）、Lr26（1076bp）、Lr46（520bp）抗葉銹病基因大小相同的目的片段，未擴(kuò)增出與抗葉銹病基因Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24大小相同的目的片段，由此推測供試品種中不含抗葉銹病基因Lr9、Lr10、Lr19、Lr20、Lr24。其中與Lr34連鎖的標(biāo)記引物csLV34在石特14中擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性片段，表明石特14中可能含有Lr34（圖1a）；與Lr37連鎖的分子標(biāo)記在泰山1號和溫麥6號中均擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性片段，表明泰山1號和溫麥6號中可能含有Lr37（圖1b）；與Lr1緊密連鎖的標(biāo)記引物WR003在石特14中擴(kuò)增出相同的特異性片段，表明石特14可能含有Lr1（圖1c）；與Lr26連鎖的正相關(guān)分子標(biāo)記引物ω-secalin在泰山1號和石特14中均能擴(kuò)增出特異性片段，并且用負(fù)相關(guān)分子標(biāo)記Glu-B3均未擴(kuò)增出特異性片段，表明泰山1號和石特14中可能存在抗病基因Lr26（圖1d和圖1e）；石新828、濟(jì)南2號、泰山1號、晉麥2148、煙農(nóng)15、小偃6號和溫麥6號中均擴(kuò)增出Lr46的特異性片段，推測這7個小麥品種中含有成株抗葉銹病基因Lr46（圖1f）。

圖1 12個小麥品種中含有的抗葉銹病基因分子標(biāo)記檢測結(jié)果Fig.1 PCR amplification and molecular marker detection results of 12 wheat varieties

2.3 小麥成株期抗性調(diào)查結(jié)果

2017-2018和2018-2019年度供試品種與對照品種嚴(yán)重度、普遍率調(diào)查結(jié)果見表3。感病對照品種鄭州5389在2個環(huán)境下均充分發(fā)病，保證了試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。慢銹對照品種SAAR在田間的嚴(yán)重度在2個環(huán)境下均為1，為明顯的慢銹性。根據(jù)NY/ZB 592.2-2007，苗期侵染型等級為3級及3級以上且病情指數(shù)嚴(yán)重度×普遍率＜30%為慢銹性品種[39]。百農(nóng)3217、平陽27、濟(jì)南2號、泰山1號、石特14、晉麥2148、碧螞4號、煙農(nóng)15、小偃6號、溫麥6號共10個品種在田間對混合葉銹菌生理小種苗期侵染型為3級或以上，成株期嚴(yán)重度均小于30%，且病情指數(shù)較小，表現(xiàn)慢銹性。綜合2年度調(diào)查結(jié)果篩選出以上10個小麥品種為慢葉銹性品種，可為培育抗病品種提供抗源材料。

表3 12個供試品種、慢銹對照SAAR和感病對照鄭州5389成株期對混合小種侵染型、嚴(yán)重度、普遍率和病情指數(shù)結(jié)果Table 3 Infection types to Puccinia triticina, final disease severity, general rate, disease index results of 12 tested varieties, slow rust cultivar SAAR and susceptible cultivar Zhengzhou 5389

3 討論

通過查詢品種系譜分析得出，百農(nóng)3217由（阿夫×內(nèi)鄉(xiāng)5號）×咸農(nóng)39為母本、西農(nóng)64×偃大24為父本雜交選育而來，阿夫是2個意大利小麥品種Duecentodieci與Damiano的雜交后代[40]，于1956年引入我國，劉新春等[41]在阿夫中檢測到抗葉銹病基因Lr1，通過基因推導(dǎo)在百農(nóng)3217中發(fā)現(xiàn)Lr1，推測百農(nóng)3217的抗葉銹性來源于阿夫。晉麥2148是以（晉江赤子×華東5號）×歐柔為母本、瑞托為父本雜交而來，丁艷紅等[42]推測歐柔中含有抗葉銹病基因Lr34、Lr16、Lr11、Lr3bg和Lr33，由此推測晉麥2148的抗葉銹性來源于歐柔。百農(nóng)3217和晉麥2148中均檢測出抗葉銹病基因Lr1，Lr1最早由Mclntosh等[43]定位在5DL染色體上，隨后被成功克隆[44]。據(jù)報道，Lr1目前已喪失抗性，但與其他抗病基因共同存在時仍能表現(xiàn)良好的抗性，百農(nóng)3217和晉麥2148成株期表現(xiàn)出良好的抗性，可能含未知抗病基因，與基因推導(dǎo)結(jié)果吻合。濟(jì)南2號（螞蚱麥/碧玉麥//早洋麥）、碧螞1號（螞蚱麥/碧玉麥）與碧螞4號（螞蚱麥/碧玉麥）的遺傳背景相似，均包含螞蚱麥和碧玉麥，孟倩等[45]在螞蚱麥中檢測到慢銹性基因Lr34，但通過分子標(biāo)記在濟(jì)南2號、碧螞1號、碧螞4號中均未檢測出Lr34，可能是在雜交過程中發(fā)生遺傳重組或抗葉銹病基因Lr34的丟失，因此其抗性可能由其他抗性基因提供。魏新燕等[46]在碧螞 1號中檢測到抗病基因Lr35，本試驗中推導(dǎo)出碧螞1號中含有未知抗病基因，未對抗葉銹病基因Lr35進(jìn)行檢測，是否為相同的抗葉銹病基因有待進(jìn)一步驗證。平陽27、濟(jì)南2號、石特14、晉麥2148、煙農(nóng)15、小偃6號和溫麥6號表現(xiàn)慢銹性可能是慢銹基因Lr46和其他加性效應(yīng)基因共同作用的結(jié)果。其中平陽27、石特14和煙農(nóng)15在苗期對19個葉銹菌生理小種均表現(xiàn)抗病，在田間對毒性較強(qiáng)的混合生理小種表現(xiàn)感病，且侵染型在3級及以上，推測其抗病基因表達(dá)可能受多基因互作和環(huán)境條件的影響。Lr46來源于品種Pavon 76，被定位在1BL染色體上[47]。該基因為慢銹性基因，目前在田間仍具有良好抗性。本研究利用與Lr46緊密連鎖的分子標(biāo)記在7個小麥品種中檢測出成株期抗病基因Lr46，其中有6個小麥品種在成株期表現(xiàn)慢銹性，與檢測結(jié)果一致；石新 828中僅檢測到Lr46，但成株期病情指數(shù)高于30%，表明其抗病性可能受環(huán)境微觀影響或存在Lr46的抑制基因，其具體原因有待進(jìn)一步驗證。

本研究結(jié)合基因推導(dǎo)、系譜分析和分子標(biāo)記檢測多種方法，對 12個小麥品種抗葉銹病基因進(jìn)行了分析?；蛲茖?dǎo)法方便快捷、檢測周期短，能夠在短時間內(nèi)對大量品種進(jìn)行檢測，但由于該方法僅依靠人為因素對小麥侵染型進(jìn)行鑒定，通過病原物與植物之間相互作用后的侵染型來判斷供試品種中所含有的抗性基因，可能判斷錯誤導(dǎo)致錯過某些抗性基因，所以存在一定的局限性。此外，有些小麥品種遺傳背景豐富，系譜復(fù)雜，可能存在多個抗性基因，基因間的互作效應(yīng)也可能影響推導(dǎo)結(jié)果。因此，結(jié)合系譜分析一定程度上彌補(bǔ)了基因推導(dǎo)法的不足。分子標(biāo)記檢測法操作簡便，利用分子標(biāo)記對供試品種進(jìn)行檢測，不受環(huán)境因素、發(fā)育時期、遺傳背景、菌種毒力和基因互作等因素的影響。田間成株期抗性鑒定利用人工接種毒性較強(qiáng)的葉銹菌生理小種，自然誘發(fā)并結(jié)合作物的真實生長環(huán)境更具有說服力。為保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，本試驗以基因推導(dǎo)法為基礎(chǔ)，結(jié)合系譜分析、分子標(biāo)記檢測和成株期抗性鑒定，對供試品種抗葉銹病基因進(jìn)行分析，試驗結(jié)果更具有說服力。

4 結(jié)論

綜合苗期基因推導(dǎo)、系譜分析及分子標(biāo)記檢測結(jié)果，在12個小麥品種中發(fā)現(xiàn)Lr1、Lr26、Lr34、Lr37和Lr465個抗葉銹病基因，其中2個品種含Lr1，2個品種含Lr26，1個品種含Lr34，2個品種含Lr37，7個品種含Lr46，3個品種在利用現(xiàn)有條件下并未發(fā)現(xiàn)抗葉銹病基因。通過成株期抗性鑒定篩選出百農(nóng)3217、平陽27、濟(jì)南2號、泰山1號、石特14、晉麥2148、碧螞4號、煙農(nóng)15、小偃6號和溫麥6號共10個慢葉銹性品種，這些小麥品種中含有1個或多個抗葉銹病基因，可為后續(xù)培育新的小麥抗病品種提供抗源及理論支持。