心肌異常肥大導(dǎo)致的心室重構(gòu)是慢性充血性心力衰竭(CHF)發(fā)生、發(fā)展主要的病理生理機制[1]。惡性室性心律失常導(dǎo)致的心源性猝死是CHF患者的主要死亡原因[2]。后除極是惡性室性心律失常的主要促發(fā)機制，L型鈣離子通道電流(ICa-L)的增強是誘發(fā)后除極，尤其是早期后除極的始動因素[3-4]。血管緊張素Ⅱ受體1型(AT1R)-鈣調(diào)磷酸酶(CaN)信號通路在心肌細胞肥大及伴隨的離子通道重構(gòu)的調(diào)控中有重要作用[5-7]。但該信號通路對肥大心室肌細胞ICa-L的調(diào)控作用尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

苯腎上腺素(PE)、胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自Gibco公司。5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Brdu)、氯沙坦(Los)、環(huán)孢素A(CsA)、苯腎上腺素(PE)和Ⅱ型膠原酶購自Sigma公司。兔源鈣CaN A亞基β亞單位(CaNAβ)抗體購自德國Merck Millipore公司，鼠源GAPDH抗體購自上海康成生物公司。BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒購自北京中杉金橋公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純以上級別。Bio-Rad 550酶標儀、Bio-Rad化學發(fā)光儀購自Bio-Rad公司。PCR儀購自加拿大MJ Research公司。電極拉制儀(PP830型)購自日本Narishige公司。膜片鉗放大器(Axopatch700B)及附件購自美國Axon公司。

1.2 實驗動物

1 d齡SD大鼠乳鼠，雌雄不限，清潔級別，由斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供，許可證號SCXK(京)2016-0006。

1.3 乳鼠心室肌細胞分離培養(yǎng)及分組

分離乳鼠心室，剪碎，消化(胰蛋白酶終濃度0.1%、Ⅱ型膠原酶終濃度0.03%)細胞。采用差速貼壁分離技術(shù)，得到純化的心室肌細胞[7]。于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

心室肌細胞培養(yǎng)24 h，更換含5%FBS的DMEM培養(yǎng)基，據(jù)干預(yù)方式不同分為4組：對照組細胞不予干預(yù)；PE組細胞常規(guī)培養(yǎng)1 h后予終濃度為0.1 mmol/L的PE干預(yù)24 h；Los+PE組先予1 μmol/L Los干預(yù)1 h，再予終濃度為0.1 mmol/L的PE干預(yù)24 h；CsA+PE組先予0.25 μg/ml CsA干預(yù)1 h，再予終濃度為0.1 mmol/L的PE干預(yù)24 h。

1.4 心室肌細胞肥大刺激有效性鑒定

實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)測定心室肌細胞肌球蛋白重鏈(β-MHC)的mRNA表達水平。β-MHC引物序列：上游5′-CTCCCTCAAGCTCCTAAGTAATC-3′，下游5′-ACACGGTCTGAAAGGATGAG-3′。GAPDH引物序列：上游5′-GGGAAACCCATCACCATCTT-3′，下游5′-CCAGTAGACTCCACGACATACT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。以2-ΔΔCt計算各組樣品間表達水平的相對差異。

1.5 Western blot檢測心室肌細胞CaNAβ的蛋白表達水平

提取心室肌細胞總蛋白，測定蛋白濃度。取40 μg總蛋白上樣，電泳后轉(zhuǎn)移蛋白至NC膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h。加兔抗大鼠GAPDH抗體(1∶1 000)、兔抗大鼠CaNAβ抗體(1∶500)，4 ℃孵育過夜。充分漂洗后，加入辣根過氧化酶標記的二抗室溫孵育1 h。充分漂洗后顯影，Bio-Rad化學發(fā)光儀進行檢測。利用ImageJ專業(yè)圖像分析軟件對發(fā)光條帶半定量測定，以GAPDH為內(nèi)參，計算蛋白的相對表達水平。

1.6 全細胞膜片鉗檢測心室肌細胞ICa-L和動作電位

玻璃微電極與細胞形成高阻抗封接、破膜，全細胞膜片鉗記錄ICa-L離子電流。ICa-L去極化階躍方案：設(shè)置鉗制電壓為-80 mV，脈沖刺激波寬為500 ms，刺激頻率為0.1 Hz，刺激電壓從-40 mV開始，每次增加10 mV，直至最大刺激電壓+50 mV。采用電流密度分析以避免細胞大小造成的誤差。電流密度=電流強度/電容(pA/pF)。電流信號經(jīng)特制銀/氯化銀(Ag/AgCl)電極引導(dǎo)，由膜片鉗AXON 700B放大器放大，通過模-數(shù)轉(zhuǎn)換/數(shù)-模轉(zhuǎn)換(AD/DA轉(zhuǎn)換)后存儲于計算機中。實驗過程由pCLAMP 10.0軟件程序進行刺激發(fā)放和信號采集。

應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)中的電流鉗模式，予1 nA電流脈沖，波寬5 ms，引發(fā)心房肌細胞動作電位。記錄動作電位并分析動作電位時程(APD)的時程。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用pCLAMP 10.0軟件進行數(shù)據(jù)和圖形轉(zhuǎn)換；運用SigmaPlot軟件繪制離子通道電流密度-電壓曲線。用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，組間兩兩比較用LSD檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組β-MHC的mRNA表達水平比較

4組間β-MHCmRNA表達水平的差異有統(tǒng)計學意義(F=82.932，P<0.001)。組間兩兩比較顯示，PE組β-MHCmRNA表達水平較對照組明顯升高；Los+PE組和CsA+PE組β-MHCmRNA表達水平較PE組均明顯下降(P均<0.05)，見表1。

2.2 各組CaNAβ的蛋白表達水平比較

4組間CaNAβ蛋白表達水平的差異有統(tǒng)計學意義(F=180.209，P<0.001)。組間兩兩比較顯示，PE組CaNAβ蛋白表達水平較對照組明顯升高；Los+PE組和CsA+PE組CaNAβ蛋白表達水平較PE組均明顯下降(P均<0.001)，見表1、圖1。

表1 各組心室肌細胞β-MHC mRNA和CaNAβ蛋白表達水平比較

圖1 各組乳鼠心室肌細胞CaNAβ蛋白表達水平

2.3 各組乳鼠心室肌細胞ICa-L比較

圖2 為各組心室肌細胞ICa-L峰值電流原始圖，圖3為ICa-L電流密度-電壓曲線圖。ICa-L表現(xiàn)為內(nèi)向電流，PE組電流密度-電壓曲線較對照組下移，而Los+PE組和CsA+PE組電流密度-電壓曲線較PE組上移，較對照組下移。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在-20 mV～+40 mV各級刺激電壓水平，PE組ICa-L電流密度絕對值均大于對照組(P均<0.01)，Los+PE組和CsA+PE組ICa-L電流密度絕對值均小于PE組(P均<0.05)。在鉗制電壓為0 mV時，各組內(nèi)向ICa-L電流皆達峰值，各組間總體差異有統(tǒng)計學意義(F=48.547，P<0.001)。組間ICa-L峰值電流密度絕對值比較顯示，PE組較對照組顯著增大[(-18.23±1.44)pA/pF對(-10.78±1.87)pA/pF，P<0.001]，Los+PE組[(-14.02±1.51)pA/pF]和CsA+PE組[(-12.19±1.09)pA/pF]較PE組均顯著減小(P均<0.001)。

圖2 各組心室肌細胞L型鈣電流峰值電流原始圖

圖3 各組心室肌細胞L型鈣電流電流密度-電壓曲線圖

2.4 各組乳鼠心室肌細胞動作電位比較

無論是APD50還是ADP90，4組間差異均有統(tǒng)計學意義(F=28.976和70.437，P均<0.001)。組間兩兩比較顯示，PE組APD50和APD90均大于對照組(P均<0.001)；而Los+PE組、CsA+PE組的APD50和APD90均小于PE組(P均<0.05)。見表2、圖4。

表2 各組心室肌細胞動作電位時程的比較

圖4 各組心室肌單細胞動作電位代表圖

3 討論

ICa-L是動作電位2期的主要內(nèi)向電流，其與以鉀離子(K+)電流為主的外向電流相互平衡，形成動作電位的平臺期，對細胞APD起重要作用。生理狀態(tài)下，平臺期內(nèi)向鈣離子(Ca2+)增加，對細胞質(zhì)肌漿網(wǎng)Ca2+大量釋放、啟動心肌細胞興奮-收縮耦聯(lián)起著決定性作用。然而，在心肌疾病如心肌肥大、心肌炎、心力衰竭時，平臺期內(nèi)向Ca2+的增加是觸發(fā)早期后除極的直接、主要因素[3-4]。同時，在動作電位復(fù)極晚期細胞內(nèi)Ca2+超負荷可激活非特異性陽離子通道和Ca2+-鈉離子(Na+)交換泵，增加細胞內(nèi)陽離子濃度，誘發(fā)晚期后除極[4]。早期后除極和晚期后除極易誘發(fā)室性早搏和室性心動過速，是導(dǎo)致心源性猝死的主要心電學機制[8-9]。

研究發(fā)現(xiàn)，CaN參與心肌肥大和心肌細胞多種離子通道重構(gòu)的調(diào)控，并受AT1R信號的上游調(diào)控[5-7,10]，但未見AT1R-CaN信號通路對Ca2+通道重構(gòu)調(diào)控的相關(guān)報道。僅有研究顯示，激活培養(yǎng)的心肌細胞CaN，能夠增強心肌細胞膜L型鈣離子通道活性[11]。

本研究采用CaN的經(jīng)典抑制劑CsA對心室肌細胞進行干預(yù)，評估充分抑制CaN活性對ICa-L的影響。結(jié)果顯示CsA能抑制PE刺激的CaN主要功能結(jié)構(gòu)CaNAβ蛋白的表達；同時，CsA干預(yù)能夠明顯抑制PE誘導(dǎo)的心室肌細胞肥大基因β-MHCmRNA表達和心室肌細胞膜ICa-L電流密度的增加，提示CaN信號參與PE對肥大心室肌細胞ICa-L的調(diào)控。本研究結(jié)果還顯示，給予AT1R特異性阻滯劑Iso干預(yù)，也能明顯抑制PE誘導(dǎo)的心室肌細胞CaNAβ蛋白表達和肥大基因β-MHCmRNA表達，并且抑制PE刺激導(dǎo)致的ICa-L電流密度增加效應(yīng)，提示AT1R作為CaN的上游信號，可通過調(diào)控CaN的表達參與PE對肥大心室肌細胞ICa-L的調(diào)控。

單細胞動作電位分析顯示，PE干預(yù)導(dǎo)致心室肌細胞APD50和APD90值顯著延長；而Los和CsA干預(yù)明顯抑制PE對APD的延長作用。PE干預(yù)激活CaN，增大ICa-L電流密度，使得細胞動作電位2期內(nèi)向陽離子流增加，故而APD延長。CaN激活進而增大ICa-L電流密度的機制目前仍不完全清楚。有研究顯示，活化的CaN能夠與L型鈣離子通道的α1.2亞基結(jié)合，激活該離子通道，增大ICa-L電流密度[11]；此外，該現(xiàn)象尚可能與構(gòu)成L型鈣離子通道的功能亞基的表達上調(diào)有關(guān)[12]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示AT1R-CaN信號通路參與乳鼠肥大心室肌細胞ICa-L和APD的調(diào)控。