丁鑫 何奕德 張玉梅

現(xiàn)有研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞在種植體周圍炎的免疫-炎癥反應(yīng)中具有重要作用，其吞噬功能和高度的可塑性，在維持機(jī)體免疫環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起到了重要作用[1]。其中，牙齦卟啉單胞菌是種植體周圍炎的主要致病菌之一，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是其外壁的組成部分，作為一種內(nèi)毒素可以與細(xì)胞膜中的Toll樣受體結(jié)合，并激活下游與炎癥反應(yīng)相關(guān)的NFκB、MAP等激酶，從而引起炎癥反應(yīng)[2-3]。本課題組前期研究證實(shí)，鈦表面納米形貌對(duì)巨噬細(xì)胞極化具有調(diào)控效應(yīng)[4-5]，但炎癥環(huán)境下形貌因素對(duì)巨噬細(xì)胞極化的調(diào)控作用是否有所改變?nèi)圆磺宄?。?duì)炎癥環(huán)境下鈦納米形貌對(duì)巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)及炎癥相關(guān)因子分泌的影響進(jìn)行研究，以期為生物材料的設(shè)計(jì)和有效避免種植體周圍炎的發(fā)生提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器

醫(yī)用級(jí)純鈦試樣(99.9%，直徑14.5 mm，厚度1 mm,西北有色金屬研究院)；小鼠巨噬細(xì)胞系 RAW264.7 細(xì)胞 (ATCC?TIB-71TM，美國(guó))；碳化硅金相砂紙 400～7 000 目(Matador，德國(guó))；氫氟酸、丙酮、乙醇(天津富宇化工有限公司)；去離子水(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院藥劑科)；脂多糖(上海源葉生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco，美國(guó))；青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶(Sigma，美國(guó))；多聚甲醛、戊二醛、六甲基二硅胺烷(天津天力化工)；Trizol@Regent、Prime ScriptTMRT Master Mix、 SYBR?Premix Ex Taq TMII、DEPC水(Takara，日本)；抗體(CD86-FITC，CD206-PE-Cyanine7，Rat/IgG2a-FITC Isotype Control，Rat/IgG2b-PE-Cyanine7 Isotype Control)(Invitrogen，美國(guó))；Fixation Buffer、Permeabilization Wash Buffer(Bio Legend，美國(guó))；引物合成(西安擎科生物技術(shù)有限公司)；Elisa檢測(cè)試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司)； 陽極氧化電源(北京大華無線電儀器廠)；CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國(guó))；場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(HITACHI，日本)；流式細(xì)胞儀(Beckman-Coulter，美國(guó))；實(shí)時(shí)熒光PCR儀、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Rad，美國(guó))。

1.2 純鈦表面納米管的制備與形貌觀察

使用400～7 000 目砂紙將純鈦試樣依次拋光至鏡面，記為P組。將拋光試樣置于0.5%氫氟酸和6.0%磷酸電解液中，分別采用5 V和20 V恒壓直流電對(duì)試樣進(jìn)行陽極氧化反應(yīng)，持續(xù)時(shí)間1 h，制備出不同管徑納米管試樣，分別記為NT5V和NT20V組。所有試樣依次在丙酮、無水乙醇、去離子水中超聲蕩洗15 min。每組隨機(jī)抽取3 個(gè)試樣，采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察表面形貌。試樣于細(xì)胞接種前用75%乙醇浸泡6 h、紫外線照射1 h后備用。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與接種

小鼠RAW 264.7細(xì)胞株采用含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于含5%CO2的37 ℃細(xì)胞孵箱內(nèi)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞融合達(dá)80%以上時(shí)，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化后按照4×104/mL/孔(24孔板)接種于各組試樣表面，接種后隔天更換培養(yǎng)液，第3天換液后部分組加入LPS (100 ng/mL)，第4天終止培養(yǎng)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同試樣分為NC(24孔板)、P、NT5V及NT20V組，根據(jù)是否添加LPS分為L(zhǎng)PS-組和LPS+組，每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.5 細(xì)胞在納米形貌表面生長(zhǎng)形態(tài)的觀察

棄凈培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，2.5%戊二醛4 ℃過夜固定，依次使用50%、 70%、 80%、 90%、 100%、100%乙醇梯度脫水，5 min/次。完全吸凈乙醇后，每孔加入200 μL六甲基二硅胺烷浸泡30 min，吸棄所有液體后自然干燥后噴金。場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，Image J統(tǒng)計(jì)測(cè)量細(xì)胞鋪展面積和伸長(zhǎng)率。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞M1/M2極化標(biāo)志物表達(dá)

棄凈培養(yǎng)液，PBS反復(fù)吹打后收集細(xì)胞懸液至1.5 mL離心管，1 200 r/min離心5 min。400 μL Fixation Buffer重懸細(xì)胞，室溫下固定細(xì)胞20 min，350 g離心5 min，棄去上清。用PBS將10×Permeabilization Wash Buffer稀釋為1×，取100 μL重懸細(xì)胞后，分別加入CD 86-FITC和CD 206-PE-Cy7抗體，并分別設(shè)置裸細(xì)胞、單染抗體以及FITC 和PE-C7同型抗體組，室溫避光孵育20 min。1×Permeabilization Wash Buffer漂洗2 遍后，用400 μL PBS重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞M1/M2相關(guān)基因

終止培養(yǎng)后PBS輕輕漂洗3 次，Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA。測(cè)定各組RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)iNOS、IL-11β、CD 206和IL-10的基因表達(dá)，引物序列見表 1。

表 1 qPCR目的基因引物序列

1.8 ELISA方法檢測(cè)炎癥相關(guān)因子分泌

收集培養(yǎng)上清，1 000 g離心20 min后取上清。根據(jù)試劑盒說明設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔依次加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μL，樣本空加入待測(cè)上清50 μL，每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體100 μL，封板膜密封后于37 ℃恒溫箱孵育60 min。棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1 min后甩去液體，吸水紙上拍干，重復(fù)洗板5 次。每孔分別入底物A、B各50 μL，37 ℃恒溫箱避光孵育15 min。每孔加入終止液50 μL，450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔A值，根據(jù)標(biāo)志品取線計(jì)算樣品組濃度。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 鈦表面形貌掃描電鏡觀察

10 000 倍觀察，P組鈦表面相對(duì)光滑，僅可見少量平行的劃痕，NT5V組和NT20V組表面可見粗糙狀結(jié)構(gòu)，NT20V組可見均勻排列的管口；100 000 倍觀察，NT5V組和NT20V組可見均勻分布的納米管，測(cè)量管徑分別為30 nm和100 nm左右(圖 1)。

圖 1 鈦試樣表面形貌 (SEM)

圖 2 試樣表面細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)觀察 (SEM, ×2 000)

2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察和分析

巨噬細(xì)胞在不同試樣表面上正常培養(yǎng)4 d后，形態(tài)存在較為明顯的差異。NC組和P組中，細(xì)胞成圓球狀，體積較小，無明顯伸長(zhǎng)，也無偽足伸出； NT5V組，細(xì)胞略呈“梭形”，具有向兩極生長(zhǎng)的趨勢(shì)，細(xì)胞兩極可見偽足伸出； NT20V組，細(xì)胞整體仍呈圓形鋪展，可見大量“放射狀”偽足伸出。經(jīng)LPS刺激24 h后，各組細(xì)胞形態(tài)均發(fā)生顯著變化：細(xì)胞體積明顯增大且伸展出大量偽足，細(xì)胞間存在較多偽足聯(lián)系； P組和NT5V組細(xì)胞呈更為明顯的兩極化伸展，NT5V組可見較為粗大的板狀偽足且“梭形”更為明顯； NT20V組細(xì)胞呈更為明顯的“放射狀”伸展，細(xì)胞體積更大。

每個(gè)試樣表面隨機(jī)挑選3 個(gè)視野的細(xì)胞采用Image J 軟件測(cè)量細(xì)胞面積和細(xì)胞伸長(zhǎng)率(細(xì)胞長(zhǎng)軸/寬度×100%)，結(jié)果顯示NT20V組細(xì)胞伸展面積最大，而NT5V組細(xì)胞伸長(zhǎng)率最大(P<0.05)；經(jīng)LPS刺激后，各組細(xì)胞伸展面積均顯著增大(P<0.05)，其中NT20V組細(xì)胞伸展面積最大，NT5V組伸長(zhǎng)率最大，與其他各組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(圖 3)。

2.3 巨噬細(xì)胞M1/M2極化標(biāo)志物表達(dá)比較

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞M1/M2極化標(biāo)志物結(jié)果顯示，巨噬細(xì)胞正常培養(yǎng)4 d后，P和NT5V組CD206陽性率值顯著高于其他組(P<0.05)，NT20V組CD 86陽性率最高，但與P組間無顯著差異(P>0.05)；經(jīng)LPS刺激后24 h后，各組CD 86和CD 206表達(dá)均有所升高，其中NT5V組CD 206陽性率最高，而NT20V組CD 86陽性率值最高(P<0.05)(圖 4)。

圖 3 試樣表面細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)的測(cè)量

圖 4 不同鈦表面形貌及LPS刺激對(duì)巨噬細(xì)胞M1/M2極化標(biāo)志物的影響

2.4 巨噬細(xì)胞M1/M2極化相關(guān)基因表達(dá)比較

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞極化細(xì)胞內(nèi)標(biāo)志物基因的表達(dá)水平結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)4 d后，NT5V組IL-10和CD 206表達(dá)均顯著高于其他組，NT20V組iNOS和IL-1β表達(dá)顯著高于其他各組；與NC組相比，P組iNOS表達(dá)顯著升高(P<0.05)。經(jīng)LPS刺激24 h后，各組的iNOS、IL-1β和CD 206表達(dá)均顯著升高，NC組和NT20V組iNOS表達(dá)顯著高于其他兩組，NC組IL-1β表達(dá)較其他組最高(P<0.05)； NT5V組IL-10和CD 206的表達(dá)顯著高于其他各組(P<0.05)(圖 5)。

2.5 巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子分泌比較

ELISA方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞炎癥相關(guān)因子分泌結(jié)果顯示，正常培養(yǎng)4 d后，NT20V組分泌IL-1β和TNF-α顯著高于其他各組，P組和NT5V組分泌IL-4和IL-10較其他兩組更高(P<0.05)。經(jīng)LPS刺激24 h后，與NT5V組相比，NC組和NT20V組IL-1β和TNF-α分泌更高(P<0.05)；與NC組相比，其他各組IL-4分泌水平均顯著升高，NT5V組分泌IL-10顯著高于其他各組(P<0.05)(圖 6)。

圖 5 不同形貌及LPS刺激對(duì)巨噬細(xì)胞M1/M2極化相關(guān)基因表達(dá)的影響

圖 6 不同形貌及LPS刺激對(duì)巨噬細(xì)胞相關(guān)炎癥因子分泌水平的影響

3 討 論

除手術(shù)創(chuàng)傷以外，口腔致病菌在術(shù)中以及術(shù)后也存在對(duì)骨結(jié)合及種植遠(yuǎn)期成功造成影響的風(fēng)險(xiǎn)[6]。在包括炎癥反應(yīng)、創(chuàng)傷愈合、致病菌清除等一系列免疫反應(yīng)中，巨噬細(xì)胞起到了免疫調(diào)控的關(guān)鍵作用。針對(duì)不同的炎癥微環(huán)境巨噬細(xì)胞自身可以表現(xiàn)出向不同表型極化特點(diǎn)，例如，LPS和干擾素-γ(IFN-γ)可以促巨噬細(xì)胞向M1型極化，分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎因子，并表達(dá)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)以抵抗感染；而在創(chuàng)傷愈合過程中，其在白介素4(IL-4)等抗炎因子誘導(dǎo)下向表現(xiàn)為向M2型極化方向轉(zhuǎn)變，并分泌IL-10、精氨酸酶-1(Arg-1)等抗炎因子以促進(jìn)組織修復(fù)、愈合[7-8]。Galarraga-vinueza等[9]在種植體周圍炎患者臨床檢查并對(duì)組織病理進(jìn)行免疫組化染色中發(fā)現(xiàn)，種植體周圍組織中巨噬細(xì)胞的M1極化標(biāo)志物CD 86表達(dá)程度與臨床探診深度呈正相關(guān)。

既往的研究發(fā)現(xiàn)，在免疫反應(yīng)過程中巨噬細(xì)胞需要在M1和M2極化狀態(tài)中保持相對(duì)平衡，才能有效抑制炎癥反應(yīng)向急性或病理性反應(yīng)轉(zhuǎn)化，如何人為干預(yù)或調(diào)控免疫過程中巨噬細(xì)胞極化方向及其比例一直是研究的熱點(diǎn)。已有研究證實(shí)，通過對(duì)生物材料表面微/納米級(jí)形貌進(jìn)行設(shè)計(jì)可以實(shí)現(xiàn)調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的目的[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，鈦表面不同管徑的納米管形貌對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響不同，大管徑的納米管傾向于促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化，而小管徑納米管更有利于巨噬細(xì)胞M2極化[4-5]。但在炎癥環(huán)境下，上述形貌對(duì)巨噬細(xì)胞計(jì)劃方向的影響是否有所改變?nèi)圆磺宄??；谝陨涎芯勘尘埃狙芯坎捎?0 nm和100 nm管徑納米形貌，觀察牙齦卟啉單胞菌來源LPS刺激的炎癥微環(huán)境下，鈦表面納米形貌對(duì)巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)和炎癥相關(guān)因子分泌情況的影響。本研究中使用的RAW264.7細(xì)胞為小鼠來源的巨噬細(xì)胞系，其作為巨噬細(xì)胞研究模型已被廣泛應(yīng)用，可以表征常見的巨噬細(xì)胞表型[11]；LPS已被證實(shí)可以在體外誘導(dǎo)不同類型細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)[12-13]。

本研究中，正常培養(yǎng)條件下不同管徑納米管對(duì)RAW264.7細(xì)胞的極化調(diào)控及炎癥相關(guān)因子分泌影響與前期結(jié)果相一致。經(jīng)LPS刺激巨噬細(xì)胞由圓球狀變?yōu)椤胺派錉钌煺埂鼻野w明顯增大，M1極化標(biāo)志物CD 86及相關(guān)基因iNOS和IL-1β表達(dá)增高，證明100 ng/mL LPS刺激24 h后RAW264.7細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化。在NT20V組表面，細(xì)胞由圓球形向圓餅狀鋪展并伸展出“放射狀”偽足，M1型標(biāo)志物CD 86高表達(dá)；而在NT5V組表面，細(xì)胞沿長(zhǎng)軸伸長(zhǎng)呈“梭形”，M2型標(biāo)志物CD 206高表達(dá)；與P組和NT5V組相比，NT20V組M1極化標(biāo)志iNOS和IL-1β基因表達(dá)顯著升高。LPS刺激是文獻(xiàn)報(bào)道中經(jīng)典的誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化的方法，但有研究報(bào)道，不同劑量與刺激時(shí)間對(duì)極化方向和M1/M2比例存在不同影響[14]；此前研究發(fā)現(xiàn)100 nm管徑納米管誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化，而本研究中NT20V表面巨噬細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后IL-1β基因表達(dá)較NC組低，IL-1β分泌也未顯著增加，M1極化NT20V組也并未產(chǎn)生“疊加效應(yīng)”，此結(jié)果提示鈦納米材料在炎癥微環(huán)境下與NC組相比，M1極化及炎癥相關(guān)因子均受到了不同程度的抑制。研究表明，IFN-γ/LPS和100 nm管徑納米管形貌是通過兩種不同的機(jī)制誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1向極化[15]。因此，納米形貌是否能夠有效抑制炎癥環(huán)境下的巨噬細(xì)胞M1極化及相關(guān)炎癥因子的分泌還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究中發(fā)現(xiàn)，NT5V組具備良好的促巨噬細(xì)胞M2極化以及促進(jìn)抑炎因子分泌的性能。掃描電鏡下觀察在30 nm管徑納米管表面，巨噬細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形伸展，這表明了材料對(duì)于細(xì)胞極化方向的誘導(dǎo)效能。NC組經(jīng)LPS刺激后，細(xì)胞體積明顯增大并呈“放射狀”伸展，CD86、iNOS及IL-1β表達(dá)顯著升高，而NT5V組經(jīng)LPS刺激后M1相關(guān)標(biāo)志物和基因雖有升高但均低于其他組；M2相關(guān)標(biāo)志物和基因以及促炎相關(guān)因子分泌均顯著高于其他組，這提示30 nm管徑納米管可能通過誘導(dǎo)并限制細(xì)胞形貌及伸展從而抑制其向M1方向極化，同時(shí)維持細(xì)胞M2極化特性。Jain等[16]發(fā)現(xiàn)通過限制細(xì)胞體積與伸展可以顯著抑制LPS刺激下巨噬細(xì)胞M1向極化以及炎癥相關(guān)基因的表達(dá)；去除限制后，細(xì)胞可向M1向極化；去除LPS刺激后，細(xì)胞還可以向M2轉(zhuǎn)化。因此可以推測(cè)，30 nm管徑納米管在LPS刺激的炎癥環(huán)境中，可以維持巨噬細(xì)胞M2極化狀態(tài)并促進(jìn)相關(guān)抑炎因子的分泌。Chistiakov等[17]和Colin等[18]發(fā)現(xiàn) IL-1β/LPS或免疫復(fù)合物刺激下可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2b方向極化，其特征是IL-10高表達(dá)。本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS刺激后，M2極化標(biāo)志物及相關(guān)基因表達(dá)均有所升高，其中IL-10最為顯著。生物材料作為外源性刺激，植入生物體內(nèi)會(huì)引起宿主的免疫反應(yīng)，相關(guān)炎癥因子分泌并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生吞噬作用，同時(shí)分泌抑炎因子促進(jìn)血管生成、組織愈合，這可能是本研究中經(jīng)LPS+和N組間抗炎癥相關(guān)因子分泌無明顯差異的原因。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，30 nm管徑納米管促RAW 264.7細(xì)胞M2極化，100 nm管徑納米管促RAW264.7細(xì)胞M1極化；細(xì)胞經(jīng)LPS刺激后鈦納米管形貌可以一定程度地抑制細(xì)胞M1極化相關(guān)基因的表達(dá)，30 nm管徑鈦納米管形貌可以顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞M2極化及抑炎相關(guān)因子的分泌。由于種植體周圍炎的發(fā)生受到多種因素的影響，巨噬細(xì)胞在行使功能過程中并不能簡(jiǎn)單地劃分為M1或M2極化，M1/M2比例及如何誘導(dǎo)M2方向轉(zhuǎn)化可能更為重要，因此，鈦納米形貌在炎癥環(huán)境中對(duì)巨噬細(xì)胞極化調(diào)控及相關(guān)炎癥因子分泌的影響及其內(nèi)在機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。