馬夢楠，王慧明，王苗苗，姚望，張金璧，潘增祥

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，南京 210095

0 引言

【研究意義】卵泡的發(fā)育和閉鎖關(guān)乎哺乳動物的繁殖力，進(jìn)而影響家畜生產(chǎn)性能。而在哺乳動物中，只有極少數(shù)卵泡（少于1%）會被選擇并最終排卵為成熟卵泡，而其他卵泡則會發(fā)生閉鎖[1]。卵泡閉鎖的主要特征是卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞的凋亡，但卵泡閉鎖主要誘因是顆粒細(xì)胞的凋亡[2]。在豬卵巢中，細(xì)胞凋亡首先發(fā)生在壁層顆粒細(xì)胞的顆粒層中，而后是卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞。在卵泡閉鎖過程中，顆粒細(xì)胞凋亡增多導(dǎo)致內(nèi)部容量減少，隨著細(xì)胞脫落和卵泡腔塌陷，最終使整個卵泡發(fā)生退化。近年來，非編碼 RNA（ncRNA），尤其是miRNA在卵巢功能中的普遍性和重要功能被逐漸揭開[3-5]。環(huán)狀RNA(circRNA) 作為一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性 ncRNA，可通過幾種不同類型的 RNA剪接方式以共價鍵形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且不具有 5'末端帽子和 3'末端，不易被核酸外切酶識別并剪切，因此具備高度的保守性和穩(wěn)定性。circRNA廣泛分布于真核細(xì)胞中，參與多種生理過程[6-7]，但其在家畜卵泡中的驗(yàn)證和研究較少。豐富卵泡閉鎖過程中circRNA的調(diào)控機(jī)制的認(rèn)知，是對家畜繁殖生理的分子調(diào)節(jié)機(jī)理進(jìn)行補(bǔ)充，會為在實(shí)踐中提高家畜繁殖力開拓思路和提供有益參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】顆粒細(xì)胞的凋亡是受到多種細(xì)胞因子調(diào)控的及其精確和復(fù)雜的生理過程，非編碼RNA如miRNA已被廣泛研究參與顆粒細(xì)胞的凋亡[8-9]。有研究表明circRNA作為調(diào)節(jié)因子參與了卵巢卵泡的發(fā)育過程。例如：在女性卵巢衰老過程中存在差異表達(dá)的circRNA，其中circRNA-103827和circRNA-104816參與調(diào)控卵巢類固醇的生成，從而影響卵泡的發(fā)育[10]。在成年和幼年的小鼠卵巢中鑒定了許多差異表達(dá)的 circRNA，其中的circEGFR的表達(dá)量在成年小鼠卵巢中顯著上調(diào)，circEGFR是一種與雌激素信號相關(guān)的 circRNA，并且circEGFR調(diào)控卵泡發(fā)育和顆粒細(xì)胞的增殖[11]；波爾山羊和麻城黑山羊的卵泡中有37個差異表達(dá)的circRNA，并且麻城黑山羊的繁殖率比波爾山羊更高，表明circRNA的差異表達(dá)可能對卵巢卵泡的發(fā)育產(chǎn)生影響從而導(dǎo)致繁殖率的不同[12]；在牛中，circRNA與BMP15和GDF9相互作用，調(diào)節(jié)牛卵丘細(xì)胞的狀態(tài)，從而影響卵泡的生長[13]；筆者前期實(shí)驗(yàn)通過全基因組circRNA測序證實(shí)，豬卵泡中有大量circRNA的表達(dá)，且卵泡閉鎖過程中的circRNA的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，表明 circRNA在豬卵泡閉鎖過程中具有調(diào)控潛力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】抑制素（Inhibin,INH）是一種性腺糖蛋白激素，由兩個α亞基或一個α亞基和一個β亞基組成二聚體，主要由雌性動物卵巢卵泡的顆粒細(xì)胞產(chǎn)生。INH可以反饋抑制垂體前葉促卵泡激素FSH的釋放，調(diào)節(jié)卵泡的生成，是控制哺乳動物排卵的重要因子[14]。前期的 circRNA測序發(fā)現(xiàn)，INHβ亞基的編碼基因INHBB可能通過其前體 mRNA的反向剪切編碼一個 circRNA，即circINHBB。但circINHBB的序列結(jié)構(gòu)及其在卵泡閉鎖和顆粒細(xì)胞中的作用尚待驗(yàn)證和探索?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文旨在驗(yàn)證circINHBB的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞生物學(xué)分布，明確其在卵泡閉鎖過程中的表達(dá)變化，并探索其對顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。

1 材料與方法

研究于2018年9月至2019年12月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)類實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心（國家實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心）完成。

1.1 樣品采集

豬卵巢選自淮安蘇食肉品屠宰點(diǎn)180日齡的三元雜交后備母豬，屠宰后10 min內(nèi)采集表面光滑，卵泡分布均勻，顏色呈淡粉色，無紅體與白體的卵巢，置于37℃含雙抗（青霉素、鏈霉素各100 U·mL-1）的生理鹽水中，3 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 卵泡的分類

用含有青霉素與鏈霉素的 37℃ 無菌生理鹽水清洗卵巢，在培養(yǎng)皿中用手術(shù)刀，眼科鑷剝離直徑約5mm的單個卵泡。依據(jù)外觀的形態(tài)特征，P4/E2比率和顆粒細(xì)胞的密度分為健康卵泡與早期閉鎖卵泡，依據(jù)參考文獻(xiàn)[15]改進(jìn)的具體標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 健康和早期閉鎖豬卵泡的判定指標(biāo)Table 1 Judgment criteria for porcine healthy and early atresia follicles

1.3 顆粒細(xì)胞培養(yǎng)

首先用含有青霉素與鏈霉素的37°C無菌生理鹽水和 37°C的 75%乙醇交替清洗卵巢，然后用 10mL注射器抽取直徑為 3—6mm卵泡的卵泡液及顆粒細(xì)胞，1 000×g離心5min去除卵泡液；用含有1%雙抗的 PBS清洗顆粒細(xì)胞兩次，1 000×g離心 5min去除PBS后，用完全培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清和 1%雙抗的 DMEM/F12培養(yǎng)基）重懸細(xì)胞，充分吹打至散開并接種于12孔（用于RNA提取和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)）或 6孔（用于蛋白提?。┌逯?；放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃，5% CO2培養(yǎng)。36 h后觀察顆粒細(xì)胞貼壁情況，棄去培養(yǎng)基及未貼壁的顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞，用PBS清洗貼壁的顆粒細(xì)胞，繼續(xù)后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

豬顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，用PBS沖洗細(xì)胞兩次，按照Trizol試劑（Invitrogen公司）說明書提取顆粒細(xì)胞RNA（每個孔用量1mL），用紫外比色法測定總RNA的濃度和純度，用1.4%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的質(zhì)量。吸光值為1.8—1.97，且18S、28S條帶清晰的RNA樣品可用于反轉(zhuǎn)錄。取1 μg質(zhì)量合格的總RNA用PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa）試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成，具體步驟按說明書操作。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

circINHBB-siRNA，即si-circINHBB（sens -e：5'-GGCUCAGGCCCCGGCGGAGTT-3'；antisense：5'-CUCCGCCGGGGCCUGAGCCTT-3'）及陰性對照 nc-siRNA由吉瑪（上海）生物公司合成。正常培養(yǎng)豬顆粒細(xì)胞 48h后，用 Lipofectamine 3000（Invitrogen）和 Opti-MEM（Gbico）轉(zhuǎn)染豬顆粒細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6 引物設(shè)計(jì)與qRT-PCR反應(yīng)

定量引物設(shè)計(jì)：根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫中收錄的INHBB基因mRNA序列和qPCR反應(yīng)要求，用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)反向引物，GAPDH作為內(nèi)源對照。全部引物由深圳華大生物技術(shù)有限公司合成，使用時用ddH2O稀釋至工作濃度。引物序列信息和擴(kuò)增條件見表2。

表2 PCR引物及反應(yīng)條件Table 2 Primer and PCR reaction conditions

PCR的具體操作方法按照 2×Vazyme LAmp Master Mix試劑盒（南京諾唯贊）說明進(jìn)行。PCR產(chǎn)物由瓊脂糖凝膠電泳和Sanger測序（上海生工生物工程股份有限公司）進(jìn)行序列驗(yàn)證。

qRT-PCR的詳細(xì)步驟參見 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒（南京諾唯贊）說明。GAPDH作為內(nèi)參。根據(jù) LIVAK等[16]的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，即處理組的ΔCT=處理組目標(biāo)基因的CT -處理組內(nèi)參基因的CT，對照組的ΔCT=對照組目標(biāo)基因的CT-對照組內(nèi)參基因的CT；ΔΔCT=處理組的ΔCT -對照組的ΔCT?；虮磉_(dá)的變化倍數(shù)表示為 2-ΔΔCT，各基因表達(dá)量用均值表示。每個實(shí)驗(yàn)組包含6個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

1.7 熒光原位雜交（FISH）

在蓋玻片上培養(yǎng)豬顆粒細(xì)胞，用 4%多聚甲醛（含DEPC）固定20 min，PBS（PH7.3）振蕩3次，最后加入蛋白酶 K（20 μg·mL-1）消化 5 min。隨后用CY3標(biāo)記的circINHBB特異性探針5'-CGCTCC GCCGG-GGCCTGAGCCCCCG-3'（武漢塞維爾生物公司）標(biāo)記 circINHBB。并用DAPI進(jìn)行細(xì)胞核染色。在Nikon立式熒光顯微鏡（日本Nikon DS-U3）上采集圖像。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測

豬顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后, 首先用PBS洗滌貼壁的豬顆粒細(xì)胞。隨后使用 Annexin V-FITC/PI staining試劑盒（南京諾唯贊）對顆粒細(xì)胞進(jìn)行染色。最后運(yùn)用流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，美BD）檢測。使用FlowJo v7.6軟件分析數(shù)據(jù)。每個試驗(yàn)組包含5個技術(shù)重復(fù)。

1.9 生物信息學(xué)軟件及在線分析工具

（1）生物信息學(xué)軟件

Primer premier 5.0 軟件：引物設(shè)計(jì)；

Chromas 2.0軟件：對測序結(jié)果進(jìn)行峰圖分析；

DNAMAN V5.22 軟件：進(jìn)行核苷酸、氨基酸序列比對分析；

GraphPad Prism 5 軟件：繪制圖表并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

clipSearch軟件：預(yù)測circINHBB結(jié)合的miRNA。

（2）在線分析工具

GenBank數(shù)據(jù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）：獲取基因序列；

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

本實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)分析利用 SPSS 20.0和Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。P<0.05（*）和 0.01（**）分別被認(rèn)為是差異顯著和極顯著。

2 結(jié)果

2.1 健康卵泡與閉鎖卵泡的數(shù)據(jù)

根據(jù)課題組前期建立的研究方法，獲得直徑 3—5 mm豬中等卵泡。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，即外觀形態(tài)特征、P4/E2比率和卵泡液顆粒細(xì)胞密度指標(biāo)（表 1）區(qū)分健康卵泡和早期閉鎖卵泡（圖1）。依據(jù)上述方法選擇符合各項(xiàng)判定指標(biāo)的健康卵泡6個、早期閉鎖卵泡6個。樣本信息及具體分組見表3。

表3 卵泡樣本信息Table 3 Sample information of ovary

2.2 circRNA的鑒定

由于circRNA由mRNA前體反向剪切形成，設(shè)計(jì)引物時以預(yù)測的線性RNA剪切位點(diǎn)方向?yàn)橐?′端，向線性 RNA兩側(cè)方向設(shè)計(jì)引物，從而擴(kuò)增包含剪切位點(diǎn)的circRNA序列。circINHBB的正、反向引物設(shè)計(jì)原理如圖2-A所示。circINHBB的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示出單一條帶，表明了circINHBB在卵泡中有表達(dá)，且具有特異性（圖2-B）。

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序的結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)了 circINHBB的堿基序列，并明確了 INHBB 線性mRNA前體（5′UTR區(qū)域）成環(huán)反應(yīng)的剪切位點(diǎn)（圖2-C）。

2.3 circINHBB在豬顆粒細(xì)胞中的分布

為了驗(yàn)證circINHBB在豬卵泡顆粒細(xì)胞中的分布情況，我們通過FISH方法，用circINHBB探針檢測了其在健康顆粒細(xì)胞中的表達(dá)情況。結(jié)果可見circINHBB（紅色熒光）主要存在于顆粒細(xì)胞質(zhì)中，且表達(dá)量較高，在細(xì)胞核中表達(dá)量較低（圖 3）。由此可見circINHBB可能主要通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制參與對顆粒細(xì)胞的調(diào)控。

2.4 circINHBB在豬健康、早期閉鎖卵泡的差異表達(dá)

對健康和早期閉鎖卵泡的 circINHBB進(jìn)行 qRTPCR檢測可見circINHBB在健康卵泡中表達(dá)量較高，而在早期閉鎖卵泡中表達(dá)量顯著下降（圖 4），可見circINHBB參與了卵泡閉鎖過程。

2.5 circINHBB抑制豬顆粒細(xì)胞的凋亡

為了探索circINHBB對豬顆粒細(xì)胞凋亡的影響，我們首先合成了circINHBB的特異性siRNA，然后將其轉(zhuǎn)染到豬顆粒細(xì)胞中。qRT-PCR結(jié)果證明si-circINHBB能顯著抑制circINHBB的表達(dá)水平，敲減效率約為50%（圖5-A）。同時INHBB的線性mRNA表達(dá)水平不受si-circINHBB的影響（圖5-B），可見該siRNA的敲減效果具有特異性。隨后，用流式細(xì)胞術(shù)（FACS）檢測si-circINHBB轉(zhuǎn)染前后的顆粒細(xì)胞凋亡水平。結(jié)果顯示，敲減circINHBB后，顆粒細(xì)胞凋亡率顯著上升，可見circINHBB對顆粒細(xì)胞凋亡有顯著的抑制作用（圖5-C）。

2.6 circINHBB互作的miRNA

circINHBB存在于豬卵泡顆粒細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，提示其可能作為 miRNA的分子海綿調(diào)控豬卵泡的發(fā)育。為進(jìn)一步探索circINHB可能參與調(diào)節(jié)的miRNA，我們利用生物學(xué)信息工具預(yù)測 circINHBB互作的miRNA，結(jié)果表明，circINHBB可能與10個miRNA相互作用（表4）。

表4 circINHBB互作的miRNATable 4 circINHBB interacting miRNA

3 討論

近年來，circRNA參與的分子調(diào)控成為了ncRNA調(diào)控研究的新熱點(diǎn)。circRNA對核酸外切酶具有抗性，因此在哺乳動物細(xì)胞中半衰期較長。circRNAs的普遍性、保守性、組織/細(xì)胞特異性和穩(wěn)定性使其成為了比miRNA更理想的生物標(biāo)志物候選者[17]。研究表明在人類血液、唾液和胃液中也檢測到了circRNAs，這進(jìn)一步提高了 circRNAs作為有效診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物的潛力[18]。目前，在人卵巢顆粒細(xì)胞[19]、胎盤[20]和睪丸[21]中的circRNA表達(dá)譜已有研究，并得出了circRNA與這些生殖相關(guān)組織的病理特征密切相關(guān)的結(jié)論。筆者前期在豬中等有腔卵泡中的circRNA表達(dá)譜研究[22]是家畜繁殖學(xué)領(lǐng)域中對circRNA的首次探索。本研究驗(yàn)證了circINHBB在豬卵泡顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其與卵泡閉鎖過程息息相關(guān)。卵泡中的circINHBB的鑒定可能為畜牧業(yè)分子育種和生殖醫(yī)學(xué)提供新的circRNA生物標(biāo)記物。最近，越來越多的證據(jù)表明，circRNA可能通過多作為競爭性內(nèi)源性RNA（ceRNA），通過高效結(jié)合某個 miRNA[23]或作為 miRNAs海綿[24]特異性吸附多個 miRNAs，從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。筆者研究發(fā)現(xiàn)circINHBB主要在顆粒細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)。表明circINHBB可能是通過作為miRNAs分子海綿發(fā)揮生物學(xué)功能。

在生殖領(lǐng)域，miRNA在顆粒細(xì)胞凋亡、卵泡閉鎖過程中的參與已經(jīng)在人、小鼠、豬和牛身上得到了很好的研究和廣泛證實(shí)[18]。筆者通過生物信息工具的預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，circINHBB可能與10個miRNA相互作用。研究表明，miR-342是Notch信號通路的下游分子，miR-342可以調(diào)控 TGF-β信號通路[25]并且 miR-342抑制PIK3R1的表達(dá)從而激活A(yù)kt信號通路[26]；miR-432通過抑制IGF的表達(dá)抑制Akt信號通路從而抑制細(xì)胞的增殖[27]；miR-122可以通過直接靶向TGFBR2抑制TGF-β/ Smad信號通路[28]。大量的研究表明TGF-β信號通路調(diào)控豬卵泡的發(fā)育和顆粒細(xì)胞的凋亡[29-31]；Notch信號通路調(diào)控卵泡的生長，卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂，卵巢的血管生成和類固醇激素的生成[32]；在豬卵泡顆粒細(xì)胞中，抑制Notch信號通路時，將促進(jìn)NPC1和StAR的表達(dá)從而刺激孕激素分泌[33]；此外，研究證實(shí)IGF通過PI3K/ Akt信號通路促進(jìn)豬顆粒細(xì)胞的增殖[34]。綜上，circINHBB可能通過競爭結(jié)合miR-342、miR-432和miR-122從而調(diào)控卵泡的閉鎖（圖6）。

值得注意的是，INHBB作為circINHBB的編碼基因，同時也編碼INHB的β亞基，而INH是重要的FSH的負(fù)調(diào)節(jié)因子。據(jù)報道，抑制素活性的降低可能導(dǎo)致FSH水平升高，隨后每個周期招募的卵泡數(shù)量過多，最終導(dǎo)致卵泡池提前耗盡，造成卵巢早衰（POF）[14]。circINHBB的剪接可能通過與線性INHBB mRNA的競爭，抑制INHBB的剪接和翻譯，從而促進(jìn)FSH的調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖以及卵泡的生長和發(fā)育（圖6）。

4 結(jié)論

筆者在豬卵泡中鑒定了一個新的，由 INHBB基因編碼的 circRNA，即 circINHBB。它在卵泡顆粒細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，在豬卵泡閉鎖過程中顯著下調(diào)，并具有抑制顆粒細(xì)胞凋亡的功能。circINHBB的作用機(jī)制可能通過作為miRNA的分子海綿，通過TGF-β、Notch等信號通路參與調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡及卵泡閉鎖過程。本研究為進(jìn)一步完善circRNA對卵泡閉鎖、顆粒細(xì)胞凋亡的影響及調(diào)控機(jī)理提供了參考。