刁衛(wèi)楠，袁平麗，龔成勝，趙勝杰，朱紅菊，路緒強(qiáng)，何楠，楊東東，劉文革

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所，鄭州 450009

0 引言

【研究意義】西瓜（Citrullus lanatus）原產(chǎn)于非洲，為一年生蔓生藤本植物，屬葫蘆科西瓜屬，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，深受人們喜愛。我國是西瓜生產(chǎn)和消費(fèi)大國，西瓜在我國蔬菜生產(chǎn)中占據(jù)重要地位，我國的西瓜育種產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，自20世紀(jì)50年代至今，西瓜品種已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了至少 5次品種更新?lián)Q代[1]。西瓜果肉顏色是西瓜重要的農(nóng)藝性狀，決定西瓜的外觀品質(zhì)。西瓜果肉中含有豐富的類胡蘿卜素，類胡蘿卜素組分和含量的不同導(dǎo)致西瓜果肉顏色的多樣化（如白色、粉紅色、紅色、檸檬黃色、橙色等）[2]。類胡蘿卜素是動(dòng)物體內(nèi)維生素A的主要來源，飲食中攝入類胡蘿卜素，可作為自由基清除劑，預(yù)防多種退行性疾病、心血管疾病、癌癥和其他疾病[3]。西瓜果肉顏色和色素含量是影響果實(shí)營養(yǎng)品質(zhì)和消費(fèi)者接受程度的重要因素之一，定位調(diào)控西瓜果肉顏色形成的關(guān)鍵基因，對(duì)進(jìn)一步明確關(guān)鍵基因的調(diào)控機(jī)理及西瓜新品種培育具有重要的理論意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】果肉顏色是園藝植物果實(shí)重要的外觀及品質(zhì)評(píng)價(jià)性狀，許多園藝植物果肉顏色的形成都與類胡蘿卜素的種類和含量有關(guān)，如番茄和柑橘中都含有豐富的類胡蘿卜素。目前高等植物中類胡蘿卜素的合成代謝已經(jīng)非常明確，主要在質(zhì)體中通過類異戊二烯途徑合成[4]。番茄中八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）、ζ-胡蘿卜素脫氫酶（ZDS）和八氫番茄紅素合成酶（PSY）均與果肉番茄紅素的積累相關(guān)，PDS、ZDS、PSY1的高表達(dá)和番茄紅素的積累密切相關(guān)[5-6]。在柑橘類果實(shí)葡萄柚中發(fā)現(xiàn)，LCYB 2是導(dǎo)致紅肉和白肉葡萄柚表型差異的關(guān)鍵影響因素[7]。除類胡蘿卜素代謝途徑基因外，還有大量轉(zhuǎn)錄因子與類胡蘿卜素的合成代謝相關(guān)，如MADS-box家族的RIN轉(zhuǎn)錄因子能夠通過促進(jìn)番茄果實(shí)的成熟影響果肉中類胡蘿卜素的積累，進(jìn)而調(diào)控番茄果肉顏色[8]。MYB家族的MYB 7和MYB 68轉(zhuǎn)錄因子分別與獼猴桃和柑橘果肉中類胡蘿卜素的積累有關(guān)[9-10]。西瓜果肉顏色也與類胡蘿卜素密切相關(guān)。研究表明，紅瓤西瓜中主要含有番茄紅素，且在成熟期含量最高，橙黃瓤西瓜中則以β-胡蘿卜素為主，而黃瓤西瓜中主要含有紫黃質(zhì)和葉黃素，且類胡蘿卜素總量偏少，僅為紅瓤或橙黃瓤西瓜中的 1%—2%[11-12]。關(guān)于西瓜果肉不同顏色的遺傳規(guī)律已有報(bào)道，果實(shí)檸檬黃色（C）被認(rèn)為是除白色（Wf）以外其他顏色（紅色、粉色、橙色、淡黃色）的顯性基因，Wf對(duì)黃色（B）具有上位性；粉紅色（Y）對(duì)橙色（y0）和淡黃色（y）為顯性，橙色（y0）對(duì)淡黃色（y）為顯性，檸檬黃色（C）對(duì)Y具有上位性[13-16]。BANG等[17]通過對(duì)亮黃與紅瓤西瓜中番茄紅素環(huán)化酶（LCYB）的cDNA全長序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)存在3個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)，其中SNP-Phe226導(dǎo)致了一種氨基酸替換。利用基于該SNP開發(fā)的CAPS標(biāo)記可以正確的對(duì)西瓜紅瓤和黃瓤群體進(jìn)行基因分型，因此，LCYB可能是控制西瓜果肉亮黃或紅色的遺傳因子。豆峻嶺等[18]通過對(duì)無籽西瓜果實(shí)發(fā)育過程中番茄紅素合成代謝酶基因表達(dá)的分析，發(fā)現(xiàn)LCYB在控制果肉顏色發(fā)育中具有重要作用；BRANHAM等[19]以橙黃肉西瓜‘NY0016’為母本材料，與其他不同瓤色西瓜品系進(jìn)行雜交，在1號(hào)染色體上定位到1個(gè)與β-胡蘿卜素相關(guān)的主效位點(diǎn)，為通過標(biāo)記輔助育種培育富含β-胡蘿卜素的紅瓤西瓜雜種提供了機(jī)會(huì)。果肉顏色的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，在園藝植物果實(shí)中，類胡蘿卜素的合成場所被認(rèn)為是有色體，有色體具有多種形態(tài)，如球狀、結(jié)晶狀、膜狀、纖維狀和管狀等[20]。ZHANG等[21]通過透射電鏡觀察到在西瓜成熟果實(shí)中，紅色果肉中塌陷的有色體釋放出大量的色素小球，而在白色果肉中存在極少的色素體，并在西瓜果肉中鑒定到一種在有色體發(fā)育過程中起重要作用的 Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ClPHT4;2。近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，如BSA-seq技術(shù)等在越來越多的物種中得到應(yīng)用，如馬鈴薯[22]、草莓[23]、西瓜[24]等，為以后進(jìn)行更深入的研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段。目前西瓜果肉顏色的研究多集中在遺傳規(guī)律及類胡蘿卜素代謝合成基因方面，對(duì)于相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子及有色體等方面的研究仍需進(jìn)一步深入?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)西瓜果肉顏色的研究多集中在相關(guān)遺傳規(guī)律及控制西瓜紅色果肉的調(diào)控基因（如LCYB）上，對(duì)于控制西瓜果肉檸檬黃色的相關(guān)研究存在一定的不足。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)分別以白色果肉西瓜‘冰糖脆’和檸檬黃色果肉西瓜‘喜華’以及白色果肉西瓜‘薩省奶油瓜’和檸檬黃色果肉西瓜‘新金蘭選’兩組材料為親本構(gòu)建兩個(gè)六世代群體，通過親本果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期果肉中的類胡蘿卜素種類和含量測定、群體遺傳分析及利用BSA-seq分析進(jìn)行基因定位等工作的開展，找出與西瓜果肉檸檬黃色相關(guān)的調(diào)控基因，為西瓜新品種選育及分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于 2019年春季在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院新鄉(xiāng)試驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.1 試驗(yàn)材料

本研究選用‘冰糖脆’（Ⅰ P1，白色果肉）和‘喜華’（Ⅰ P2，檸檬黃色果肉）為第一組親本材料，‘薩省奶油瓜’（Ⅱ P1，白色果肉）和‘新金蘭選’（ⅡP2，檸檬黃色果肉）為第二組親本材料，分別通過親本雜交后自交獲得 F2分離群體，通過 F1與親本分別雜交得到Ⅰ BC1P1、Ⅱ BC1P1、Ⅰ BC1P2、Ⅱ BC1P2回交群體。利用這兩組瓤色材料分別構(gòu)建兩個(gè)六世代群體，Ⅰ F2（156株）、Ⅱ F2（343株）、Ⅰ BC1P1（51株）、Ⅰ BC1P2（104株）、Ⅱ BC1P1（81株）、Ⅱ BC1P2（77株）種植于2019年春季。材料全部種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院新鄉(xiāng)綜合試驗(yàn)基地，4份材料均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所多倍體西瓜課題組。材料以南瓜為砧木進(jìn)行嫁接育苗，移栽定植行間距1.5 m，株間距0.8 m，雙蔓整枝，選擇第二雌花節(jié)位進(jìn)行自交授粉，西瓜雌花、雄花在開花前1 d下午進(jìn)行套帽，在次日上午8:00—10:00進(jìn)行人工授粉，掛牌標(biāo)記授粉日期。田間灌溉、施肥、病蟲害防治等栽培管理方式一致。在果實(shí)發(fā)育過程中分別對(duì)授粉后10、18、26和34 d的果實(shí)進(jìn)行取樣，挑選3個(gè)長勢(shì)一致且無機(jī)械損傷的果實(shí)進(jìn)行縱切取樣2份，分別用于RNA提取和色素測定，迅速在液氮中冷凍后保存于-80℃冰箱，待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 類胡蘿卜素提取與檢測 參考李明月等[25]的方法進(jìn)行類胡蘿卜素提取，稱取冷凍干燥后成熟西瓜果肉粉末0.5—1.0 g于50 mL離心管中，加15 mL類胡蘿卜素提取液（正己烷﹕丙酮﹕無水乙醇=2﹕1﹕1），渦旋振蕩混勻；磨樣機(jī)劇烈振蕩6 min后4 000 r/min離心10 min，轉(zhuǎn)移上清至另一50 mL離心管，沉淀繼續(xù)用 15 mL色素提取液重復(fù)提取兩次至無色（共提取3次，上清轉(zhuǎn)移至同一離心管中）；合并上清液，上清液在 50 mL的分液漏斗中用飽和 NaCl（10%）水溶液反復(fù)洗3次至中性，棄下層（水層）；將上清液分批次轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，真空濃縮干。真空濃縮后用2 mL MTBE（含0.1% BHT）復(fù)溶，再加2 mL 10% KOH-甲醇溶液（含0.01% BHT），避光條件下皂化10 h；皂化結(jié)束后加4 mL飽和NaCl水溶液和2 mL MTBE（含0.01% BHT）使其更好地分層，棄水層，再加3次5 mL飽和NaCl水溶液洗至中性；將剩下的色素上清液分批次轉(zhuǎn)移至2 mL離心管中，真空濃縮至干并保存于-80℃冰箱用于HPLC檢測。

將保存于-80℃的樣品加300 μL MTBE（含0.01% BHT）溶解后，13 000 r/min離心30 min，過0.22 μm有機(jī)濾膜，轉(zhuǎn)移到進(jìn)樣瓶中，用于高效液相色譜檢測；用乙腈﹕甲醇=3﹕1（A相，含0.01% BHT）和100% MTBE（B相，含0.01% BHT）洗脫類胡蘿卜素；流動(dòng)相配好后放超聲儀中，超聲 30 min，除去氣泡。檢測時(shí)流速為 1 mL·min-1，進(jìn)樣量 5 μL；洗脫梯度為 0 min：A-B（95﹕5）；0—10 min：A-B（95﹕5）；10—19 min：A-B（86﹕14）；19—35 min：A-B（75﹕25）；35—47 min：A-B（50﹕50）；47—50 min：A-B（95﹕5）。樣品中的類胡蘿卜素通過YMC C30類胡蘿卜素柱（4.6 mm×150 mm，3 μm，YMC，Wilmington，NC，USA）和Waters 2695高效液相色譜儀進(jìn)行檢測和定量，該液相色譜儀配備有2489 UV/Vis檢測器、717 plus自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower 3色譜管理軟件，色譜柱檢測柱溫為30℃。用于類胡蘿卜素提取和檢測的各種有機(jī)試劑均為色譜級(jí)試劑（≥99.9%）。

1.2.2 西瓜果肉顏色性狀的鑒定與統(tǒng)計(jì) 在果實(shí)成熟期，對(duì)親本及群體單株西瓜果肉顏色進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)并拍照記錄。果肉顏色主要通過3個(gè)人在相同視覺角度下進(jìn)行肉眼鑒定。本研究親本材料果肉顏色為白色和檸檬黃色，后代分離群體果肉顏色性狀為非檸檬黃色（白色+淡黃色）和檸檬黃色，根據(jù)表型鑒定結(jié)果，統(tǒng)計(jì)果肉顏色性狀分離比，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，以明確瓤色性狀在各群體中的分離情況。

1.2.3 DNA提取和混池構(gòu)建 試驗(yàn)采用 BSA-seq建庫，在兩個(gè)F2分離群體中各選擇30株與親本果肉顏色相同的白色和檸檬黃色果肉植株，對(duì)4個(gè)親本材料及篩選出的F2極端性狀單株的基因組DNA進(jìn)行提取，基因組DNA提取采用改良CTAB法。一個(gè)BSA-seq包括兩個(gè)親本池和2個(gè)F2極端性狀混池（白色和檸檬黃色果肉），本研究共構(gòu)建了兩個(gè) BSA-seq群體：BSA-seq Ⅰ和BSA-seq Ⅱ。在北京百邁克生物有限公司進(jìn)行建庫和測序，試驗(yàn)流程按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)protocol執(zhí)行，包括樣品檢測、文庫構(gòu)建、文庫質(zhì)量檢測、上機(jī)測序。

1.2.4 關(guān)聯(lián)分析與候選基因挖掘 重測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控及過濾后，利用bwa軟件將測序reads重新定位到西瓜參考基因組‘97103’V2版本進(jìn)行比對(duì)。利用GATK、SnpEff等工具對(duì)得到的SNP、InDel進(jìn)行檢測和注釋，然后進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。通過ED法（歐氏距離算法）和SNP-index進(jìn)行SNP關(guān)聯(lián)分析，通過ED法和InDel-index進(jìn)行InDel關(guān)聯(lián)分析，綜合各種關(guān)聯(lián)分析結(jié)果取交集獲得控制目標(biāo)性狀的候選區(qū)段。應(yīng)用BLAST[26]軟件對(duì)候選區(qū)間內(nèi)的編碼基因進(jìn)行多個(gè)數(shù)據(jù)庫（GO[27]、KEGG[28]、COG[29]）的深度注釋。通過詳細(xì)的注釋，快速篩選候選基因，初步獲得控制西瓜果肉顏色的候選基因。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 根據(jù)葫蘆科網(wǎng)站‘97103’V2基因組數(shù)據(jù)庫（http://cucurbitgenomics.org/organism/21）中的相關(guān)基因序列，在NCBI網(wǎng)站中的Primer-blast程序中設(shè)計(jì)所需引物，由河南尚亞生物技術(shù)有限公司合成。引物序列、基因登錄號(hào)見表 1。利用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的 HiScript?III RT SupperMix for qPCR(+gDNA wiper)反轉(zhuǎn)錄試劑盒及 Universal SYBR?qPCR Master Mix試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。以CIACT為內(nèi)參基因[30]，采用2-△△ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。每組試驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primers for quantitative real PCR

2 結(jié)果

2.1 西瓜果實(shí)發(fā)育過程中的果肉顏色變化

試驗(yàn)材料果實(shí)各個(gè)發(fā)育時(shí)期的果肉顏色變化如圖1所示，隨著果實(shí)的發(fā)育，果實(shí)不斷膨大，果肉顏色不斷變化，‘喜華’和‘新金蘭選’果實(shí)發(fā)育過程中果肉檸檬黃色不斷加深，在成熟期形成了獨(dú)特的檸檬黃色；‘冰糖脆’和‘薩省奶油瓜’果實(shí)發(fā)育過程中果肉顏色在種子部位有些許發(fā)黃，但整體顏色為白色。

2.2 果實(shí)發(fā)育過程中的類胡蘿卜素種類和含量測定

2.2.1 西瓜白色和檸檬黃色果肉中紫黃質(zhì)含量 利用HPLC對(duì)兩種瓤色果肉中的類胡蘿卜素組分和含量進(jìn)行測定（圖2）。結(jié)果表明，授粉后10 d（10 DAP）的西瓜白色和檸檬黃色果肉中均可檢測到紫黃質(zhì)存在，含量分別為（3.14±1）和（3.11±1）μg·g-1DW，且紫黃質(zhì)含量無明顯差異。隨著果實(shí)的發(fā)育，白色果肉西瓜材料成熟期的果實(shí)中紫黃質(zhì)含量能夠達(dá)到（10.96±4）μg·g-1DW，檸檬黃色果肉中紫黃質(zhì)含量能夠達(dá)到（22.84 ±2）μg·g-1DW。

2.2.2 西瓜白色和檸檬黃色果肉中葉黃素含量 10 DAP時(shí)，僅在檸檬黃色果肉材料‘新金蘭選’中檢測到葉黃素（1.02 μg·g-1DW），18 DAP時(shí)在兩種瓤色材料中均檢測到葉黃素含量為（2.27±1）μg·g-1DW。隨著果實(shí)的發(fā)育，白色果肉中葉黃素含量能夠達(dá)到（2.23±1）μg·g-1DW，檸檬黃色果肉中葉黃素含量為（3.97±1）μg·g-1DW。

綜上所述，在兩組西瓜白色和檸檬黃色果肉材料中都主要積累紫黃質(zhì)和葉黃素，且紫黃質(zhì)含量在這兩種瓤色西瓜果肉中占主要地位；在同一顏色西瓜果肉中，紫黃質(zhì)含量是葉黃素含量的5—7倍。此外，西瓜檸檬黃色果肉中紫黃質(zhì)含量是西瓜白色果肉的 2倍左右，葉黃素含量在檸檬黃色和白色果肉中的積累量均不高，但是檸檬黃色果肉中的葉黃素含量顯著高于白色果肉。

2.3 西瓜果肉顏色的遺傳分析

西瓜果肉顏色田間表型各世代分離鑒定統(tǒng)計(jì)如表2，兩個(gè)F1群體中西瓜果肉顏色均表現(xiàn)為非檸檬黃色，在兩個(gè)F2后代分離群體中，西瓜非檸檬黃色與檸檬黃色果肉分離比例經(jīng)卡方檢驗(yàn)均符合 3﹕1的孟德爾分離比例（χ2=0.13及 χ2=0.02<χ20.05=3.841），Ⅰ BC1P1、Ⅱ BC1P1群體中西瓜果肉顏色全為非檸檬黃色，ⅠBC1P2、Ⅱ BC1P2群體中西瓜果肉非檸檬黃色和檸檬黃色的分離比符合 1﹕1的理論比（χ2=0.62及χ2=0.03<χ20.05=3.841）。遺傳規(guī)律分析表明，西瓜果肉檸檬黃色對(duì)白色為隱性性狀。

表2 兩個(gè)六世代分離群體的果肉顏色表型統(tǒng)計(jì)Table 2 Phenotypic statistics of flesh color in two six generation populations

2.4 西瓜果肉顏色的基因定位

2.4.1 Illumina HiSeq測序結(jié)果 兩個(gè)BSA-seq群體各獲得130.90 Gb數(shù)據(jù)量，過濾后得到的Clean Bases為129.73 Gb，Q30達(dá)到80%，平均每個(gè)樣品測序深度76.31X。樣品與參考基因組平均比對(duì)效率為98.84%，平均覆蓋深度為36.62X，基因組覆蓋度為99.73%（至少一個(gè)堿基覆蓋）。測序結(jié)果表明數(shù)據(jù)合格，可以繼續(xù)后續(xù)基因定位工作。

2.4.2 BSA-seq Ⅰ SNP和InDel關(guān)聯(lián)分析 分別利用ED和SNP-index關(guān)聯(lián)算法對(duì)BSA-seq Ⅰ數(shù)據(jù)進(jìn)行分析（圖 3），對(duì)利用兩種算法得到的候選區(qū)段取交集，SNP關(guān)聯(lián)分析得到一個(gè)長度為2.3 Mb的區(qū)間，在參考基因組上的位置為 Chr 06（23.09—25.16 Mb，25.25—25.48 Mb）。InDel關(guān)聯(lián)分析得到一個(gè)長度為0.61Mb的區(qū)間，在參考基因組上的位置為 Chr 06（24.00—24.61 Mb）。對(duì)SNP和InDel的關(guān)聯(lián)區(qū)域取交集，最終共得1個(gè)與性狀相關(guān)的候選區(qū)域，在參考基因組上的位置為Chr 06（24.00—24.61 Mb），總長度為0.61 Mb，在關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)通過多個(gè)數(shù)據(jù)庫比對(duì)共注釋到70個(gè)基因，其中非同義突變基因8個(gè)，移碼突變基因1個(gè)。

2.4.3 BSA-seq Ⅱ SNP和InDel關(guān)聯(lián)分析 采用與BSA-seq Ⅰ數(shù)據(jù)相同的分析方法對(duì) BSA-seq Ⅱ數(shù)據(jù)分別進(jìn)行SNP和InDel關(guān)聯(lián)分析（圖4）。SNP關(guān)聯(lián)分析得到一個(gè)2.78 Mb大小的區(qū)間，在參考基因組上的位置為Chr 06（23.55—26.33 Mb）；InDel關(guān)聯(lián)分析得到一個(gè)大小為2.53 Mb的區(qū)間，在參考基因組上的位置為Chr 06（23.80—26.33 Mb）。對(duì)SNP和InDel的關(guān)聯(lián)區(qū)域取交集，最終共得1個(gè)與性狀相關(guān)的候選區(qū)域，在參考基因組上的位置為Chr 06（23.80—26.33 Mb），長度為2.53 Mb。關(guān)聯(lián)區(qū)域內(nèi)共注釋到基因264個(gè)，其中非同義突變基因16個(gè)，移碼突變基因1個(gè)。

2.4.4 兩個(gè)BSA-seq結(jié)果分析 通過SNP和InDel關(guān)聯(lián)分析最終獲得1個(gè)與性狀相關(guān)的候選區(qū)域，定位在6號(hào)染色體24.00—24.61 Mb處，BSA-seq Ⅱ通過SNP和InDel關(guān)聯(lián)分析最終獲得1個(gè)與性狀相關(guān)的候選區(qū)域，定位在6號(hào)染色體23.80—26.33 Mb處。

由兩個(gè)BSA-seq結(jié)果可知（表3），這兩個(gè)候選區(qū)間存在包含關(guān)系，BSA-seq Ⅱ分析得到的候選區(qū)段包含BSA-seq Ⅰ分析中的候選區(qū)段。綜合BSA-Seq結(jié)果及兩個(gè)回交群體遺傳規(guī)律分析，可以初步判斷這兩個(gè)BSA-seq分析定位的應(yīng)是同一個(gè)與西瓜果肉顏色形成有關(guān)的基因。因此，根據(jù)兩個(gè) BSA-seq分析結(jié)果將控制西瓜果肉檸檬黃色的主效位點(diǎn)定位于 6號(hào)染色體24.00—24.61 Mb處，總長度為 0.61 Mb（即BSA-seq Ⅰ分析關(guān)聯(lián)區(qū)域），注釋到的基因見表4。

表3 BSA-seqⅠ和BSA-seq Ⅱ關(guān)聯(lián)區(qū)域信息統(tǒng)計(jì)表Table 3 BSA-seqⅠ and BSA-seq Ⅱ statistical table of candidate region

表4 候選區(qū)間內(nèi)的功能基因注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)Table 4 The statistical results of gene function annotation in candidate regions

2.5 候選區(qū)域的基因功能注釋

通過KEGG、GO、COG等多個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)候選區(qū)間內(nèi)的編碼基因進(jìn)行深度注釋，通過詳細(xì)的注釋，快速篩選基因，獲得與目標(biāo)性狀相關(guān)的基因。根據(jù)參考基因組注釋結(jié)果共得到6個(gè)與西瓜果肉顏色形成有關(guān)的基因（表5）。Cla97C06G121680在西瓜參考基因組中被注釋為APO protein 2，是一種與光系統(tǒng)Ⅰ積累相關(guān)的葉綠體編碼蛋白。Cla97C06G121700被注釋為核酸相關(guān)蛋白及葉綠體（Nucleoid-associated protein，chloroplastic），是一種與葉綠體有關(guān)的核酸相關(guān)蛋白，數(shù)據(jù)庫BLAST結(jié)果表明，該基因與擬南芥中STIC 2同源。Cla97C06G121890的注釋結(jié)果為四肽重復(fù)序列（TPR）樣超家族蛋白亞型1（Tetratricopeptide repeat(TPR)-like superfamily protein isoform 1），通過基因注釋及同源性比較發(fā)現(xiàn)，該基因與葉綠體大小有關(guān)。Cla97C06G121680、Cla97C06G121700和Cla97C06G121890等3個(gè)基因都與葉綠體發(fā)育相關(guān)，而有色體可以由葉綠體轉(zhuǎn)化而來[31]，因此，這3個(gè)基因可能通過影響有色體的形成進(jìn)而影響西瓜果肉顏色。Cla97C06G121910是一種響應(yīng)乙烯合成的 AP2轉(zhuǎn)錄因子，與果實(shí)成熟密切相關(guān)，而西瓜果肉顏色隨著果實(shí)的成熟不斷發(fā)生變化，該轉(zhuǎn)錄因子通過影響西瓜果實(shí)成熟進(jìn)而影響果肉中類胡蘿卜素的積累。Cla97C06G122090的注釋結(jié)果為 tetraspanin-8-like，具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用，在植物發(fā)育中具有重要作用；Cla97C06G122110注釋信息為WAT1相關(guān)蛋白（Wall are thin 1-WAT1-related protein），屬于WAT1類基因，具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性。擬南芥中WAT1參與植物次生細(xì)胞壁的發(fā)生并且具有促進(jìn)生長素運(yùn)輸?shù)哪芰?，尤其是具有植物液泡膜的生長素轉(zhuǎn)運(yùn)體功能[32]。這兩個(gè)基因可能在色素組分的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用。因此，推測這6個(gè)基因與西瓜果肉顏色的形成有關(guān)，其中Cla97C06G122110是非同義突變基因。

表5 候選基因功能注釋結(jié)果Table 5 Functional annotation of candidate genes

2.6 果實(shí)發(fā)育過程中 6個(gè)候選基因在西瓜白色和檸檬黃色果肉中的表達(dá)

篩選出的6個(gè)候選基因在4份材料4個(gè)發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量如圖5所示。根據(jù)熒光定量結(jié)果，各個(gè)基因在果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。APO protein 2（Cla97C06G121680）在西瓜檸檬黃色果肉（‘喜華’和‘新金蘭選’）中的表達(dá)量總趨勢(shì)為先升后降，在26 DAP時(shí)表達(dá)量最高，顯著高于白色果肉（‘冰糖脆’和‘薩省奶油瓜’）中的表達(dá)量；Nucleoidassociated protein，chloroplastic（Cla97C06G121700）在檸檬黃色果肉中的表達(dá)隨著果實(shí)成熟不斷升高，34 DAP時(shí)在檸檬黃色果肉中的表達(dá)量顯著高于白色果肉；Tetratricopeptide repeat (TPR)-like superfamily protein isoform 1（Cla97C06G121890）在西瓜檸檬黃色果肉中的表達(dá)量在26 DAP時(shí)最高，從18 DAP后，該基因在檸檬黃色果肉中的表達(dá)量顯著高于在白色果肉中的表達(dá)；AP2-like ethylene-responsive transcription factor family（Cla97C06G121910）在各個(gè)發(fā)育時(shí)期西瓜檸檬黃色果肉中的表達(dá)量顯著高于白色果肉；tetraspanin-8-like（Cla97C06G122090）在 10—26 DAP的白色果肉材料中的表達(dá)量顯著高于檸檬黃色果肉，且白色果肉中的表達(dá)量在26 DAP時(shí)達(dá)到最高，隨后下降；Wall are thin 1-WAT1-related protein（Cla97C06G122110）在4種材料不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)無明顯規(guī)律。

根據(jù)6個(gè)候選基因在兩組材料中的相對(duì)表達(dá)量可對(duì)候選基因進(jìn)行進(jìn)一步篩選，Cla97C06G122110即Wall are thin 1-WAT1-related protein在兩組瓤色材料中的表達(dá)量無明顯規(guī)律，因此不考慮該基因作為候選基因，最終確定5個(gè)候選基因。

3 討論

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素，在高等植物中，類胡蘿卜素的主要存在形式有 β-胡蘿卜素、葉黃素、番茄紅素、β-隱黃質(zhì)、八氫番茄紅素、六氫番茄紅素等，在果實(shí)顏色及花瓣呈色方面占據(jù)重要地位，番茄、柑橘、菊花、百合等果實(shí)和花卉中豐富的類胡蘿卜素導(dǎo)致了植物的顏色多樣化[33]。柑橘類果實(shí)是富含類胡蘿卜素的水果，不同品種的柑橘果實(shí)中的類胡蘿卜素成分表現(xiàn)出很大的多樣性，且在果實(shí)各個(gè)部位積累的含量各不相同[34]。劉慶[35]通過對(duì)黃肉‘暗柳’橙及其紅肉突變體‘紅暗柳’橙成熟果實(shí)中的色素組成研究發(fā)現(xiàn)，黃肉橙中主要積累葉黃素、β-隱黃素和紫黃質(zhì)，紅肉橙中主要積累番茄紅素。研究表明番茄果實(shí)中至少含有12種類胡蘿卜素，在其成熟果實(shí)中主要有番茄紅素、β-胡蘿卜素和葉黃素，其中番茄紅素占主導(dǎo)地位[36]。CAO等[37]對(duì)白肉桃‘Hujing’和黃肉桃‘Jinli’中的類胡蘿卜素含量進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)黃肉桃中的類胡蘿卜素含量遠(yuǎn)高于白肉桃，且主要積累葉黃素、玉米黃素、β-隱黃質(zhì)和β-胡蘿卜素。西瓜果肉顏色主要與類胡蘿卜素組分和含量的差異有關(guān)。TADMOR等[38]發(fā)現(xiàn)紅瓤西瓜果肉中主要含有番茄紅素，橙黃瓤品種‘NY162003’中含有大量β-胡蘿卜素及少量的番茄紅素；LIU等[11]發(fā)現(xiàn)在黃色果肉中主要含紫黃質(zhì)和葉黃素，這與本研究檸檬黃色果肉材料中的類胡蘿卜素組分相符。本研究對(duì)兩個(gè)西瓜白色果肉材料（‘冰糖脆’和‘薩省奶油瓜’）不同發(fā)育時(shí)期果肉中的類胡蘿卜素組分和含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)西瓜白色果肉中積累的類胡蘿卜素組分與檸檬黃色果肉相同，主要是紫黃質(zhì)和葉黃素。根據(jù)色素含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同一瓤色西瓜果肉中，紫黃質(zhì)含量顯著高于葉黃素含量，表明紫黃質(zhì)在西瓜白色和檸檬黃色果肉中占有主要地位。在西瓜果實(shí)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，西瓜檸檬黃色果肉中紫黃質(zhì)含量約是白色果肉中的 2倍，葉黃素含量也明顯高于白色果肉。因此，推測西瓜果肉檸檬黃色的形成是紫黃質(zhì)和葉黃素共同積累的結(jié)果，當(dāng)這兩種色素積累達(dá)到一定量時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致果實(shí)顏色變黃，但是積累量的多少以及相關(guān)調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

目前高等植物中類胡蘿卜素相關(guān)代謝合成途徑已經(jīng)比較清晰明確，在很多研究中發(fā)現(xiàn)其受到類胡蘿卜素相關(guān)合成基因和酶的直接調(diào)控，此外也受到轉(zhuǎn)錄因子和環(huán)境等因子的調(diào)控。本研究構(gòu)建了兩個(gè) BSA-seq群體，分別利用2種算法對(duì)測序得到的高質(zhì)量SNP和InDel進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并綜合兩種關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果獲得最終的候選區(qū)段，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)BSA-seq群體得到的關(guān)聯(lián)結(jié)果區(qū)域存在包含關(guān)系，因此對(duì)兩個(gè)BSA-seq結(jié)果再取交集，最終得到6號(hào)染色體24.00—24.61 Mb，總長度0.61 Mb的區(qū)域。本研究利用兩組瓤色材料作為親本構(gòu)建了兩個(gè)BSA-seq群體對(duì)調(diào)控西瓜果肉檸檬黃色的基因進(jìn)行分析，增加了試驗(yàn)結(jié)果的可信度。

候選區(qū)域內(nèi)共有 70個(gè)具有注釋信息的基因，根據(jù)相關(guān)注釋信息及同源性分析共篩選出 6個(gè)的候選基因。對(duì)這 6個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，Cla97C06G121680為APO protein 2，屬于APO蛋白家族，是一類與光系統(tǒng)Ⅰ的積累相關(guān)的葉綠體蛋白編碼基因。該家族有 4個(gè)特定的基因群（APO1—APO4），水稻和擬南芥中的APO2均被定位在葉綠中，擬南芥中APO家族蛋白能夠干擾葉綠體或類囊體膜的發(fā)育[39]；Cla97C06G121700為葉綠體相關(guān)蛋白，在擬南芥中與STIC2同源，STIC2與葉綠體類囊體的生物發(fā)生相關(guān)[40]。Cla97C06G121890為TPR類基因，與擬南芥中REC基因同源，在猴面花中發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因（RCP2），該基因編碼一個(gè)與擬南芥葉綠體覆蓋率降低（REC）蛋白同源的 TPR蛋白，猴面花中的 RCP2被證明在猴面花的有色體發(fā)育和類胡蘿卜素合成中是必需的，且證明通過下調(diào) RCP2可以降低猴面花葉片葉綠素和類胡蘿卜素的含量以及葉綠體的覆蓋率[41]。這3個(gè)基因與葉綠體生物發(fā)生或類囊體的結(jié)構(gòu)相關(guān)，而有色體作為在果實(shí)中合成和積累大量類胡蘿卜素的主要場所被認(rèn)為主要來源于已有的葉綠體或其他非光合質(zhì)體，在許多花果發(fā)育中，葉綠體轉(zhuǎn)化為有色體，影響類胡蘿卜素的積累[42]。因此，推測這 3個(gè)基因參與西瓜果肉顏色形成。Cla97C06G121910屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族，AP2亞家族與乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白和 RAV亞家族共同構(gòu)成AP/ERF超家族，在乙烯反應(yīng)和病原菌抗性等多種過程中發(fā)揮重要作用。在番茄中發(fā)現(xiàn)一個(gè)最接近的AP2同源物AP2a在果實(shí)成熟過程中起著關(guān)鍵作用，AP2a在乙烯合成中除了負(fù)調(diào)控作用外，還具有正的成熟調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致一些與成熟相關(guān)的基因下調(diào)，如胡蘿卜素合成途徑基因，從而間接影響果實(shí)顏色[43]。Cla97C06G122090即 Tetraspanin-8 like，具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用，且能夠與其他物質(zhì)結(jié)合影響膜的結(jié)構(gòu)和功能[44]，從而會(huì)對(duì)色素分子的轉(zhuǎn)運(yùn)產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響果肉顏色。綜上所述，推測以上5個(gè)基因與西瓜果肉檸檬黃色的形成有關(guān)，在IGV中對(duì)這5個(gè)基因在4份材料中的相關(guān)突變進(jìn)行研究，未發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)和啟動(dòng)子發(fā)生變異，因此推測是由于一個(gè)或幾個(gè)基因的表達(dá)量差異造成西瓜果肉顏色的不同，但是這些基因的表達(dá)量是由哪些因子進(jìn)行調(diào)控的仍需進(jìn)一步深入研究。

本研究主要對(duì)控制西瓜果肉顏色（白色和檸檬黃色）的基因進(jìn)行初步定位并對(duì)候選基因進(jìn)行預(yù)測，為進(jìn)一步確定西瓜果肉顏色的相關(guān)調(diào)控基因奠定了基礎(chǔ)。下一步可開發(fā)與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，在子代（如F2分離群體）中篩選重組單株，逐步縮小候選區(qū)段，精準(zhǔn)定位目標(biāo)基因。

4 結(jié)論

在西瓜白色和檸檬黃色果肉中主要含有紫黃質(zhì)和葉黃素，且在兩組試驗(yàn)材料中的積累量具有明顯差異，即不同含量的色素造成果肉顏色的變化。遺傳分析表明西瓜果肉檸檬黃色對(duì)白色為隱性性狀。利用兩個(gè)BSA-seq群體分析將調(diào)控西瓜果肉檸檬黃色形成的一個(gè)主效位點(diǎn)定位于6號(hào)染色體24.00—24.61 Mb處，總長度為 0.61 Mb，結(jié)合基因注釋及熒光定量分析獲得Cla97C06G121680、Cla97C06G121700、Cla97C06G121890、Cla97C06G122090、Cla97C06G121910共5個(gè)與西瓜果肉檸檬黃色形成相關(guān)的候選基因。