張茹玉，葉 潘，李月潞，周 迎，陳秀奎，劉 樺

1.成都醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院(成都 610050)；2.成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心(成都 610050)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，它起源于乳腺導(dǎo)管內(nèi)上皮或乳腺腺泡上皮細(xì)胞惡變，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是其致死的主要原因之一[1-2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)是乳腺癌細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵起始步驟[3]。EMT途徑可幫助乳腺癌細(xì)胞獲得間充質(zhì)表型[4]，使癌細(xì)胞遠(yuǎn)離原發(fā)病灶并轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處淋巴結(jié)或其他器官[5]。該途徑是乳腺癌細(xì)胞獲得侵襲能力及發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要生物學(xué)過程[6]，是乳腺癌細(xì)胞啟動(dòng)轉(zhuǎn)移最重要的機(jī)制[7]。在乳腺癌EMT過程中，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetallo-proteinases，MMPs)發(fā)揮了重要作用[8]。MMPs是一類鋅離子依賴性的蛋白水解酶，可降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularma-matrix，ECM)[9]，誘發(fā)EMT，為乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件[10]。MMP-9蛋白又稱明膠酶，是MMPs家族的重要成員之一，可降解ECM中的明膠、Ⅳ型和Ⅴ型膠原等主要成分[11]，破壞ECM和基底膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)癌細(xì)胞向周圍組織浸潤，幫助腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[12]，協(xié)同EMT途徑[13]。因此，MMP-9抑制劑為乳腺癌的治療開辟了一條新途徑。傳統(tǒng)抗癌藥物開發(fā)周期長，投入資金量大[14]，若能利用現(xiàn)有小分子藥物配體進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)，可提高新藥物開發(fā)效率[15]。三維定量構(gòu)效關(guān)系(three-dimensional quantitative structure-relationship，3D-QSAR)研究可利用藥物分子結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性[16]，通過計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)模擬運(yùn)算和預(yù)測，指導(dǎo)新型藥物的設(shè)計(jì)、改造和優(yōu)化，相比傳統(tǒng)藥物的研制更有針對性、高效性[17]，可為MMP-9抑制劑的研發(fā)及治療乳腺癌提供思路。

目前，關(guān)于氧肟酸類MMP-9抑制劑3D-QSAR與分子設(shè)計(jì)相關(guān)研究還鮮見報(bào)道。本研究將經(jīng)典的3D-QSAR技術(shù)即比較分子力場分析(comparative molecular field analysis，CoMFA)和第二代3D-QSAR技術(shù)即Topomer-CoMFA兩種方法聯(lián)合運(yùn)用構(gòu)建3D-QSAR模型，確保新建模型的穩(wěn)定性與可靠性。依托Topomer search技術(shù)的側(cè)鏈相似性搜索[18]，參考3D-QSAR模型提供的模型預(yù)測和三維等勢圖信息，構(gòu)建新的氧肟酸類MMP-9抑制劑分子，以證明此分子設(shè)計(jì)的方法，可為新型高效抑制劑的研發(fā)、抑制劑結(jié)構(gòu)的優(yōu)化與設(shè)計(jì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源與分子結(jié)構(gòu)的優(yōu)化

本文用于分子設(shè)計(jì)研究的氧肟酸類MMP-9抑制劑均參考文獻(xiàn)[19]，各化合物結(jié)構(gòu)與活性如下所示。使用SYBYLX 1.1軟件中的Sketch模塊和Compute模塊對小分子抑制劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)與數(shù)據(jù)表單構(gòu)建，選擇相應(yīng)的電荷與能量進(jìn)行優(yōu)化，將表示分子活性值的半抑制濃度(IC50)轉(zhuǎn)化成pIC50(pIC50=-lgIC50)(圖1、表1)[20]。

圖1 氧肟酸類MMP-9抑制劑的骨架結(jié)構(gòu)

表1 氧肟酸類MMP-9抑制劑的結(jié)構(gòu)與活性

(續(xù)表)

1.2 CoMFA和Topomer-CoMFA的建模

分別采用CoMFA和Topomer-CoMFA技術(shù)對氧肟酸類MMP-9抑制劑進(jìn)行定量構(gòu)效研究，從構(gòu)建的分子表單中隨機(jī)選取24個(gè)抑制劑作為訓(xùn)練集，8個(gè)抑制劑作為測試集。CoMFA模型選取特征性的公共骨架進(jìn)行疊合，Topomer-CoMFA模型進(jìn)行R基團(tuán)片段切割。

1.3 3D-QSAR模型的驗(yàn)證

用新建CoMFA模型和Topomer-CoMFA模型分別對訓(xùn)練集化合物和測試集化合物活性進(jìn)行內(nèi)部測試和外部測試，計(jì)算實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值之間的活性差值。根據(jù)兩個(gè)模型訓(xùn)練集的實(shí)驗(yàn)活性值、預(yù)測活性值和測試集的預(yù)測活性值構(gòu)建活性擬合圖，以驗(yàn)證新建3D-QSAR模型的穩(wěn)定性、內(nèi)部和外部預(yù)測能力[21]。

1.4 虛擬篩選

基于Topomer-CoMFA的split模塊進(jìn)行分子切割，獲得分子側(cè)鏈基團(tuán)(R1基團(tuán))和分子骨架(R2基團(tuán))。以R1基團(tuán)作為分子活性特征性基團(tuán)，結(jié)合Topomer search技術(shù)對ZINC數(shù)據(jù)庫(2012)中的Fragment-like類(34 292個(gè))分子進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)相似性搜索。根據(jù)Topomer distance值(默認(rèn)設(shè)為185)來判斷并篩選出有特定貢獻(xiàn)的R1基團(tuán)[22]，以活性最高的21號分子為模版進(jìn)行過濾，挑選貢獻(xiàn)值明顯高于R1基團(tuán)的側(cè)鏈基團(tuán)。將挑選出的側(cè)鏈基團(tuán)交替取代模版分子對應(yīng)的R1基團(tuán)，以構(gòu)建新的抑制劑分子。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用偏最小二乘法進(jìn)行交叉驗(yàn)證系數(shù)計(jì)算q2值，留一法進(jìn)行擬合驗(yàn)證系數(shù)計(jì)算r2值，得到最佳組成成分(n)、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEE)和Fisher檢驗(yàn)值(F)[23]。

2 結(jié)果

2.1 3D-QSAR模型結(jié)果

分子疊合和分子切割是建立3D-QSAR模型的關(guān)鍵步驟，CoMFA模型的分子疊合圖和Topomer-CoMFA模型的分子切割圖(圖2～3)。兩種技術(shù)所建立3D-QSAR模型的各統(tǒng)計(jì)學(xué)參數(shù)匯總分析結(jié)果顯示，兩種模型都具良好的穩(wěn)定性和較高的可信度(q2>0.5,r2>0.9,F>100,SEE<0.1)(表2)。

圖2 CoMFA模型的分子疊合圖

圖3 Topomer-CoMFA模型的切割方式

表2 CoMFA和Topomer-CoMFA建模結(jié)果

圖4 模型的線性回歸圖

2.2 三維等勢圖結(jié)果

選取CoMFA模型中21號分子作為模版進(jìn)行立體場與靜電場的三維等勢圖分析。在立體場三維等勢圖中，分子側(cè)鏈旁的綠色模塊表明在此處引入大空間占位基團(tuán)更有利于增加抑制劑化合物活性；黃色模塊表明在此處引入大空間占位基團(tuán)不利于增加抑制劑化合物活性。在苯基3號位旁有較大的綠色模塊，提示此處若有較大空間占位的基團(tuán)有利于增加化合物活性。

靜電場三維等勢圖中，紅色模塊表明在此處引入負(fù)性基團(tuán)有利于抑制劑化合物活性的增加；藍(lán)色模塊表明在此處引入正性基團(tuán)有利于抑制劑化合物活性的增加。在苯基4號位旁邊有較大的紅色模塊，提示此處有負(fù)性作用強(qiáng)的基團(tuán)有利于化合物活性的增加(圖5)。

圖5 三維等勢圖

2.3 分子設(shè)計(jì)結(jié)果

依托Topomer search技術(shù)的虛擬篩選，并結(jié)合新建模型的三維等勢圖和活性預(yù)測能力，以活性最高21號分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，進(jìn)行梯度分子設(shè)計(jì)。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)的Topomer distance值和貢獻(xiàn)度值(>1)來評價(jià)化合物與訓(xùn)練集化合物結(jié)構(gòu)的相似度，以篩選出的基團(tuán)替換模板分子原有的R1基團(tuán)，初步重構(gòu)6個(gè)新抑制劑化合物。再依據(jù)分子結(jié)構(gòu)的三維等勢圖，分析新建分子R1基團(tuán)的立體場和靜電場對分子活性的影響。用新建CoMFA模型和Topomer-CoMFA模型對新抑制劑進(jìn)行分子活性預(yù)測，保留分子活性>21號分子的化合物結(jié)構(gòu)，最終使用梯度分子設(shè)計(jì)的方法構(gòu)建出2個(gè)高活性的氧肟酸類MMP-9化合物。新抑制劑的分子結(jié)構(gòu)與預(yù)測活性值如下(表3)。

表3 新設(shè)計(jì)分子的結(jié)構(gòu)及活性預(yù)測值

3 討論

乳腺癌發(fā)病率逐年增長，其發(fā)病率已占女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位[24]。乳腺癌不僅對女性造成身心痛苦，而且給患者家庭、社會(huì)帶來經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌惡化的致命因素，而EMT途徑與MMP-9的協(xié)同作用可加速乳腺癌惡化[25]。因此，尋求安全、經(jīng)濟(jì)、有效的抗乳腺癌藥物(如MMP-9類抑制劑)治療方法，已成為醫(yī)學(xué)界以及乳腺癌患者非常關(guān)心的問題。

為獲得高效、新穎的分子設(shè)計(jì)方法，本研究運(yùn)用第一代CoMFA技術(shù)和第二代Topomer-CoMFA技術(shù)對氧肟酸類MMP-9抑制劑進(jìn)行3D-QSAR研究[26]。結(jié)果顯示，新建3D-QSAR模型具有良好的穩(wěn)定性和可信度。將CoMFA和Topomer-CoMFA模型所測的內(nèi)部預(yù)測活性值、外部預(yù)測活性值和化合物實(shí)驗(yàn)活性值進(jìn)行線性回歸，實(shí)驗(yàn)值與預(yù)測值有良好的擬合度，模型外部預(yù)測能力比較理想，可用于后續(xù)MMP-9抑制劑的分子設(shè)計(jì)與活性預(yù)測。

模型的三位等勢圖可從分子立體場、靜電場等方面對分子設(shè)計(jì)提供幫助。結(jié)合獲得的立體場三位等勢圖分析，15、17、27號分子(pIC50=8.1～8.6)有較高的活性，得益于苯基3號位引入了立體場作用更大的硝基、羧基等基團(tuán)，在增加立體場同時(shí)，也有利于抑制劑化合物活性的增加。從靜電場三位等勢圖研究發(fā)現(xiàn)，21號分子有5個(gè)氟基團(tuán)，4號、5號分子也有多個(gè)氟基團(tuán)，這些氟基團(tuán)提供了強(qiáng)大的負(fù)性作用，同時(shí)也提高了分子活性。17、26、28、29號分子(pIC50=8.16～8.6)有較高的活性，得益于苯基3號位引入了負(fù)性作用強(qiáng)的硝基、甲氧基等基團(tuán)，增加了負(fù)性靜電場及抑制劑化合物的活性。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，分子結(jié)構(gòu)多樣性、活性上的差異主要來自于R1側(cè)鏈基團(tuán)的變化。采用Topomer search技術(shù)，從小分子數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基于側(cè)鏈基團(tuán)的虛擬篩選，參考3D-QSAR模型給出的靜電場與立體場三維等勢圖信息，結(jié)合CoMFA模型、Topomer-CoMFA模型的外部預(yù)測能力，設(shè)計(jì)了2個(gè)高活性的氧肟酸類MMP-9抑制劑分子。該結(jié)果發(fā)現(xiàn)，新抑制劑分子n1保留了模板21號分子R1基團(tuán)的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在苯環(huán)4號位的氟酸基團(tuán)不僅增加了n1分子的負(fù)性作用，也增加了R1基團(tuán)的立體場作用，這使得抑制劑活性增加。n2分子的苯環(huán)3號、4號位均加入正丙基基團(tuán)，增加了分子的整體空間結(jié)構(gòu)，提高了分子活性，但是活性稍低于n1分子。三維等勢圖信息顯示，靜電場對分子活性影響大于立體場，這與3D-QSAR模型給出的提示一致。結(jié)合CoMFA和Topomer-CoMFA模型建模結(jié)果可知，靜電場的貢獻(xiàn)度分別為63.6%、67.3%，立體場貢獻(xiàn)度分別為36.4%、32.7%，靜電場對活性的貢獻(xiàn)度占主導(dǎo)地位。對小分子進(jìn)行分子設(shè)計(jì)和結(jié)構(gòu)修飾改造時(shí)，研究者應(yīng)充分考慮靜電場與立體場的相互影響，分析基團(tuán)電荷性、側(cè)鏈空間結(jié)構(gòu)與能量匹配等因素。

綜上所述，本研究基于氧肟酸類MMP-9抑制劑進(jìn)行的CoMFA和Topomer-CoMFA定量構(gòu)效關(guān)系分析和Topomer search虛擬篩選的方法可用于MMP-9抑制劑的分子設(shè)計(jì)研究，為小分子藥物活性的提高、優(yōu)質(zhì)化合物結(jié)構(gòu)的改造與設(shè)計(jì)提供新的思路，為新型抗乳腺癌藥物篩選提供參考。