張 媛,關(guān) 靜，蔣 銳，肖雯婧，呼永河，侯 君△

1.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 放射診斷科(成都 610083)；2.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 藥劑科(成都 610083)；3.四川省中醫(yī)骨科與運(yùn)動(dòng)康復(fù)臨床醫(yī)學(xué)研究中心 (成都 610083)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP) 為臨床常見急重癥，具有發(fā)病急、病死率高、并發(fā)癥兇險(xiǎn)的特點(diǎn)，易導(dǎo)致心、肺、肝等多器官嚴(yán)重缺血、缺氧，甚至出現(xiàn)成人呼吸窘迫綜合征、急性肝功能衰竭、急性腎功能衰竭及休克[1-3]。已有研究[4]表明，SAP大鼠存在心臟結(jié)構(gòu)和功能改變，證明SAP可并發(fā)心肌損傷。SAP可引起炎癥因子的大量釋放，而炎癥因子的釋放與心肌功能障礙發(fā)生有關(guān)[5]。 炎性小體(NLRP3)通過激活效應(yīng)蛋白天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)，促進(jìn)白介素1-β(IL-1β)成熟與分泌，是固有免疫的重要構(gòu)成，主要參與炎癥反應(yīng)。主流研究[6-7]認(rèn)為，NLRP3 的激活與活性氧簇(ROS)的產(chǎn)生密切相關(guān)。研究SAP并發(fā)急性心肌損害(acute myocardial injury, AMI)具體機(jī)制對臨床救治此類患者具有重要意義。

左旋紫草素是從紫草科天然植物紫草中提取的一類萘醌化合物，具有抗炎、抗真菌和抗腫瘤等作用[8-10]。課題組前期實(shí)驗(yàn)[10]結(jié)果表明，左旋紫草素可抑制高糖心肌細(xì)胞壞死性凋亡，但其減輕SAP并發(fā)AMI的作用尚未見報(bào)道。本研究主要觀察SAP大鼠并發(fā)AMI時(shí)NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白的表達(dá)，并探討左旋紫草素減輕SAP并發(fā)AMI的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

肌酸激酶同Ⅰ酶(CK-MB)；腫瘤壞死因子(TNF-α)；IL-1β酶聯(lián)免疫吸附劑測定試劑盒、左旋紫草素、二氫乙錠(DHE)、Caspase-1、NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)及β-actin一抗購自美國Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、ECL化學(xué)發(fā)光底物、BCA蛋白定量盒及細(xì)胞裂解液購自武漢碧云天公司；L-精氨酸購自北京索萊寶科技有限公司；OCT包埋劑購自日本SAKURA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠24只，體重220～240 g，購于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.3 造模及給藥方法

大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)溫度、濕度和空氣清潔度的動(dòng)物房內(nèi)，造模前12 h禁食、不禁水。SAP造模方法：每只大鼠按照3.2 g/kg體重腹腔注射250 g/L的L-精氨酸2次，每次間隔1 h，第2次注射24 h后SAP模型造模成功。造模成功的SAP模型大鼠作為SAP模型組，假手術(shù)組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，左旋紫草素干預(yù)組為SAP小鼠腹腔注射20 mg/kg左旋紫草素。每組于造模后24 h收集血液、胰腺及心臟組織標(biāo)本。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附劑測定法

大鼠心臟取血2 mL，以離心半徑7 cm，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，離心10 min后取上清，按酶聯(lián)免疫吸附劑測定法試劑盒說明書檢測CK-MB、TNF-α、IL-1β水平。

1.5 HE染色

大鼠切取小部分左室心肌及胰腺，4%多聚甲醛固定、各濃度酒精梯度脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，觀察心肌及胰腺結(jié)構(gòu)變化。

1.6 心肌ROS檢測

大鼠切取左室心肌組織置入OCT包埋劑中，冰凍切片(厚度10 μm)，放置于含PBS的DHE (1.6 μmol/L) 溶液中37 ℃避光孵育30 min，在488 nm激發(fā)光，560～660 nm濾波處，使用激光共聚焦顯微鏡觀察并照相。

1.7 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)

大鼠左室心肌經(jīng)RIPA裂解液提取蛋白，BCA法定量蛋白，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜30 min。5% 脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Caspase-1、NLRP3、ASC以及β-actin一抗(1∶1 000)，4 ℃過夜；TBST洗膜，二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，ECL顯色，Image J 圖像分析軟件對曝光圖像進(jìn)行光密度分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色

2.1.1 胰腺組織 假手術(shù)組胰腺結(jié)構(gòu)正常；SAP模型組胰腺間質(zhì)水腫，可見一定炎性細(xì)胞表達(dá)，小葉輪廓被破壞類似孤島樣分布；左旋紫草素干預(yù)組胰腺β細(xì)胞水腫程度較SAP模型組明顯降低，炎性細(xì)胞減少，胰腺結(jié)構(gòu)趨于正常(圖1)。

圖1 各組胰腺 HE染色(×400)

2.1.2 心肌組織 假手術(shù)組心肌結(jié)構(gòu)正常；SAP模型組心肌腫脹明顯，肌纖維排列紊亂，肌膜破裂；左旋紫草素干預(yù)組較SAP模型組心肌腫脹程度減輕，橫紋較心肌纖維清晰，細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)趨于正常(圖2)。

圖2 各組心肌HE染色(×400)

2.2 大鼠血清CK-MB、TNF-α、IL-1β水平

SAP模型組大鼠血清CK-MB、TNF-α及IL-1β水平較假手術(shù)組明顯增高 (P<0.05) ；左旋紫草素干預(yù)組CK-MB、TNF-α、IL-1β水平較SAP模型組明顯下降 (P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠造模后 24 h 血清 CK-MB、TNF-α 、IL-1β水平變化比較

2.3 大鼠心肌Caspase-1、NLRP3、ASC蛋白水平

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)果顯示，SAP模型組大鼠心肌NLRP3、Caspase-1及ASC蛋白表達(dá)量較假手術(shù)組明顯增高(P<0.05)；左旋紫草素干預(yù)組大鼠心肌 NLRP3、Caspase-1及ASC蛋白表達(dá)量明顯低于SAP 模型組(P<0.05) (圖 3)。

圖3 各組心肌Caspase-1、NLRP3及ASC表達(dá)

2.4 心肌ROS含量

與假手術(shù)組相比，SAP模型組心肌組織氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，表現(xiàn)為DHE的熒光信號放大(P<0.05)；左旋紫草素干預(yù)組能明顯減少心肌組織內(nèi)ROS堆積(P<0.05)(圖4)。

圖4 各組心肌ROS水平(×400)

3 討論

當(dāng)心肌細(xì)胞膜完整性遭到破壞時(shí)，胞質(zhì)內(nèi)游離的CK-MB在3～6 h后可在外周血中檢測出異常[11]，使SAP從最初的局部胰腺炎癥擴(kuò)展為全身炎癥反應(yīng)，包括心臟、肝臟、腎臟等。心肌炎癥反應(yīng)是SAP并發(fā)AMI的最重要的病理表現(xiàn)之一。SAP早期，急性炎癥因子TNF-α足量產(chǎn)生并迅速升高，通過多種途徑加重心肌損傷，比如刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)分泌、促進(jìn)內(nèi)皮-白細(xì)胞黏附分子(ELAM-1)表達(dá)、誘導(dǎo)IL-6產(chǎn)生發(fā)揮細(xì)胞因子放大效應(yīng)、通過與其受體結(jié)合激活NF-KB通路等[12-14]。本研究結(jié)果表明，SAP早期存在較明顯的AMI，血清心肌特異性指標(biāo)CK-MB濃度升高，心肌細(xì)胞腫脹和間質(zhì)水腫程度增加。經(jīng)左旋紫草素干預(yù)治療后，SAP血清TNF-α水平和CK-MB濃度降低，同時(shí)也減輕了大鼠心肌損害的形態(tài)學(xué)改變，心肌細(xì)胞腫脹和間質(zhì)水腫程度得到明顯改善，阻斷了這一炎癥起始因子的破壞作用，保護(hù)了SAP并發(fā)AMI導(dǎo)致的急性心肌損傷，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SAP時(shí)心肌組織活性氧ROS的產(chǎn)生明顯增加，伴隨NLRP3炎性小體復(fù)合物中Caspase-1 活性及其下游產(chǎn)物IL-1β的含量明顯升高，表明NLRP3炎性小體在SAP并發(fā)AMI中扮演重要的作用；同時(shí)蛋白質(zhì)印跡技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí),NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)均升高，NLRP3炎性小體被過度活化，上述結(jié)果均表明ROS是NLRP3炎性小體激活調(diào)控的核心，過量的ROS可直接激活NLRP3炎性小體，是炎癥相關(guān)疾病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[15]，調(diào)控ROS有望成為控制NLRP3炎癥小體激活和治療炎癥相關(guān)疾病的重要靶點(diǎn)。

綜上所述，左旋紫草素減輕SAP 大鼠并發(fā)AMI的作用可能是通過抑制NLRP3炎性小體過度活化，降低心肌炎癥反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)，本研究為左旋紫草素可能成為NLRP3炎性小體的抑制劑奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。