趙 佳，姜 波，郭建麗，張丹洋，孫文輝，包永明，3*

（1 大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院 遼寧大連116024 2 大連理工大學(xué)盤錦產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 遼寧盤錦124221 3 大連理工大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 遼寧盤錦124221

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的代謝性骨病[1]。世界衛(wèi)生組織在2015年提出的《關(guān)于老齡化與健康的全球報告》指出，在國家和全球?qū)用嫔闲枰匦潞统掷m(xù)關(guān)注改善肌肉骨骼健康[2]。骨重建過程取決于維持成骨細(xì)胞形成骨基質(zhì)與破骨細(xì)胞消除骨礦化之間的平衡。成骨細(xì)胞響應(yīng)骨細(xì)胞產(chǎn)生的信號，并將破骨細(xì)胞前體募集到重塑部位，然后，通過骨保護(hù)素（OPG）/核因子κB 配體受體激活劑（RANKL）/核因子κB 受體激活劑（RANK）系統(tǒng)的受體激活劑，成骨細(xì)胞可調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生成[3]。

骨質(zhì)疏松癥主要是體內(nèi)維生素D 缺乏，鈣攝入量不足以及雌激素下降引起的。目前，人們普遍接受雌激素替代療法用于治療因缺乏雌激素的骨質(zhì)疏松癥患者。然而其有副作用，尤其是增加乳腺癌的風(fēng)險[4]。維生素D3（Vitamin D3，VD3）是骨形成系統(tǒng)中的重要參與者，在鈣穩(wěn)態(tài)中具有增加鈣從腸道吸收的功能[5]。飲食中攝入足夠的維生素D3是必要的，其廣泛存在于油性魚和鱈魚肝油中[6-7]。染料木素（Genistein，Gen）是常見的異黃酮植物雌激素化合物之一，在大豆中的含量豐富[8]，也是可食用的天然物質(zhì)，能夠有效降低副作用。

目前已有大量從細(xì)胞及動物水平上研究關(guān)于維生素D3或者染料木素對骨質(zhì)疏松癥的影響[5，9]。維生素D3及染料木素在促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化過程中存在協(xié)同作用[10]，協(xié)同誘導(dǎo)成骨細(xì)胞活化并阻止破骨細(xì)胞的分化[11]。適當(dāng)劑量的染料木素與鈣和維生素D3結(jié)合被視為預(yù)防和管理骨質(zhì)流失的一種新的潛在療法[12]。

本文在細(xì)胞水平上驗(yàn)證維生素D3和染料木素對治療骨質(zhì)疏松癥的協(xié)同作用，并研究維生素D3和染料木素在破骨細(xì)胞形成中的作用，為通過維生素D3治療骨質(zhì)疏松癥提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7、人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63，均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

DMEM 培養(yǎng)基（無酚紅）、Trizol 試劑、胰蛋白酶，上海生工生物有限公司；Western 及IP 細(xì)胞裂解液，碧云天生物技術(shù)；染料木素、維生素D3，維克奇生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma-Aldrich 公司；抗壞血酸、茜素紅S 染色液（1%，pH 4.2）、西吡氯銨（CPC）、β-甘油磷酸鈉，北京索萊寶科技有限公司；核因子κB 受體活化因子（RANKL），美國ROCKLAND 公司；胎牛血清（FBS），NQBB；抗酒石酸酸性磷酸酶染液、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒，南京建成生物工程研究所；噻唑藍(lán)（MTT）、瓊脂糖，美國Invitrogen 有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動凝膠成像系統(tǒng)，英國Syngene 公司；IX71 熒光顯微鏡，日本Olympus 公司；Flash 全波長掃描熒光酶標(biāo)儀、7500 Real Time PCR System，美國賽默飛公司；垂直層流潔凈工作臺，上海凈化設(shè)備有限公司；Hera cell 150 二氧化碳培養(yǎng)箱、Biofuge Stratos 冷凍離心機(jī)，美國賽默飛公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63 和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 均在5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[13]，培養(yǎng)基使用含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的無酚紅DMEM 培養(yǎng)基。

1.3.2 MTT 法測定細(xì)胞增殖 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)生長期人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63 或者小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，以每孔5×103個接種于96 孔板中。待細(xì)胞貼壁后，給藥組分別加入不同濃度的染料木素、維生素D3，對照組加入等體積的培養(yǎng)基。藥物作用一定時間后吸除96 孔板中的培養(yǎng)基，在37 ℃環(huán)境下，每孔用100 μL MTT 溶液（0.5 mg/mL）孵育4 h。小心吸除孵育后的MTT 溶液，每孔用100 μL DMSO 溶解紫色結(jié)晶甲瓚，輕柔混勻。使用酶標(biāo)儀以630 nm 波長處的A值作為參照，檢測570 nm 波長處的吸光度A值。

1.3.3 堿性磷酸酶（ALP）活性測定 人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63 以每孔2×105個接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁后，給藥組添加不同濃度的藥物，對照組加入等體積的培養(yǎng)基培養(yǎng)一定時間。檢測時用PBS洗2 遍，每孔加入150 μL 的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，置冰上30 min 后，4 ℃下離心15 min，轉(zhuǎn)速為14 000 r/min，吸取上清液置于冰上，測定ALP 活性嚴(yán)格按照ALP 試劑盒說明書操作，檢測波長520 nm。

1.3.4 茜素紅染色鑒定骨礦化 人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63 以每孔2×105個接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁后，礦化組和給藥組均換用含50 μmol/L 抗壞血酸和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)，給藥操作同1.3.3 節(jié)。每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，每1～2 d 更換培養(yǎng)基1 次。21 d 后在倒置顯微鏡下觀察，部分細(xì)胞成片積累生長，出現(xiàn)形狀各異的“黑斑”，即為礦化結(jié)節(jié)。PBS 清洗細(xì)胞2 遍晾干，95%乙醇固定10 min，蒸餾水清洗后晾干。加入茜素紅S 染色液（1%，pH 4.2），37 ℃染色60 min。蒸餾水清洗2～3 遍將未結(jié)合的染料洗掉，動作輕柔避免洗掉細(xì)胞，晾干后倒置顯微鏡下拍照并記錄。每孔加1 mL 10% CPC 溶液充分溶解深紅色化合物，測定其在550 nm 下A值，鈣結(jié)節(jié)的量與A值的大小成正比，以定量鈣沉積情況[14]。

1.3.5 誘導(dǎo)破骨細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，以1×104/孔接種于24 孔板，待細(xì)胞貼壁后，加入含50 ng/mL RANKL 誘導(dǎo)劑的培養(yǎng)基誘導(dǎo)破骨細(xì)胞生成。誘導(dǎo)6 d 后在倒置顯微鏡下可觀察到有多核細(xì)胞的形成，根據(jù)抗酒石酸酸性磷酸酶染液說明進(jìn)行染色，倒置顯微鏡下觀察拍照。記錄到含有大于3 個細(xì)胞核的TRAP 陽性多核細(xì)胞為破骨細(xì)胞[15]。

1.3.6 破骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性檢測 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 以每孔5×103個接種于6 孔板中，每孔2.5 mL。細(xì)胞貼壁后，給藥組和對照組均用含RANKL 誘導(dǎo)劑（50 ng/mL）的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，給藥組加入不同濃度的不同藥物。每1～2 d 更換培養(yǎng)基1 次，培養(yǎng)6 d。處理結(jié)束后，收集細(xì)胞，PBS 洗1～2 遍，每孔加入150 μL的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，置冰上30 min 后，在4℃下離心15 min，轉(zhuǎn)速為14 000 r/min，取上清液為總蛋白置于冰上，測定TRAP 活性嚴(yán)格按照TRAP 試劑盒說明書操作，檢測波長530 nm。

1.3.7 人成骨肉瘤細(xì)胞MG-63 的RNA 提取及RT-PCR 將MG-63 細(xì)胞以每孔1×105個接種于6 cm 培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后加入藥物（分組及給藥情況同1.3.3 節(jié)）。培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞。用Trizol 提取總RNA 進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：采用兩步PCR 反應(yīng)程序法，第一步預(yù)變性95℃、30 s；第二步PCR 反應(yīng)，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，循環(huán)40 次。目的基因mRNA 水平以與參照基因GAPDH 的Tm 比值表示。PCR 引物序列如表1所示。

表1 MG-63 細(xì)胞PCR 引物序列Table 1 Primers for PCR in MG-63

1.3.8 破骨細(xì)胞的RNA 提取及RT-PCR 參照1.3.6 節(jié)方法處理細(xì)胞。細(xì)胞提取RNA 及RT-PCR方法同1.3.7 節(jié)。

表2 由RAW 264.7 細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞PCR 引物序列Table 2 Primers for PCR in osteoclasts induced by RAW 264.7

1.3.9 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析 所得數(shù)據(jù)為±s表示，n≥3，使用鄧肯字母標(biāo)記法標(biāo)記多重比較，采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差的T 檢驗(yàn)分析。P＜0.05 差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素D3 聯(lián)合染料木素對MG-63 細(xì)胞增殖和分化的影響

采用MTT 法測定藥物作用細(xì)胞24 h 后MG-63 的細(xì)胞存活率。如圖1a所示，維生素D3在1.56～100.00 μmol/L 濃度對MG-63 細(xì)胞無毒性，在6.25，12.50，25.00，50.00，100.00 μmol/L 濃度可明顯促進(jìn)MG-63 細(xì)胞的增殖（P<0.05）。如圖1b所示，染料木素在1.56～50.00 μmol/L 濃度對MG-63 細(xì)胞無毒性。染料木素濃度在3.12，6.25 和12.50 μmol/L 可顯著促進(jìn)MG-63 細(xì)胞的增殖（P<0.05）。故選擇1.56，3.12，6.25，12.50，25.00，50.00 μmol/L 濃度進(jìn)行組合。如圖1c所示，低濃度的維生素D3和染料木素聯(lián)合用藥對MG-63 細(xì)胞的增殖具有協(xié)同作用，且濃度在6.25 μmol/L 時更為顯著。

圖1 染料木素和維生素D3 對MG-63 細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of genistein and vitamin D3 on the proliferation of MG-63 cells

ALP 作為成骨細(xì)胞分化的前期標(biāo)志之一，可隨著成骨細(xì)胞的生長而表達(dá)增加，可以代表骨形成的狀態(tài)[16]。藥物作用48 h 后測MG-63 細(xì)胞的ALP 活性。如圖2a 和2b所示，藥物濃度在3.12～50.00 μmol/L 時，與染料木素和維生素D3單藥組相比，聯(lián)合組可顯著增強(qiáng)MG-63 細(xì)胞中ALP 活性。維生素D3在濃度為3.12 μmol/L 和6.25 μmol/L 時抑制了ALP 活性，而聯(lián)合染料木素可使維生素D3對ALP 活性的抑制作用逆轉(zhuǎn)。染料木素濃度在3.12，6.25，12.50 μmol/L 時可顯著增強(qiáng)ALP 活性。

交聯(lián)的蛋白質(zhì)和膠原蛋白隨著成骨細(xì)胞生長增殖，可產(chǎn)生羥基磷灰石并堆積在基質(zhì)中礦化[17]，茜素紅可結(jié)合形成的鈣結(jié)節(jié)發(fā)生顏色變化，產(chǎn)生深紅色的化合物。選擇濃度為6.25 μmol/L 的維生素D3，染料木素及其二者聯(lián)合用藥組進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)的檢測。礦化培養(yǎng)21 d 后，可在倒置顯微鏡下觀察到MG-63 細(xì)胞中的鈣結(jié)節(jié)，礦化組和試驗(yàn)組形成了更多的不透明結(jié)節(jié)。如圖2c所示，積累的鈣結(jié)節(jié)被茜素紅染成深紅色化合物，形狀不規(guī)則，表明有成骨活性。加入10%的西吡氯銨（CPC）溶解結(jié)合鈣結(jié)節(jié)的茜素紅以定量鈣沉積情況，在550 nm 下測量吸光度值，如圖2d所示，表明維生素D3聯(lián)合染料木素可形成更多茜素紅和鈣產(chǎn)生的深紅色化合物促進(jìn)礦化基質(zhì)的形成。

圖2 染料木素和維生素D3 對MG-63 細(xì)胞分化和礦化的影響Fig.2 Effects of genistein and vitamin D3 on differentiation and mineralization of MG-63 cells

2.2 染料木素和維生素D3 對MG-63 細(xì)胞OPG、RANKL 表達(dá)的影響

藥物作用24 h 后，采用PT-PCR 方法通過比較Ct 法測定OPG 和RANKL 在成骨細(xì)胞的相對表達(dá)量。如圖3a 和3b所示，與對照組相比，單藥染料木素組和維生素D3組的OPG mRNA 表達(dá)量均增加；而且與單藥組相比，染料木素聯(lián)合維生素D3組OPG mRNA 表達(dá)量顯著增加，但增加的作用不是呈劑量依賴性的。如圖3c 和3d所示，與對照組相比，染料木素和維生素D3組的MG-63 細(xì)胞中RANKL mRNA 表達(dá)均降低。在濃度為6.25～50.00 μmol/L 范圍內(nèi)，聯(lián)合組的RANKL mRNA 表達(dá)比維生素D3組顯著降低，而與染料木素組對比無差異。OPG 與RANKL 的相對比例破壞可能導(dǎo)致骨吸收增加，微結(jié)構(gòu)改變和骨折風(fēng)險，在破骨細(xì)胞生物學(xué)和骨吸收調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵決定因素和最終步驟的作用[18-19]，如圖3e 和3f所示，聯(lián)合組中OPG/RANKL 的比值顯著大于維生素D3和染料木素組，且染料木素、維生素D3以及維生素D3與染料木素聯(lián)合組對OPG/RANKL 的比值均隨著藥物濃度的增大而減小。表明維生素D3與染料木素聯(lián)合可能通過OPG/RANKL 途徑對成骨細(xì)胞增殖分化產(chǎn)生協(xié)同作用。此外，染料木素對MG-63 細(xì)胞的增殖和分化作用較維生素D3顯著。

圖3 染料木素和維生素D3 對MG-63 細(xì)胞OPG 和RANKL mRNA 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of genistein and vitamin D3 on the expression of OPG and RANKL mRNA in MG-63 cells

2.3 染料木素和維生素D3 對破骨細(xì)胞增殖及其TRAP 活性的影響

RAW264.7 細(xì)胞用含50 ng/mL RANKL 的培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d，如圖4所示，RAW264.7 細(xì)胞可誘導(dǎo)為圓形、橢圓形或不規(guī)則多核破骨細(xì)胞，并在細(xì)胞周圍可以看到凸起的偽足。表明RAW264.7 細(xì)胞可誘導(dǎo)為成熟的破骨細(xì)胞用于試驗(yàn)。

圖4 顯微鏡下破骨細(xì)胞的形態(tài)Fig.4 Morphology of osteoclasts under microscope

通過MTT 法測定染料木素和維生素D3作用6 d 對RAW264.7 細(xì)胞生長的影響。如圖5a所示，1.56～50.00 μmol/L 濃度的染料木素對RAW264.7細(xì)胞無毒性，如圖5b所示，3.12～100.00 μmol/L 濃度的維生素D3對RAW264.7 細(xì)胞無毒性。

圖5 染料木素和維生素D3 對RAW264.7 細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effects of genistein and vitamin D3 on the proliferation of RAW264.7 cells

通過MTT 法測定染料木素和維生素D3作用24 h 對破骨細(xì)胞增殖的影響。如圖6a所示，濃度在1.56～50.00 μmol/L 范圍內(nèi)染料木素對破骨細(xì)胞增殖具有顯著抑制作用。如圖6b、6d所示，濃度在6.25～50.00 μmol/L 范圍內(nèi)維生素D3對破骨細(xì)胞增殖具有顯著的促進(jìn)作用，與染料木素聯(lián)合使用后，這種促進(jìn)作用受到抑制。與對照組相比，聯(lián)合組在3.12～50.00 μmol/L 濃度下破骨細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，而在3.12～25.00 μmol/L 濃度下，與染料木素組相比，破骨細(xì)胞的增殖受到抑制。結(jié)果表明，維生素D3可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的增

圖6 染料木素和維生素D3 對破骨細(xì)胞增殖的影響Fig.6 Effects of genistein and vitamin D3 on the proliferation of osteoclasts

殖，但與染料木素結(jié)合可以抑制破骨細(xì)胞的增殖。

采用TRAP 試劑盒測定藥物作用于破骨細(xì)胞24 h 后對TRAP 活性的影響。如圖7所示，染料木素、維生素D3和聯(lián)合用藥組均顯著抑制破骨細(xì)胞的TRAP 酶活性。聯(lián)合用藥組相比單藥抑制作用更強(qiáng)。

圖7 染料木素和維生素D3 對破骨細(xì)胞TRAP 活性的影響Fig.7 Effects of genistein and vitamin D3 on TRAP activity of osteoclasts

2.4 染料木素和維生素D3 對破骨細(xì)胞TRAP，MMP9 和組織蛋白酶K mRNA 表達(dá)的影響

如圖8a所示，與對照組相比，試驗(yàn)組中破骨細(xì)胞的TRAP mRNA 表達(dá)均被抑制，且聯(lián)合組的抑制作用更顯著。如圖8b所示，與對照組相比，試驗(yàn)組中對破骨細(xì)胞TRAP mRNA 表達(dá)抑制作用隨濃度增加而減弱。如圖8c 和8d所示，與對照組相比，試驗(yàn)組破骨細(xì)胞中MMP9 mRNA 的表達(dá)均被抑制，而與染料木素和維生素D3單組相比，聯(lián)合組中MMP9 mRNA 的表達(dá)顯著降低，并且當(dāng)濃度增加時，抑制作用減弱。如圖8e、8f所示，染料木素對破骨細(xì)胞中組織蛋白酶K mRNA 的表達(dá)有明顯的抑制作用，但在6.25～50.00 μmol/L 的濃度下，維生素D3卻顯著促進(jìn)了組織蛋白酶K 的表達(dá)。所以，染料木素逆轉(zhuǎn)了維生素D3對組織蛋白酶K mRNA 表達(dá)的促進(jìn)作用，使聯(lián)合組對其表達(dá)量明顯降低。

圖8 染料木素和維生素D3 對破骨細(xì)胞TRAP，MMP9 和組織蛋白酶K mRNA 表達(dá)的影響Fig.8 Effects of genistein and vitamin D3 on the expression of osteoclast TRAP，MMP9 and Cathepsin K mRNA

3 結(jié)論

試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示染料木素和維生素D3聯(lián)合使用比單獨(dú)用藥對成骨細(xì)胞的增殖具有顯著的促進(jìn)作用，同時也對破骨細(xì)胞有顯著的抑制作用。證實(shí)染料木素和維生素D3對促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和抑制破骨細(xì)胞增殖具有協(xié)同作用。維生素D3與染料木素聯(lián)合用藥作用于MG-63 細(xì)胞，ALP 活性明顯增強(qiáng)，說明二者聯(lián)合能促進(jìn)成骨細(xì)胞的早期分化，與文獻(xiàn)報道過的黃酮促進(jìn)成骨細(xì)胞分化一致[24]。通過10%的CPC 將鈣結(jié)節(jié)量化，得出聯(lián)合用藥能促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)的生成，促進(jìn)成骨細(xì)胞礦化。本文還測定了OPG、RANKL mRNA 的相對表達(dá)量，并比較了不同濃度不同組的OPG/RANKL 比值。發(fā)現(xiàn)維生素D3和染料木素聯(lián)合可能是通過OPG/RANKL/RANK 通路促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟，有待進(jìn)一步研究。

本文通過對破骨細(xì)胞TRAP 活性檢測以及TRAP、MMP9、組織蛋白酶K mRNA 的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)維生素D3和染料木素聯(lián)合用藥能抑制破骨細(xì)胞的分化成熟。維生素D3在6.25～50.00 μmol/L，可顯著促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟和組織蛋白酶K 的表達(dá)，同時顯著抑制破骨細(xì)胞成熟的標(biāo)記因子MMP9 的表達(dá)。維生素D3和染料木素的組合可顯著抑制破骨細(xì)胞的增殖和分化，染料木素在試驗(yàn)劑量內(nèi)逆轉(zhuǎn)了維生素D3對破骨細(xì)胞的促進(jìn)作用。

本文證實(shí)，染料木素可增強(qiáng)成骨細(xì)胞MG-63的增殖和分化，從而促進(jìn)抗骨質(zhì)疏松作用。有趣的是，高劑量的維生素D3可促進(jìn)破骨細(xì)胞的增殖成熟從而促進(jìn)骨質(zhì)疏松作用，但是在維生素D3和染料木素聯(lián)合使用時，這種作用可以逆轉(zhuǎn)，抗骨質(zhì)疏松作用也很明顯。染料木素和維生素D3在抗骨質(zhì)疏松癥上的協(xié)同作用提供了一種新穎而有效的組合，在骨質(zhì)疏松癥的飲食療法中具有應(yīng)用的潛力。