閆雪萍 吳杉杉 王利婷 史璐

牙髓神經(jīng)是存在于牙髓組織內(nèi)的神經(jīng)感受器，主要發(fā)揮感覺功能，并參與調(diào)控牙髓微環(huán)境和牙本質(zhì)再生，通過提高牙髓神經(jīng)的再生功能，對于損傷牙齒正常功能的修復(fù)、減少牙髓治療相關(guān)并發(fā)癥有重要意義[1-2]。神經(jīng)細(xì)胞本身缺乏再生能力，損傷后難以自我修復(fù)，因此如何促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)成為研究熱點。人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)是由神經(jīng)嵴發(fā)育而來、位于牙髓組織中的成體干細(xì)胞，具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似免疫表型，可自我更新和多向分化，有較強(qiáng)的克隆能力，且有易獲得、培養(yǎng)條件簡單的優(yōu)點，為牙髓神經(jīng)細(xì)胞的再生修復(fù)提供了新的研究途徑[3]。尼爾樣-1型分子(nel-like molecule-1，Nell-1)是一種具有高度保守性的分泌型蛋白，對于成骨細(xì)胞分化、新生骨形成等方面有正向調(diào)節(jié)作用[4]。研究[5]證實，Nell-1能與其位于成骨譜系細(xì)胞表面的受體Integrinβ1結(jié)合，啟動絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號級聯(lián)，影響細(xì)胞的粘附、增殖與分化。目前關(guān)于Nell-1促進(jìn)成骨向分化的相關(guān)研究較多，在神經(jīng)向分化方面的相關(guān)研究較少。本研究通過體外分離hDPSCs，研究Nell-1蛋白基于MAPK信號通路對hDPSCs神經(jīng)向誘導(dǎo)分化的調(diào)控作用及機(jī)制，為牙髓疾病的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞取材 取材于口腔頜面外科門診18～25 歲志愿者，因正畸或阻生齒新鮮拔除健康完整恒牙，從中分離hDPSCs。研究實施前向志愿者講述牙齒用途，均知情同意,并獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物、主要試劑和儀器 人重組Nell-1蛋白[(R&D systems，lic.Minneapolis，MN55413，USA)；300 μg/mL Nell-1蛋白存儲液配制：50 μg Nell-1蛋白溶解于167 μL無菌PBS中，以200 μL每EP管分裝，保存于-40 ℃]；p38MAPK激酶抑制劑SB203580、E-Gel Imager凝膠成像儀(Invivogen公司,美國)；β-微管蛋白3(β-tubulin class III，β-tubulin-II)單抗、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)單抗、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)單抗、cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白1(cAMP responsive element binding protein-1，cREB-1)、磷酸化(phosphorylated，p)-p38MAPK單抗(Abcam，英國)；p-cREB-1、GAPDH單抗(上海信帆生物科技有限公司)；異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)、辣根過氧化物酶標(biāo)記標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(廣州健侖生物科技有限公司)；ELx 800酶標(biāo)儀(BioTek公司,美國)；FACSCanto II流式細(xì)胞儀(BD公司,美國)；EVOS M7000倒置熒光顯微鏡(賽默飛世爾，美國)。

1.2 方法

1.2.1 hDPSCs的分離培養(yǎng)及鑒定 牙體清潔后劈開取出牙髓，根據(jù)參考文獻(xiàn)[6]，以組織塊酶消化法分離hDPSCs，加入含15%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液后置于培養(yǎng)瓶中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁后以0.25%胰酶37 ℃消化40 min，4 ℃ 1 000 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，棄上清，傳代培養(yǎng)，取第3代細(xì)胞以流式細(xì)胞技術(shù)鑒定細(xì)胞免疫表型。

1.2.2 hDPSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化 第3代hDPSCs細(xì)胞以2×105個/孔密度接種于24孔板，每組5 個復(fù)孔，分為對照組、Nell-1組和Nell-1+MAPK抑制劑組，細(xì)胞貼壁達(dá)80%棄原培養(yǎng)液，加入預(yù)誘導(dǎo)液(MEM、20%胎牛血清、10 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長因子)培養(yǎng)24 h后更換神經(jīng)誘導(dǎo)液(1 μmol/L氫化可的松、2%二甲基亞砜、200 μmol/L丁羥基茴醚、10 μmol/L forskolin、0.1 mmol/L β-巰基乙醇繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d更換神經(jīng)誘導(dǎo)液。其中Nell-1組神經(jīng)誘導(dǎo)液加入含100 ng/mL的Nell-1，Nell-1+MAPK抑制劑組神經(jīng)誘導(dǎo)液加入含100 ng/mL的Nell-1與10 μmol/L SB203580。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.3 免疫熒光檢測hDPSCs神經(jīng)元早期標(biāo)志物表達(dá) 誘導(dǎo)分化后第12天，制作各組細(xì)胞爬片，PBS洗滌3次，4%甲醛室溫固定20 min，通透20 min，5% BSA封閉30 min，加入一抗β-tubulin-III、GFAP，F(xiàn)ITC標(biāo)記的IgG二抗，封片后熒光顯微鏡下觀察并檢測熒光強(qiáng)度。

1.2.4 Western blot檢測p38MAPK、p-p38MAPK、cREB-1、p-cREB-1蛋白相對表達(dá)量 取各組誘導(dǎo)分化第12天細(xì)胞，加入RIPA裂解液，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫下?lián)u床封閉2 h，加入一抗、二抗，37 ℃孵育1 h，Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參GAPDH灰度值比值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 hDPSCs分離培養(yǎng)鑒定

hDPSCs培養(yǎng)7～10 d鏡下觀察可見牙髓細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，圍繞組織塊向四周生長，呈放射狀。原代hDPSCs傳至第3代可見外形均勻，多數(shù)為梭形，成集落狀生長，可用于后續(xù)實驗(圖 1)。流式細(xì)胞儀檢測hDPSCs表面抗原顯示，CD34、CD45表達(dá)陰性，CD105、CD90表達(dá)陽性，陽性細(xì)胞比率分別為98.52%、99.23%，符合hDPSCs的表面抗原(圖 2)。

2.2 hDPSCs神經(jīng)誘導(dǎo)分化細(xì)胞形態(tài)變化

hDPSCs誘導(dǎo)前細(xì)胞梭形為主、部分為卵圓形或多角形，體積小、輪廓清晰；誘導(dǎo)分化后12 d Nell-1組可見細(xì)胞形態(tài)為神經(jīng)元樣生長，成網(wǎng)狀突起，相互鏈接，核大而圓位于細(xì)胞中央；對照組與Nell-1+MAPK抑制劑組可見細(xì)胞體積收縮，為神經(jīng)球樣生長(圖 3)。

圖 2 流式細(xì)胞儀檢測hDPSCs表面抗原表達(dá)

圖 3 hDPSCs神經(jīng)誘導(dǎo)分化前后細(xì)胞形態(tài)變化

2.3 免疫熒光檢測各組神經(jīng)元早期標(biāo)志物表達(dá)情況

誘導(dǎo)分化12 d對照組、Nell-1組、Nell-1+MAPK抑制劑組均有β-tubulin-III、GFAP陽性表達(dá)(圖 4)。對β-tubulin-III、GFAP相對熒光強(qiáng)度值組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；Nell-1組的β-tubulin-III、GFAP相對熒光強(qiáng)度值高于對照組和Nell-1+MAPK抑制劑組(P<0.05)(表 1)。

2.4 各組細(xì)胞p-p38MAPK/p38MAPK、p-cREB-1/cREB-1表達(dá)比較

Nell-1組p-p38MAPK/p38MAPK、p-cREB-1/cREB-1均高于對照組和Nell-1+MAPK抑制劑組(P<0.001)(圖 5、表 2)。

表 1 β-tubulin-III、GFAP蛋白熒光定量比較

圖 4 各組hDPSCs神經(jīng)誘導(dǎo)分化12 d后β-tubulin-III、GFAP免疫熒光圖(×200) 圖 5 各組hDPSCs p-p38MAPK、p38MAPK、p-cREB-1、cREB-1蛋白的Western blot檢測

表 2 p-p38MAPK/p38MAPK、p-cREB-1/cREB-1表達(dá)的組間比較

3 討 論

近年來，隨著干細(xì)胞療法和組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，利用干細(xì)胞移植促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)和再生相關(guān)研究不斷涌現(xiàn)。hDPSCs因組織來源和生物學(xué)特征均與神經(jīng)干細(xì)胞相似，具有來源豐富、無倫理爭議、副作用小的特點，被大量應(yīng)用于口腔疾病、阿爾茲海默病、帕金森病、脊髓損傷的治療等神經(jīng)損傷修復(fù)和再生研究中[7-8]。Nell-1是與人類顱縫早閉癥相關(guān)的分泌型蛋白，在顱骨和神經(jīng)組織中優(yōu)先表達(dá)，被證實能誘導(dǎo)牙髓細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞及神經(jīng)樣細(xì)胞分化，但關(guān)于誘導(dǎo)分化機(jī)制尚未明確[9]。故本研究通過探討Nell-1蛋白對hDPSCs神經(jīng)向分化的調(diào)控作用及機(jī)制，以期為臨床牙髓損傷的修復(fù)提供理論指導(dǎo)。

本研究中酶消組織塊法培養(yǎng)hDPSCs后經(jīng)鑒定培養(yǎng)成功，可用于后續(xù)實驗。hDPSCs神經(jīng)樣誘導(dǎo)分化后12 d Nell-1組可見細(xì)胞成神經(jīng)元樣；免疫熒光檢測各組均β-tubulin-III、GFAP陽性表達(dá)，且Nell-1組的β-tubulin-III、GFAP相對熒光強(qiáng)度值高于對照組和Nell-1+MAPK抑制劑組，說明Nell-1可定向誘導(dǎo)hDPSCs神經(jīng)樣分化。Nell-1蛋白最早從顱縫早閉患兒顱骨中分離得到，能誘導(dǎo)病理性成骨的形成，是新型促成骨因子，對成骨細(xì)胞分化、礦化及骨的形成和再生有誘導(dǎo)作用[10]。因牙髓組織與骨組織來源于顱神經(jīng)嵴細(xì)胞，二者在組織來源方面具有同源性，故被用于神經(jīng)向分化的研究中[11]。β-tubulin-III具有神經(jīng)元特異性，是原始神經(jīng)上皮中表達(dá)最早的神經(jīng)標(biāo)志物之一[12]。GFAP主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，參與細(xì)胞骨架的構(gòu)成并維持其張力強(qiáng)度，是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物[13]。韓琦[14]研究中，以Nell-1蛋白促進(jìn)hDPSCs神經(jīng)向分化，結(jié)果Nell-1干預(yù)組誘導(dǎo)后的hDPSCs細(xì)胞有神經(jīng)表面標(biāo)記物GFAP、Nestin mRNA及蛋白的表達(dá)，證實Nell-1能定向誘導(dǎo)hDPSCs神經(jīng)向分化，與本研究觀點一致。

MAPK信號通路是介導(dǎo)細(xì)胞對胞外信號反應(yīng)的重要通路，由一組以級聯(lián)方式活化的絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，參與細(xì)胞因子、生長因子、激素及應(yīng)激等刺激引起的各種反應(yīng)及細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生理活動[15]。P38激酶是MAPK家族主要成員，p38MAPK信號通路能被多種刺激性信號激活，激活的p38MAPK通過磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白及酶類等參與細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等生理活動的調(diào)節(jié)[16]。cREB-1是p38MAPK下游蛋白，p38MAPK被激活后可活化CREB等轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化等活動[17]。陳雙慶等[18]研究顯示，MAPK信號通路是介導(dǎo)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進(jìn)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為神經(jīng)干細(xì)胞的關(guān)鍵通路。王志華[19]研究發(fā)現(xiàn)，LPS刺激hDPSCs增殖定向分化能力主要與MAPK信號通路蛋白的活化有關(guān)。上述研究均說明MAPK在多能干細(xì)胞分化過程中起重要調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果中Nell-1組的p-p38MAPK/p38MAPK、cREB-1/cREB-1高于對照組，說明Nell-1蛋白可能通過激活MAPK信號通路蛋白活化發(fā)揮促進(jìn)hDPSCs神經(jīng)向分化過程，加入MAPK抑制劑后，hDPSCs神經(jīng)向分化過程被抑制，進(jìn)一步證實MAPK信號通路蛋白活化促進(jìn)hDPSCs的神經(jīng)向分化的研究結(jié)論。

綜上所述，Nell-1蛋白可影響對hDPSCs的神經(jīng)向分化，MAPK通路中p38MAPK、cREB-1蛋白磷酸化參與Nell-1調(diào)控hDPSCs的神經(jīng)向分化過程，可為牙髓損傷修復(fù)機(jī)制的研究提供機(jī)制。