凌占業(yè)，徐 倩，楊洪雨

(河南省黃泛區(qū)鑫欣牧業(yè)股份有限公司，河南 周口 466632)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病，屬于非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，發(fā)病患畜多表現(xiàn)為高熱、皮膚發(fā)紺、內(nèi)臟器官明顯出血、呼吸障礙及神經(jīng)癥狀等，強毒株感染后發(fā)病率和死亡率最高可達100%，對養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失。1921年，英國獸醫(yī)學(xué)家Montgomery等首次報道肯尼亞的ASF疫情[1-2]；2007年，ASF疫情在高加索地區(qū)的格魯吉亞出現(xiàn)，隨后迅速蔓延至俄羅斯聯(lián)邦以及東歐等周邊國家[3-4]；2018年8月1日我國遼寧省沈陽市沈北地區(qū)發(fā)現(xiàn)了ASF疫情，經(jīng)B646L/p72基因進化樹分析發(fā)現(xiàn)該病毒屬于基因Ⅱ型，與俄羅斯和東歐流行的Georgia 2007/1毒株屬于一個進化分支[5]，目前我國多處如江蘇、安徽、河南及內(nèi)蒙古等已發(fā)現(xiàn)ASF疫情。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。

ASFV是一種有囊膜的單分子雙鏈DNA病毒，大小約為170～190 kb，在其基因組結(jié)構(gòu)中，中間125 kb為保守序列，兩端為可變區(qū)，基因組含有151～167個開放閱讀框(ORFs)，編碼150～200種蛋白質(zhì)[6-10]，其中存在許多與病毒復(fù)制、免疫逃逸、病毒傳播等相關(guān)的蛋白。ASFV EP402R基因全長為1 083 bp，編碼的蛋白大小為41 ku，是嵌入病毒囊膜外表面的膜蛋白，類似于T淋巴細胞表面的黏附受體CD2，所以命名為CD2v[11]。它由信號肽、跨膜域及147個氨基酸的胞質(zhì)尾組成，是ASFV晚期表達蛋白，可以導(dǎo)致紅細胞吸附于病毒感染細胞表面，有助于其在宿主體內(nèi)擴散[12]；該蛋白具有抑制有絲分裂原刺激淋巴細胞增殖的作用，具體機制可能是通過CD2v細胞外結(jié)構(gòu)域與淋巴細胞表面配體的直接相互作用，或通過CD2v細胞質(zhì)中結(jié)構(gòu)域與胞質(zhì)蛋白相互作用而介導(dǎo)[13]。本試驗以真核表達的ASFV CD2v蛋白為包被抗原，建立了檢測ASFV抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)血清學(xué)診斷方法，該方法具有良好的特異性和敏感性，可以用于ASFV抗體檢測，以期為CD2v蛋白的生物學(xué)功能研究、ASFV血清學(xué)診斷試劑的制備及疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)，同時對預(yù)防外來ASF傳入我國提供了檢測方法的技術(shù)儲備。

1 材料與方法

1.1 試驗時間與地點

試驗于2020年10—12月在某公司動物疫病監(jiān)測中心進行。

1.2 材料

1.2.1 試劑 非洲豬瘟病毒(CD2v)抗體ELISA檢測試劑盒購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司；兔抗豬IgG-HRP(1∶500～1∶5 000)、TMB單組分顯色液均購自索萊寶生物科技有限公司；明膠封閉緩沖液購自生工生物工程(上海)股份有限公司；PBS磷酸緩沖液、Albumin Bovine、ELISA酶標(biāo)板購自鄭州科邦生物科技有限公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2.2 CD2v蛋白 試驗用包被抗原由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2.3 血清 ASFV感染血清10份[由哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司的非洲豬瘟病毒(CD2v)抗體ELISA檢測試劑盒檢測抗體為陽性]由國家非洲豬瘟參考實驗室提供；偽狂犬病病毒(PRV-gE)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、口蹄疫病毒O型(FMDV-O)、口蹄疫病毒A型(FMDV-A)陽性血清各3份，健康豬血清40份由中牧實業(yè)股份有限公司提供。

1.2.4 試驗儀器 生化培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)；振蕩器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)；全自動酶標(biāo)洗板機(深圳市匯松科技發(fā)展有限公司)；4 ℃冰箱(青島海爾股份有限公司)；手提式壓力蒸汽滅菌器(寧波凌宏醫(yī)療器械科技有限公司)；酶聯(lián)免疫檢測儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)。

1.3 間接ELISA方法的建立及反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.3.1 最佳包被濃度和血清稀釋倍數(shù)的確定 采用方陣滴定試驗確定最佳反應(yīng)條件，將純化后的重組蛋白分別稀釋至20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、2 μg/mL、1.25 μg/mL、0.625 μg/mL，加入96孔酶標(biāo)板，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h轉(zhuǎn)入4 ℃包被過夜，次日用PBST洗滌5次；隨后1% BSA磷酸緩沖液封閉1.5 h(200 μL/孔)，用PBST洗滌5次；ASFV陽性血清和陰性血清分別按照1∶25、1∶50、1∶100、1∶200稀釋，100 μL/孔進行方陣試驗，37 ℃下孵育45 min，用PBST洗滌5次；將兔抗豬IgG-HRP二抗稀釋至1∶4 000后加入孔中，100 μL/孔，37 ℃作用0.5 h，用PBST洗滌5次；加入TMB避光顯色(100 μL/孔)，37 ℃孵育10 min；加入2 mol/L H2SO4終止顯色(50 μL/孔)，比較各孔OD450nm值，挑選接近1.0的陽性值，并根據(jù)P/N值篩選出最佳抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)。

1.3.2 封閉液的篩選 用最佳濃度抗原包被96孔酶標(biāo)板，分別用含5%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液、1% BSA磷酸鹽緩沖液及含明膠的磷酸鹽緩沖液，200 μL/孔，37 ℃下孵育1.5 h，按上述間接ELISA反應(yīng)測定，篩選出最佳封閉時間。

1.3.3 血清最佳反應(yīng)時間篩選試驗 用最佳濃度抗原包被96孔酶標(biāo)板，血清孵育時間分別為1.5 h、1 h、45 min、30 min，酶標(biāo)二抗的孵育時間30 min，37 ℃孵育(100 μL/孔)，按上述間接ELISA反應(yīng)測定，篩選出最佳孵育時間。

1.3.4 酶標(biāo)抗體工作濃度與顯色時間的確定 將兔抗豬IgG-HRP二抗分別按照1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶5 000用PBST、5%脫脂奶粉、1% BSA及明膠封閉緩沖液進行稀釋，其余按上述間接ELISA反應(yīng)測定，篩選出最佳酶標(biāo)抗體工作濃度；加入TMB后，分別顯色3 min、5 min、10 min，讀取OD450nm值，選取P/N值較大的顯色時間作為底物顯色時間。

1.3.5 穩(wěn)定性檢測 選取非洲豬瘟陽性及陰性共6份豬血清樣品，用3批包被的酶標(biāo)板檢測，在同一塊酶標(biāo)板上進行批內(nèi)重復(fù)，不同酶標(biāo)板之間進行批間重復(fù)，每個樣品重復(fù)檢測3次，計算標(biāo)準(zhǔn)偏差及變異系數(shù)。

1.3.6 陰陽性判定閾值與檢測限的判定 用上述優(yōu)化的間接ELISA方法檢測50份ASFV陰性血清，在樣品符合正態(tài)分布的條件下，根據(jù)測得的OD450nm值，計算平均值和3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和，將平均值和3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為陰、陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)，大于該臨界值判定為陽性Positive Cut off(PC)=X＋3SD，小于該臨界值判定為陰性Negative Cut off(NC)=X＋3SD，介于二者之間的判為可疑。

1.3.7 特異性試驗 用建立的間接ELISA檢測方法對偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、口蹄疫病毒O型與A型及非洲豬瘟陽性血清進行檢測，每種血清各取3份，并設(shè)置ASFV陽性血清與陰性血清作為對照，從而評估本研究建立的ELISA方法的特異性。

1.3.8 靈敏度試驗 將非洲豬瘟陽性血清1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400稀釋，采用優(yōu)化的間接ELISA方法，檢測不同稀釋倍數(shù)的陽性血清，根據(jù)檢測結(jié)果判定陽性血清最大稀釋倍數(shù)，以評價所建ELISA方法的靈敏度。

1.3.9 間接ELISA抗體檢測方法的臨床應(yīng)用(符合率試驗) 采集河南部分地區(qū)豬血清50份，利用建立的ASFV CD2v間接ELISA方法和哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司非洲豬瘟病毒(CD2v)抗體ELISA檢測試劑盒對10份ASFV感染豬血清和40份健康豬血清進行檢測，對比兩種方法檢測結(jié)果的符合率。

2 結(jié)果

2.1 抗原包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定結(jié)果

由表1可知，抗原包被濃度為10 μg/mL、血清稀釋倍數(shù)為1∶25時，此時P/N值最大，因此抗原的最佳包被濃度為10 μg/mL，血清稀釋倍數(shù)為1∶25。

表1 方陣滴定結(jié)果(P/N值)

2.2 封閉液的選擇

由圖1可知，以1% BSA(牛血清白蛋白)與明膠封閉緩沖液進行封閉，陽性血清OD450nm值/陰性血清OD450nm值(P/N)最大，因此確定1% BSA與明膠封閉緩沖液為最佳封閉液。

圖1 最佳封閉液的篩選

2.3 血清最佳反應(yīng)時間的篩選

由圖2可知，待檢的陰陽血清孵育60 min后，抗原與抗體結(jié)合比較充分，P/N值最大，所以選擇60 min作為待檢血清的最佳反應(yīng)時間。

圖2 血清最佳反應(yīng)時間的篩選

2.4 酶標(biāo)抗體工作濃度的確定

由圖3可知，酶標(biāo)抗體分別按照1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶5 000稀釋時，根據(jù)P/N值大小確定二抗的最佳稀釋比例，其中稀釋到1∶2 000時，P/N值最大，因此酶標(biāo)抗體的最佳工作濃度為1∶2 000。

圖3 酶標(biāo)抗體最佳工作濃度的確定

2.5 酶標(biāo)抗體最佳稀釋液的確定

由圖4可知，用PBST以1∶2 000稀釋二抗時，根據(jù)P/N值大小確定最適稀釋液，當(dāng)稀釋液為PBST時，P/N值最大，因此酶標(biāo)抗體的最佳稀釋液為PBST。

圖4 酶標(biāo)抗體最佳稀釋液的確定

2.6 TMB最佳顯色時間的確定

由圖5可知，根據(jù)上述試驗優(yōu)化好的條件，加入TMB后分別顯色3 min、5 min、10 min，根據(jù)P/N值大小確定顯色時間。TMB孵育10 min后，P/N值最大，故選擇10 min作為TMB顯色底物的孵育時間。

圖5 TMB最佳顯色時間的確定

2.7 重復(fù)性試驗

由表2可知，用同一批次包被的酶標(biāo)板檢測6份血清，每份血清3個重復(fù)，結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)均＜10%，說明所建ELISA方法具有較好的批內(nèi)重復(fù)性；用3個不同批次的酶標(biāo)板檢測6份血清，結(jié)果顯示批間變異系數(shù)均＜10%，3份陽性血清檢測均值的批間變異系數(shù)均大于批內(nèi)變異系數(shù)，同時3份陰性血清中僅有1份檢測均值的批間變異系數(shù)小于批內(nèi)變異系數(shù)，故說明所建的ELISA方法批間重復(fù)性稍差于批內(nèi)重復(fù)。

表2 穩(wěn)定性結(jié)果

2.8 臨界值的確定

由表3可知，將確定為ASFV陰性的50份血清進行ELISA檢測，得出樣本平均OD450nm值為0.228，標(biāo)準(zhǔn)差為0.046，將(平均值＋3倍標(biāo)準(zhǔn)差)作為陰、陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果可知，陽性臨界值為0.366，當(dāng)待檢樣品大于該臨界值判定為陽性，小于0.32判定為陰性，介于二者之間則判定為可疑。

表3 陰陽性判定閾值的確定

2.9 特異性試驗

用建立的ELISA方法對PRV-gE、CSFV、PRRSV、FMDV-O、FMDV-A進行檢測，結(jié)果顯示，5種病毒陽性血清的OD450nm值均＜0.366，均為陰性(圖6)，表明該方法具有良好的特異性。

圖6 特異性試驗結(jié)果

2.10 靈敏度試驗

用建立的ELISA方法對倍比稀釋的ASFV陽性血清進行檢測，結(jié)果顯示，當(dāng)陽性血清稀釋50倍時，OD450nm值仍大于0.366(圖7)，說明所建ELISA方法具有較好的靈敏度。

圖7 敏感性試驗結(jié)果

2.11 符合率試驗

對50份血清(10份ASFV感染豬血清和40份健康豬血清)進行檢測，結(jié)果顯示，本研究建立的非洲豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測方法(iELISA)和哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司非洲豬瘟病毒(CD2v)抗體ELISA檢測試劑盒共有46份血清檢測結(jié)果一致，符合率為92%(表4)。

表4 不同檢測方法符合率的評價 份

3 討論

ASF作為一類動物傳染病，自暴發(fā)后對中國養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的打擊，雖然很多學(xué)者一直致力于該疫苗的研發(fā)，但目前為止仍無有效的商品化疫苗用于該病的預(yù)防。疫情發(fā)生后主要采取撲殺和凈化等措施，且防控多集中在加強基礎(chǔ)飼養(yǎng)管理、構(gòu)建生物安全體系、及時檢疫等，因此建立一種ASFV快速高效的檢疫方法尤為重要。

EP402R基因是ASFV參與免疫逃避的關(guān)鍵基因之一。有研究表明，敲除MaLawi Li1-20/1毒株的EP402R基因延遲了病毒血癥及病毒的傳播；基因Ⅰ型分離株BAV71病毒株中敲除該基因，導(dǎo)致病毒毒力減弱并誘導(dǎo)對強毒攻擊的完全保護[14-17]。目前國內(nèi)研究較多的是MGF360/505R家族和CD2v雙基因缺失株[11,17-21]，結(jié)果表明，基因Ⅱ國內(nèi)分離株EP402R(CD2v)基因單獨缺失對病毒毒力影響有限，而MGF基因(含3個MGF505基因和3個MGF360基因)缺失后，高劑量引起家豬發(fā)燒，低劑量則無此表現(xiàn)。在MGF缺失的基礎(chǔ)上進一步缺失EP402R基因后，MGF缺失株的毒力也隨之下降，但該候選疫苗的長期安全性還有待考證[22]。所以，建立ASFV CD2v抗體間接ELISA檢測方法在一定程度上可以推動ASFV雙基因缺失苗的研發(fā)。

本研究選擇了ASFV的CD2v蛋白進行了真核表達，基于真核表達系統(tǒng)在蛋白翻譯后修飾方面的較原核表達系統(tǒng)存在的優(yōu)勢，即具有同大多數(shù)高等真核生物相似的翻譯后修飾加工，如二硫鍵的形成、糖基化、磷酸化和正確折疊等，使表達蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上能夠接近于天然蛋白，抗原表位能夠最大限度的保留，重組表達則為可溶性表達。但真核表達系統(tǒng)也存在一定的缺陷，表達量偏低，通過常規(guī)純化技術(shù)很難獲得靶蛋白。

以該純化的蛋白為包被抗原建立檢測ASFV血清抗體的間接ELISA方法，由于附著在酶標(biāo)板底部的重組蛋白在空間構(gòu)象、存在形式、分布和排列方式等方面與侵入機體引起免疫應(yīng)答的病毒并不完全吻合，所以在進行實際樣品檢測時會有假陽性結(jié)果，即檢測的敏感性降低，而造成這一結(jié)果的主要原因可能與抗原抗體的特異性結(jié)合有關(guān)，即抗原的特異性取決于抗原分子中的抗原決定簇，其只能與所感染病毒產(chǎn)生的特異性抗體結(jié)合。另外，本試驗通過驗證該方法的靈敏性發(fā)現(xiàn)，不同批次的包被抗原其純化效果可能不同，若雜蛋白含量較多，血清中的成分與雜蛋白非特異性結(jié)合易造成檢測限降低，出現(xiàn)假陽性。此外，試驗對待檢血清要求比較高，應(yīng)避免樣品因采集、貯存或處理不當(dāng)?shù)纫蛩囟斐傻臉悠肺廴尽⑷苎?、樣品凝集不全等，因為一旦操作不?dāng)極有可能影響試驗結(jié)果或污染實驗室存在散毒的風(fēng)險。

同時，本試驗對酶標(biāo)二抗的工作濃度與稀釋液以及TMB(四甲基聯(lián)苯胺)顯色時間進行了篩選比較后發(fā)現(xiàn)，不同的封閉試劑其濃度和類型也會增加非特異性背景，有時BSA的封閉效果優(yōu)于脫脂奶粉，但有些抗體在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景。另外，若酶標(biāo)二抗的使用比例過高，極易造成背景值偏高，導(dǎo)致非特異性顯色。同等條件下，酶標(biāo)二抗的稀釋液不同，所測得的OD值也會存在差異。因此，本試驗最終選取1%BSA與明膠封閉緩沖液進行封閉，以PBST作為稀釋液(符合兔抗豬IgG-HRP要求)，1∶2 000作為酶標(biāo)二抗的工作濃度繼續(xù)進行后續(xù)試驗。

4 結(jié)論

本試驗通過對已知背景的血清進行檢測，驗證了基于CD2v蛋白建立的間接ELISA方法的穩(wěn)定性、靈敏性、特異性及與元亨試劑盒之間的符合率，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定、可靠，為下一步研制ASFV的間接ELISA試劑盒提供參考依據(jù)，也為控制ASFV的傳播提供技術(shù)儲備。雖然該方法可以很好地檢測出標(biāo)準(zhǔn)陽性血清樣品，但對其他臨床血清樣品檢測效果如何，還需進一步求證，通過大量檢測不同的血清樣品，積累試驗數(shù)據(jù)，完善檢測方法。目前關(guān)于非洲豬瘟基因缺失苗研究的較少，其原因在于ASFV自身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，病毒感染和免疫機制并不十分明確，而且ASFV產(chǎn)生的中和抗體不具有中和活性。所以后續(xù)若有ASF基因缺失苗應(yīng)用于市場，而我們所建立的方法則對ASF疫苗免疫后的抗體水平有一定的監(jiān)測作用。