劉書(shū)畫，李 藝，胡小莉，盧 楓，康艷敏，王雄偉，彭觀發(fā)，葉軍明

（1.贛南醫(yī)學(xué)院2019級(jí)碩士研究生；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院麻醉科；3.贛南醫(yī)學(xué)院2017級(jí)碩士研究生；4.贛南醫(yī)學(xué)院2018級(jí)碩士研究生；5.贛南醫(yī)學(xué)院2020級(jí)碩士研究生；6.贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000）

脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最嚴(yán)重創(chuàng)傷之一，嚴(yán)重影響患者的日常生活并給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。而近年來(lái)隨著交通、意外等事故頻發(fā)，SCI的發(fā)病率升高并呈年輕化。目前多采用激素、藥物、手術(shù)及康復(fù)等治療方法，但都很難取得較為滿意的效果。SCI是由直接或間接因素引起脊髓神經(jīng)元損傷或死亡、軸突斷裂、局部BSCB及血管系統(tǒng)破壞等原發(fā)性損傷，隨后出現(xiàn)包括脊髓水腫、促炎因子釋放、NO和氧自由基產(chǎn)生、膠質(zhì)細(xì)胞激活、膠質(zhì)瘢痕形成等一系列繼發(fā)性損傷。兩種損傷的作用導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，而脊髓內(nèi)環(huán)境的惡化使得神經(jīng)元再生修復(fù)很難完成。所以有效的抑制神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展、膠質(zhì)瘢痕形成，積極促進(jìn)神經(jīng)元存活修復(fù)及軸突再生是治療SCI的重點(diǎn)。

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Glial cell linederived neurotrophic factor，GDNF）是神經(jīng)系統(tǒng)早期發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)因子，GDNF缺乏可引起神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常。神經(jīng)元（包括發(fā)育中和成熟的神經(jīng)元）、膠質(zhì)細(xì)胞和施萬(wàn)細(xì)胞均可表達(dá)GDNF，其中膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的GDNF約占其總量的6%［1］。GDNF能夠促進(jìn)感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)、交感神經(jīng)、副交感神經(jīng)、多巴胺能神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞等多種神經(jīng)細(xì)胞的存活，促進(jìn)突觸和髓鞘形成［2］。脊髓損傷后GDNF可經(jīng)受損軸突逆行運(yùn)輸?shù)綋p傷神經(jīng)元，發(fā)揮直接的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用，抑制受損神經(jīng)元死亡，同時(shí)增加再生軸突的數(shù)目、直徑及髓鞘的數(shù)量，加快軸突再生。GDNF可降低脊髓損傷引起的血腦脊髓屏障（Blood-spinal cord barrier，BSCB）高通透性，減輕受損脊髓的水腫，為SCI修復(fù)提供良好的微環(huán)境。

1 GDNF與相關(guān)受體

膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族配體（Glial cell line-derived neurotrophic factor family ligands，GFLs）有7個(gè)間距相似的保守半胱氨酸殘基，是TGF-β超家族的遠(yuǎn)親成員。GFLs有4個(gè)成員：GDNF、neuturin（NRTN）、artemin（ARTN）、persephin（PSPN），在促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)方面GDNF的作用最強(qiáng)。GFLs受體 主 要 有：GFRα1-4（GDNF-GFRα1、NRTN-GFRα2、ARTN-GFRα3、PSPN-GFRα4）。RET是GFLs的共受體，一般情況下GFLs與GFRα和RET共同結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，如果GFRα缺失，RET無(wú)法與任何GFLs結(jié)合。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）中以GFRα1和GFRα2的表達(dá)為主，外周神經(jīng)系統(tǒng)（Peripheral nervous system，PNS）中以GFRα3和GFRα4表達(dá)居多。生理狀態(tài)下，神經(jīng)元能夠表達(dá)GDNF、GFRα1和RET（GDNF主要由神經(jīng)元表達(dá)），而病理狀態(tài)下，膠質(zhì)細(xì)胞均能夠表達(dá)GDNF，星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocyte，AS）表達(dá)GFRα1不表達(dá)RET［3］，小膠質(zhì)細(xì)胞（Microglia，MG）表達(dá)RET不表達(dá)GFRα1，施萬(wàn)細(xì)胞（Schwann，SCs）表達(dá)GDNF、GFRα1不表達(dá)RET。GDNF是由二硫鍵連接的糖基化的同源二聚體，其相關(guān)受體有：GFRα1、RET、NCAM、Sydecan-3。RET是決定GDNF神經(jīng)修復(fù)效應(yīng)的主要信號(hào)受體，GFRα1是細(xì)胞膜表面的GDNF的結(jié)合受體，它還存在一種可溶性受體的形式。除運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元外，所有神經(jīng)元表達(dá)的GFRα1都要由TGF-β激活才能夠轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜上。GFRα1從胞外捕獲GDNF將其傳遞給RET。GDNF除與GFRα1和RET共同結(jié)合外還能夠以NCAM為信號(hào)受體，以GFRα1的N端與NCAM的第四Ig結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成GFRα1-NCAM受體復(fù)合物，與GDNF結(jié)合實(shí)現(xiàn)NCAM下游的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。也有研究發(fā)現(xiàn)，GDNF可在缺失GFRα1的情況下直接與syndecan-3結(jié)合保護(hù)神經(jīng)元［1］。

2 GDNF抑制神經(jīng)炎癥發(fā)展

2.1 GDNF對(duì)MG的相關(guān)作用和機(jī)制MG起源于髓系卵黃囊原始巨噬細(xì)胞，和AS一起參與CNS的炎癥反應(yīng)，是CNS的駐留巨噬細(xì)胞，在固有免疫、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、促進(jìn)軸突再生和髓鞘形成等方面有重要作用［4］。SCI引起損傷組織的缺血缺氧，誘導(dǎo)TNF-α等炎癥物質(zhì)產(chǎn)生，使MG活化為M1，釋放TNF-α、IL-1β等促炎因子［5-9］，同時(shí)MG內(nèi)的RET表達(dá)增加，激活TLR4/NF-κB通路進(jìn)一步促進(jìn)M1的活化［10］。M1釋放的促炎因子還能夠誘導(dǎo)AS活化為A1，釋放C3等促炎物質(zhì)，MG和AS在神經(jīng)炎癥的發(fā)展中存在級(jí)聯(lián)放大作用（圖1）。GDNF能夠與可溶性GFRα1及MG表面的RET結(jié)合，通過(guò)激活PI3K/Akt和Hippo/YAP信號(hào)通路、抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)抑制MG活化為M1，促進(jìn)其向M2轉(zhuǎn)變，釋放IL-4、IL-10等抗炎物質(zhì)，抑制炎癥發(fā)展［9］。同時(shí)提高血-腦脊髓屏障緊密連接蛋白ZO-1和Claudin-3的表達(dá)，降低SCI引起B(yǎng)SCB的高通透性，減輕脊髓水腫，促進(jìn)SCI的修復(fù)［11-12］。還能夠激活MAPK/ERK信號(hào)通路促進(jìn)MG整合素a5的表達(dá)，促進(jìn)MG向炎癥區(qū)域的遷移。但GDNF增強(qiáng)MG的吞噬活性的作用是否是由于整合素a5表達(dá)增加所致，還有待驗(yàn)證。此外GDNF還可以提高M(jìn)G的SOD酶的活性（GDNF濃度較低時(shí)并不能增加MG的SOD酶的活性），激活MG的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，抑制氧自由基等有害物質(zhì)對(duì)受損組織修復(fù)的不利影響，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞存活。

圖1 小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在SCI中的相互作用

2.2 GDNF對(duì)AS的相關(guān)作用和機(jī)制AS是哺乳動(dòng)物CNS中數(shù)量最多的膠質(zhì)細(xì)胞，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體神經(jīng)遞質(zhì)釋放和神經(jīng)血管動(dòng)力學(xué)效應(yīng)，為神經(jīng)元運(yùn)輸能量物質(zhì)及代謝產(chǎn)物、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及BSCB的完整性及其正常功能、調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥和促進(jìn)突觸形成及可塑性等方面發(fā)揮重要作用［6，13］。SCI引起組織缺血缺氧及MG活化釋放的促炎物質(zhì)，使AS中GDNF及GFRα1的表達(dá)增多并誘導(dǎo)AS激活為A1釋放補(bǔ)體C1r、C1s、C3、C4和TNF-α等有害物質(zhì)（其中C3是A1的標(biāo)志物）引起炎癥反應(yīng)和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞（Reactive astrocyte，RAS）增生并與MG共同作用導(dǎo)致神經(jīng)元和成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡。GDNF能夠抑制AS活化促進(jìn)其向A2轉(zhuǎn)變并向損傷部位遷移，同時(shí)促進(jìn)AS存活并上調(diào)抗炎細(xì)胞因子TGF-β的表達(dá)，促進(jìn)軸突的形成和神經(jīng)保護(hù)［5］。GDNF還能夠通過(guò)抑制Caspase-3/Akt通路的激活來(lái)減少AS死亡［3］。但是研究發(fā)現(xiàn)，增加GDNF的濃度并不能增加AS的數(shù)量，而GDNF抑制AS活化并促進(jìn)其轉(zhuǎn)變?yōu)锳2的作用機(jī)制尚不清楚［6］。GDNF可以有效降低GFAP表達(dá)，在與SCs聯(lián)合應(yīng)用還能夠誘導(dǎo)二者的直接接觸及交叉遷移，逆轉(zhuǎn)AS肥大，減少RAS增生，促進(jìn)軸突再生［8］。

3 GDNF促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)

3.1 GDNF促進(jìn)神經(jīng)元的存活修復(fù)GDNF能夠促進(jìn)多種神經(jīng)元的存活修復(fù)，并能夠增強(qiáng)脊髓γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid,GABA）能神經(jīng)元的可塑性、促進(jìn)GABA遞質(zhì)釋放、軸突再生及延長(zhǎng)、突觸形成等，促進(jìn)SCI的修復(fù)并改善疾病的功能預(yù)后。GDNF能夠激活MEK/ERK信號(hào)通路，使突觸蛋白Ⅰ和突觸素等蛋白水平升高，促進(jìn)軸突延長(zhǎng)、突觸形成及可塑性［14］。GDNF通過(guò)增加N型鈣離子通道、ERK依賴性電壓門控通道的Ca2+濃度促進(jìn)GABA神經(jīng)元的遞質(zhì)釋放來(lái)抑制MG活化，釋放促炎細(xì)胞因子、減少局部組織的氧耗量和血流量，促進(jìn)損傷組織修復(fù)。GDNF能夠有效抑制SCI引起的乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）外漏，維持神經(jīng)元細(xì)胞膜的完整性并維持和促進(jìn)線粒體膜電位的穩(wěn)定性。GDNF可以減少SCI后N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）引發(fā)的鈣內(nèi)流，抑制細(xì)胞毒性物質(zhì)釋放（注意，GDNF不能抑制由非N-甲基-D-天冬氨酸激動(dòng)劑引起的細(xì)胞興奮性毒性反應(yīng)），GDNF抑制凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9及自噬誘導(dǎo)蛋白Beclin-1、LC3的表達(dá)，上調(diào)BCL-2、HSP60的表達(dá)水平，抑制神經(jīng)元的死亡，提高SCI后神經(jīng)元的生存率［14-15］。

3.2 GDNF促進(jìn)軸突的再生、髓鞘形成GDNF能夠?qū)ι窠?jīng)元內(nèi)的微管和微絲進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)Tau蛋白、乙?；⒐艿鞍椎鹊谋磉_(dá)，促進(jìn)微管聚合和動(dòng)態(tài)組裝、增強(qiáng)微管的穩(wěn)定性并控制神經(jīng)元胞體極化，誘導(dǎo)細(xì)胞微管極化至軸突末端，促進(jìn)生長(zhǎng)錐的遷移和延長(zhǎng)。GDNF還能夠提高SCI后GAP-43、NF-200、MAP等蛋白的表達(dá)，促進(jìn)較厚且致密的髓鞘形成，同時(shí)促使神經(jīng)纖維沿軸突縱軸走形，促進(jìn)有髓軸突的形成及定向延長(zhǎng)［15］。GDNF還能夠調(diào)節(jié)N-cadherin/β-catenin通路協(xié)調(diào)修飾突觸組裝和可塑性，在突觸發(fā)育中起到關(guān)鍵作用［16］。

4 GDNF與其他物質(zhì)在神經(jīng)修復(fù)中的聯(lián)合應(yīng)用

4.1 GDNF與生物支架在神經(jīng)修復(fù)中的聯(lián)合應(yīng)用GDNF為大分子蛋白類物質(zhì)，半衰期短，理化性質(zhì)不穩(wěn)定，靜脈及經(jīng)消化道給藥的效果不理想。且GDNF不能通過(guò)血脊髓屏障，這極大地限制其在脊髓損傷中的應(yīng)用，而通過(guò)原位注射等方法直接作用于脊髓部位又會(huì)造成局部藥物濃度過(guò)高引起神經(jīng)細(xì)胞的異常發(fā)芽、蛋白水解酶的破壞等問(wèn)題，直接影響脊髓修復(fù)。而用生物支架包載GDNF治療SCI的應(yīng)用，有效解決這一難題，較常見(jiàn)的生物支架有：殼聚糖、纖維蛋白（Silk-fifibroin，SF）、溫敏型肝素-泊洛沙姆（Heparin-poloxamer，HP）水凝膠等。殼聚糖生物毒性小，在體內(nèi)能被降解為單糖為機(jī)體所用，具有良好的生物相容性，能夠抑制纖維瘢痕的形成。黃成等［17］用水溶性較高的季銨鹽殼聚糖與甘油磷酸鈉復(fù)合成水凝膠支架，作為GDNF的載體同時(shí)包載干細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，在體外實(shí)驗(yàn)中有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)與向神經(jīng)細(xì)胞的定向分化。但是都未對(duì)其力學(xué)特性和控釋作用進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，在SCI的應(yīng)用中存在易變形的可能。辛林偉等［18］用膠原-殼聚糖制作的一種半透明多孔海綿狀結(jié)構(gòu)的圓柱形神經(jīng)導(dǎo)管，耐組織擠壓同時(shí)韌性較無(wú)機(jī)材料低不易引起神經(jīng)嵌頓，且在組織中幾乎完全降解。能夠連接斷裂軸突的兩個(gè)殘端，促進(jìn)軸突定向生長(zhǎng)。絲素蛋白（Silk-fifibroin，SF）是經(jīng)FDA批準(zhǔn)的一種成熟的組織支架生物材料，具有抗打結(jié)、可縫合的特點(diǎn)，其力學(xué)特性與脊髓組織相似，具有良好的組織相容性，并能夠支持和促進(jìn)細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)，在組織中可緩慢降解。JIAO等［19］從棕色海藻中提取的一種微球且表面多孔的陰離子聚合物海藻酸鹽（Alginates，AGs），利用其生物相容性、高吸水性等特點(diǎn)作為GDNF的控釋載體，同時(shí)以SF作為支架材料制作出SF/AGS支架復(fù)合物，來(lái)包載人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）和GDNF治 療SCI。SF/AGs能 夠 保 證GDNF的生物活性并能夠控釋GDNF達(dá)10天以上，同時(shí)還能夠增強(qiáng)GDNF和hUCMSCs對(duì)脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的改善作用。CARVALHO等［20］自主研發(fā)了一種酶交聯(lián)纖維蛋白導(dǎo)管（Enzymatically crosslinked silk-fifibroin，ESF）用于外周神經(jīng)損傷的治療。通過(guò)酶交聯(lián)的方法使ESF來(lái)負(fù)載生長(zhǎng)因子。而GDNF與NGF相比對(duì)ESF的親和力更高，包埋率更高，能夠更持久的控釋，從ESF導(dǎo)管對(duì)GDNF的控制性釋放能夠持續(xù)到50天。ESF負(fù)載生長(zhǎng)因子能夠在保證其生物活性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)跨越長(zhǎng)神經(jīng)間隙的神經(jīng)再生。溫敏型肝素-泊洛沙姆水凝膠為肝素與泊洛沙姆407結(jié)合形成的復(fù)合物［21］，HP即保留了肝素對(duì)蛋白類藥物的高親和力及肝素的抗凝作用，又具有泊洛沙姆的溫敏特性及三維結(jié)構(gòu)，保證多種生長(zhǎng)因子生物活性的同時(shí)能夠發(fā)揮穩(wěn)定控制作用30天以上，LI等［22］對(duì)HP的溫敏特性和高效率包載進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，并從流變學(xué)角度分析HP比單純的泊洛沙姆407對(duì)溫度上升更敏感，并能夠增強(qiáng)GDNF類生長(zhǎng)因子的神經(jīng)修復(fù)能力。HP與以上所述的幾種生物支架材料一樣具有三維的多孔結(jié)構(gòu)及良好的生物相容性，但是HP能夠有效抑制SCI引起的凝血異常，避免高凝狀態(tài)對(duì)SCI修復(fù)的不利影響，相比較而言HP更有利于SCI修復(fù)［15，21-23］。

4.2 GDNF與干細(xì)胞在神經(jīng)修復(fù)中的聯(lián)合應(yīng)用GDNF與干細(xì)胞在神經(jīng)修復(fù)中的聯(lián)合應(yīng)用，能夠有效提高移植干細(xì)胞的存活、促進(jìn)其生長(zhǎng)增殖及分化，同時(shí)能夠有效發(fā)揮促神經(jīng)元存活、軸突再生延長(zhǎng)、抑制膠質(zhì)瘢痕形成、抗細(xì)胞凋亡等作用。目前GDNF是否能促進(jìn)干細(xì)胞分泌多種生長(zhǎng)因子現(xiàn)在尚不明確，但GDNF能夠以慢病毒為載體對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行基因修飾促進(jìn)干細(xì)胞表達(dá)更多的GDNF。GDNF與施萬(wàn)細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞與干細(xì)胞直接接觸從而促進(jìn)二者之間的交叉遷移同時(shí)抑制GFAP的表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘢痕的形成，促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞的髓鞘形成，促進(jìn)有髓軸突的再生及遠(yuǎn)距離延長(zhǎng)。GDNF和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的共同作用，抑制SCI中MG的活化，并抑制MG轉(zhuǎn)化為M1型，促使其向M2轉(zhuǎn)變。同時(shí)抑制SCI引起的乳酸脫氫酶的外漏、維持神經(jīng)元內(nèi)線粒體膜電位的穩(wěn)定，促進(jìn)神經(jīng)元的存活。還能夠有效減少細(xì)胞毒性物質(zhì)的釋放和中樞病理性疼痛的產(chǎn)生和持續(xù)。GDNF與hUCMSCs一起使用能夠更加有效的促進(jìn)MAP2、NeuN和Nestin蛋白的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)元的再生修復(fù)及微管的穩(wěn)定、軸突的遠(yuǎn)距離延長(zhǎng)、hUCMSCs向神經(jīng)元定向分化，還能夠有效抑制IL-1β、IL-6和TNFα等炎性物質(zhì)釋放［19］。GDNF與干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用及通過(guò)病毒對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行GDNF基因修飾用于治療SCI［24-26］，是目前的研究熱點(diǎn)。為SCI的治療打開(kāi)了新的思路和方法。

5 總結(jié)與展望

雖然已經(jīng)證實(shí)GDNF具有促進(jìn)損傷神經(jīng)元的存活、軸突再生延長(zhǎng)、髓鞘形成等神經(jīng)修復(fù)作用，但是GDNF在抑制SCI后氧自由基和NO的產(chǎn)生、促進(jìn)血脊髓屏障及血管系統(tǒng)的修復(fù)、抑制反應(yīng)性星形細(xì)胞增生、調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的類型變化等方面的具體作用機(jī)制還不清楚，有待進(jìn)一步研究。而在一定的濃度范圍內(nèi)GDNF的作用存在劑量依賴性，超出這個(gè)范圍，較高濃度的GDNF反而會(huì)產(chǎn)生軸突異常發(fā)芽等不利作用。而目前采用多生長(zhǎng)因子聯(lián)合、干細(xì)胞與GDNF聯(lián)合等多種應(yīng)用方法又為SCI的治療創(chuàng)新性的開(kāi)拓了新的思路，GDNF的聯(lián)合應(yīng)用有很廣闊的治療前景，隨著治療手段和研究技術(shù)等的不斷完善和進(jìn)步，必定能在脊髓損傷中發(fā)揮重大作用，極大地推動(dòng)脊髓損傷研究的進(jìn)展。