朱克鵬，肖勛蓉，羅義，尹均明，弋文，何英，宋遠(yuǎn)鵬，杜果城

1川北醫(yī)學(xué)院附屬南充市中心醫(yī)院乳腺外科，四川南充637000；

2川北醫(yī)學(xué)院附屬南充市中心醫(yī)院康復(fù)科

三陰乳腺癌（TNBC）是乳腺癌常見的亞型，其雌、孕激素受體和人表皮生長因子受體表達(dá)均為陰性，占所有乳腺癌的15%～20%，并且具有惡性程度高，易侵襲、轉(zhuǎn)移的特點，預(yù)后較差［1］。盡管隨著外科手術(shù)、放化療技術(shù)的發(fā)展，乳腺癌的治療效果明顯提高，但乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移仍是患者死亡的主要原因［2］。相比于非TNBC，TNBC具有更高的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率［3］。

微小RNA（miRNA）是一類近年發(fā)現(xiàn)的具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的小分子單鏈RNA，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要調(diào)控作用［4］。miR-944是近期新發(fā)現(xiàn)的一個腫瘤相關(guān)的miRNA分子，其參與調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移［5-7］。目前miR-944在TNBC中的作用及機制尚不明確。2020年8月—2021年2月，我們觀察了miR-944在TNBC細(xì)胞系中的表達(dá)變化，探討了其對TNBC細(xì)胞侵襲、遷移能力和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，并進(jìn)一步探討了其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料人TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231、MDAMB-453、HCC1806及正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100均購自美國ATCC公司，培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%青霉素—鏈霉素溶液的細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃、95%飽和濕度及5%CO2的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)70%時，應(yīng)用0.25%胰酶消化傳代。TRIzol試劑購自北京達(dá)科為生物公司；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自大連寶生物公司；miR-944模擬物（miR-944 mimics）、陰性對照物（NC-mimics）及引物均購自上海吉瑪制藥公司；Transwell小室購自美國Corning公司；Mgtrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司；Ecadherin、Vimentin、Fibronectin、GATA6及GAPDH抗體均購自美國CST公司。

1.2 人TNBC細(xì)胞系及正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100中miR-944的檢測采用qRT-PCR法。應(yīng)用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：16℃、30 min，45℃、30 min，85℃、5 min。取cDNA和PCR引物，按照qRT-PCR試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行擴增反應(yīng)，PCR反應(yīng)條件：94℃、15 min，94℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共40個循環(huán)。miR-944引物序列：上游：5＇-AAATTATTGTA?CATCGGATGAG-3＇，下游：5＇-AAATTGTATAAAGA?GA AATT-3＇；U6引物序列：上游：5＇-CTCGCTTCG?GCAGCACA-3＇，下游：5＇-AACGCTTCACGAATTTGC?GT-3＇。以U6作為內(nèi)參基因，應(yīng)用2-ΔΔCt法計算miR-944的相對表達(dá)量。TNBC細(xì)胞系MDA-MB-231、MDA-MB-453、HCC1806及正常乳腺上皮細(xì)胞系HBL-100中miR-944的相對表達(dá)量分別為0.23±0.10、0.51±0.11、0.60±0.09、0.96±0.06。與HBL-100細(xì) 胞 相 比，TNBC細(xì) 胞 系MDA-MB-231、MDA-MB-453、HCC1806中miR-944的相對表達(dá)量均降低（P均＜0.05）。選取miR-944相對表達(dá)量最低的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 MDA-MB-231細(xì)胞分組及miR-944轉(zhuǎn)染方法收集對數(shù)生長期的MDA-MB-231細(xì)胞接種于6孔板，將細(xì)胞分為2組，即陰性對照組（miR-944-NC組）和miR-944過表達(dá)組（miR-944-IN組），待細(xì)胞融合度達(dá)70%時按照Lipofectamine2000說明書操作，將NC-mimics轉(zhuǎn)染至miR-944-NC組細(xì)胞，將miR-944 mimics轉(zhuǎn)染至miR-944-IN組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)置入37℃、95%飽和濕度及5% CO2的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 MDA-MB-231細(xì)胞miR-944的檢測采用qRT-PCR法。詳細(xì)步驟同1.2。

1.5 MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力檢測采用細(xì)胞劃痕實驗。收集各組MDA-MB-231細(xì)胞，接種至6孔細(xì)胞板，細(xì)胞密度2×105個/孔，置入37℃、95%飽和濕度及5% CO2的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪至90%后，使用100 μL移液槍頭垂直細(xì)胞板上制造“一”形劃痕，PBS沖洗細(xì)胞板3次后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察“一”形劃痕愈合情況，計算劃痕愈合率（%）表示細(xì)胞遷移能力。

1.6 MDA-MB-231細(xì)胞侵襲能力檢測采用Tran?swell侵襲實驗。從-20℃冰箱取出Mgtrigel基質(zhì)膠，對Transwell小室底膜上室面進(jìn)行均勻預(yù)鋪。收集各組MDA-MB-231細(xì)胞，無血清細(xì)胞培養(yǎng)基重懸各組細(xì)胞制作細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度1×105/mL。各組取200 μL細(xì)胞懸液接種至Transwell小室上室，下室加入600 μL含10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37℃、95%飽和濕度及5% CO2的恒溫環(huán)境中培養(yǎng)48 h后取出Transwell小室，拭除小室上室面未穿膜的細(xì)胞后，以4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，然后用0.1%結(jié)晶紫溶液染色10 min，應(yīng)用顯微鏡觀察并拍照，隨機選擇6個不重復(fù)的視野計數(shù)細(xì)胞數(shù)目。

1.7 MDA-MB-231細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、Fi?bronectin、GATA6蛋白的檢測采用Western blot?ting法。收集各組MDA-MB-231細(xì)胞，應(yīng)用細(xì)胞裂解液裂解，抽取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按照每泳道30 μg蛋白樣品進(jìn)行上樣，經(jīng)100 g/L的SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，洗膜后，將膜置于50 g/L的脫脂奶粉封閉液中封閉1 h，洗膜后置入稀釋的一抗E-cadherin（稀釋度1∶500）、Fibro?nectin（稀 釋 度1∶1 000）、Vimentin（稀 釋 度1∶1 000）、GATA6（稀釋度1∶1000）和GAPDH（稀釋度1∶1 000）溶液中繼續(xù)室溫孵育2 h，次日洗膜后置于稀釋的二抗（稀釋度1∶2 000）溶液中，室溫孵育1 h，加入ECL顯影液顯影。采用Quality One軟件計算各蛋白的相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以-x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-944-IN組 和miR-944-NC組miR-944相 對表達(dá)量比較miR-944-IN組和miR-944-NC組MDAMB-231細(xì)胞中miR-944的相對表達(dá)量分別為4.23 ±0.23、1.02±0.03。與miR-944-NC組 相比，miR-944-IN組MDA-MB-231細(xì) 胞 中miR-944的相對表達(dá)量升高（P＜0.05），提示轉(zhuǎn)染效率較高，過表達(dá)miR-944的MDA-MB-231細(xì)胞構(gòu)建成功。

2.2 miR-944-IN組 和miR-944-NC組MDA-MB-231細(xì)胞遷移、侵襲能力比較miR-944-NC組和miR-944-IN組MDA-MB-231細(xì)胞的劃痕愈合率分別為67.1%±5.8%、22.6%±3.2%。與miR-944-NC組相比，miR-944-IN組MDA-MB-231細(xì)胞劃痕愈合率降低（P＜0.05）。miR-944-IN組和miR-944-NC組穿膜細(xì)胞數(shù)量分別為（130±21）、（264±34）個。與miR-944-NC組相比，miR-944-IN組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少（P＜0.05），見圖1。

圖1 兩組侵襲細(xì)胞顯微鏡下表現(xiàn)

2.3 miR-944-IN組和miR-944-NC組細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin、Fibronectin、Vimentin蛋白及GATA6蛋白相對表達(dá)量比較與miR-944-NC組相比，miR-944-IN組細(xì)胞E-cadherin蛋白相對表達(dá)量升高（P＜0.05），F(xiàn)ibronectin、Vimentin蛋白相對表達(dá)量降低（P均＜0.05）。與miR-944-NC組相比，miR-944-IN組細(xì)胞中GATA6蛋白相對表達(dá)量降低（P＜0.05）。兩組EMT相關(guān)蛋白、GATA6蛋白相對表達(dá)量見表1。

表1 兩組EMT相關(guān)蛋白、GATA6蛋白相對表達(dá)量（±s）

表1 兩組EMT相關(guān)蛋白、GATA6蛋白相對表達(dá)量（±s）

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3 討論

乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤。據(jù)美國癌癥協(xié)會報道，乳腺癌占所有新發(fā)癌癥病例的30%，是女性癌癥相關(guān)性死亡的主要原因［8］。乳腺癌具有高度的異質(zhì)性，為了進(jìn)一步完善臨床診斷，根據(jù)雌、孕激素受體和人表皮生長因子受體表達(dá)的免疫組化特征，又將乳腺癌分為幾個分子亞型，包括Luminal A型乳腺癌、Luminal B型乳腺癌、HER-2陽性乳腺癌和TNBC，其中TNBC具有惡性程度高、發(fā)病年齡低、易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差的特點，目前仍缺乏有效的治療手段［9］。因此，開發(fā)探索一種新的靶向治療方法以提高TNBC的臨床療效具有重要意義。

miRNAs是非編碼的單鏈小分子RNA，含有約22個核苷酸，是靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子。研究顯示，miRNAs在多種生物過程中發(fā)揮重要作用［10］。近年越來越多的證據(jù)表明，miRNAs參與了癌癥的發(fā)生及進(jìn)展，作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miRNA在癌癥標(biāo)志物及靶向治療方面的研究已經(jīng)成為當(dāng)前研究的熱點問題［11］。miR-944是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)miRNA分子，與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲有關(guān)［12］。研究顯示，miR-944能夠抑制鼻咽癌［13］、肺腺癌［14］、結(jié)直腸癌［15］、胃癌［16］等腫瘤細(xì)胞的生長及轉(zhuǎn)移，但在宮頸癌［17-18］、子宮內(nèi)膜癌［19］、食管鱗癌［20］等腫瘤的研究中卻發(fā)現(xiàn)，miR-944作為癌基因起著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移的作用，提示miR-944在不同的癌癥中具有高度異質(zhì)性。至今，miR-944對TNBC細(xì)胞生長及轉(zhuǎn)移的影響和機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-944在TNBC細(xì)胞系中的表達(dá)較正常乳腺上皮細(xì)胞系明顯降低，提示miR-944在TNBC中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-944模擬物使得MDA-MB-231細(xì)胞中miR-944過表達(dá)，細(xì)胞劃痕實驗和Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-944后的MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲能力均明顯降低，進(jìn)一步證實miR-944能夠抑制TNBC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

研究顯示EMT是影響癌細(xì)胞侵襲遷移的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EMT是抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要策略［21］。本研究證實過表達(dá)miR-944的MDAMB-231細(xì)胞上皮細(xì)胞源性標(biāo)志物E-cadherin蛋白的相對表達(dá)量顯著升高，間質(zhì)細(xì)胞源性標(biāo)志物Fibro?nectin、Vimentin等蛋白的相對表達(dá)量顯著降低，提示miR-944對TNBC細(xì)胞侵襲遷移能力的影響與其對EMT的調(diào)控有關(guān)。

GATA6屬GATA轉(zhuǎn)錄因子家族，具有高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)，能夠識別并結(jié)合GATA序列，在組織細(xì)胞的生長、發(fā)育及分化中均起著重要的作用［22］。目前較多研究發(fā)現(xiàn)，GATA6與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且與腫瘤的EMT有關(guān)［23-24］。目前研究也已經(jīng)證實，GATA6在乳腺癌組織和細(xì)胞中表達(dá)升高，并且促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移及EMT［25-26］。研究顯示，GATA6作為miR-944的調(diào)控靶基因在惡性腫瘤的生長轉(zhuǎn)移及EMT的調(diào)控中發(fā)揮重要的作用［27-28］。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-944的MDA-MB-231細(xì)胞GATA6蛋白的相對表達(dá)量顯著降低，提示miR-944對TNBC細(xì)胞侵襲遷移及EMT的影響可能與其對GATA6的調(diào)控有關(guān)。

綜上所述，miR-944在TNBC細(xì)胞系中相對表達(dá)量降低。過表達(dá)miR-944能夠抑制TNBC細(xì)胞的遷移、侵襲及EMT，其機制可能與其對GATA6基因的調(diào)控有關(guān)，為TNBC的靶向治療提供了新的研究方向。本研究并沒有對miR-944在TNBC組織中表達(dá)進(jìn)行檢測，有待進(jìn)一步檢測miR-944在TNBC組織中表達(dá)情況，探討其表達(dá)與TNBC患者臨床病理特征的關(guān)系。