邱 楓，謝婷婷，荀 航，王煜煒，姚 曦，湯 鋒*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，合肥 230036；2. 國際竹藤中心，國家林業(yè)和草原局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100102)

印楝素（Azaidrachtin）是從印楝（Azadirachta indica）中提取的一類四環(huán)三萜類化合物，具有拒食、趨避和干擾昆蟲生長發(fā)育等多種生物活性，是目前開發(fā)最成功的植物源殺蟲劑之一，已在中國、美國、加拿大和印度等多個(gè)國家登記使用，市場(chǎng)需求巨大[1]。其主要活性成分是印楝素A和B，約占99%，其中印楝素A的含量最高，活性最強(qiáng)[2-3]。

目前對(duì)印楝素生物合成途徑的認(rèn)識(shí)，基本停留于推理和假說層面。Akhila等利用14C標(biāo)記研究印楝素、nimbin及茄堿苷的生物合成途徑，證明甲羥戊酸參與了3種物質(zhì)的合成[4]；Seigler等推測(cè)2,3-環(huán)氧鯊烯在酶的催化下形成大戟二烯醇，再經(jīng)一系列反應(yīng)生成印楝素A[5]。謝婷婷等利用印楝素A無細(xì)胞合成體系，通過外源添加底物，證明羊毛甾醇不是印楝素A的合成前體，2,3-環(huán)氧鯊烯和丁酰鯨魚醇是印楝素A的前體，nimbin、大戟二烯醇、脫乙酰茄堿苷和茄堿苷極可能是印楝素A的合成前體，并且茄堿苷位于合成途徑較下游的位置[6]。

印楝素生物合成涉及多種酶促反應(yīng)，在植物體內(nèi)開展研究難度極大，進(jìn)展緩慢。因此，借助現(xiàn)代組學(xué)技術(shù)，探討印楝素生物合成途徑，受到科學(xué)家的關(guān)注。Krishnan等完成了印楝基因組的測(cè)序，篩選出8個(gè)可能與印楝素生物合成相關(guān)的基因[7-8]；Kurvadi等通過高通量測(cè)序和UPLC技術(shù)，獲得150余個(gè)可能涉及印楝素合成的候選基因[9]。代謝輪廓分析是連接代謝組學(xué)和功能基因組學(xué)的紐帶，無論是在細(xì)胞和植株層面上實(shí)施誘導(dǎo)，還是分子水平上操縱基因，都需要知道代謝產(chǎn)物的應(yīng)答表現(xiàn)[10]。

因此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上，以印楝愈傷組織為材料，研究前體（鯊烯）和誘導(dǎo)子（茉莉酸甲酯）處理后印楝代謝輪廓的變化，分析差異代謝產(chǎn)物，探討鯊烯和MeJ對(duì)印楝素生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)的影響，以期為揭示印楝素生物合成途徑，深入認(rèn)識(shí)印楝素代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)，為利用生物技術(shù)合成和提高印楝素產(chǎn)量提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 植物材料 印楝為4年生植株。印楝種子采于中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所元江試驗(yàn)站（云南省元江縣），常規(guī)消毒后，室溫浸種48 h，播種于營養(yǎng)缽中育苗。實(shí)生苗轉(zhuǎn)盆后，置于中國林業(yè)科學(xué)研究院溫室中常規(guī)盆栽。

1.1.2 主要試劑及儀器 （1）主要試劑。Azadirachtin B、Azadirachtin D、Azadirachtin H、Azadiradoine、Nimbin及Salannin為實(shí)驗(yàn)室分離制備所得[11]；Azadirachtin A購于Sigma公司。色譜級(jí)甲醇、乙腈及乙醇購于默克公司；超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備得到。

（2）主要設(shè)備儀器。超高效液相色譜系統(tǒng)（日本島津?qū)嶒?yàn)器材有限公司Shimadzu CBM30A）；串聯(lián)四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（ESI）（美國賽默飛世爾科技有限公司）；研磨儀（德國弗爾德儀器設(shè)備有限公司MM 400）。

1.2 研究方法

1.2.1 樣品制備與提取 愈傷組織分別飼喂100 μmol·L-1MeJ、500 μmol·L-1鯊烯及同時(shí)飼喂100 μmol·L-1MeJ和500 μmol·L-1鯊烯，培養(yǎng)24 h后收集，真空冷凍干燥7 d后備用，以無菌水為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

用研磨儀按30 Hz的頻率，將凍干后的愈傷組織樣品研磨1.5 min，至粉末狀。稱取100 mg樣品粉末，加1.0 mL 70%甲醇，4 ℃靜置提取24 h；10 000 g離心10 min，收集上清液，經(jīng)吸附柱（CNWBOND Carbon-GCB SPE，250mg，3mL）和微孔濾膜（0.22 μm）過濾，待檢測(cè)。

1.2.2 檢測(cè)條件 （1）色譜條件。Waters Acquity UPLC HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱，流動(dòng)相A和B分別為0.04%乙酸水溶液和含0.04%乙酸的乙腈溶液。采用梯度洗脫，梯度設(shè)置為：0 min，A∶B = 95∶5；11.0 min，A∶B = 5∶95；12.0 min，A∶B = 5∶95，12.1～15.0 min，A∶B = 95∶5。流速0.4 mL·min-1，柱溫40℃，進(jìn)樣量2 μL。

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧正離子電離模式，質(zhì)量掃描范圍50～2 000 Da，碰撞氣為高純氮?dú)猓∟2）。電噴霧離子源（ESI）溫度500℃，毛細(xì)管電壓5 500 V，簾氣25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。通過去簇電壓和碰撞能優(yōu)化進(jìn)行掃描檢測(cè)。

1.2.3 定性定量分析 基于武漢邁特維爾生物科技有限公司自建數(shù)據(jù)庫MWDB（metware database）及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫，根據(jù)一級(jí)和二級(jí)譜信息，去除對(duì)數(shù)據(jù)分析有影響的同位素信號(hào)和含K+、Na+和NH4+等離子及大分子量物質(zhì)的碎片離子等重復(fù)信號(hào)，對(duì)代謝物進(jìn)行定性。利用三重四級(jí)桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，以特征離子峰面積進(jìn)行定量。

1.2.4 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理 運(yùn)用主成分分析法（PCA）進(jìn)行無監(jiān)督分析，預(yù)判不同處理的整體趨勢(shì)，隨后利用有監(jiān)督的正交偏最小二乘法（OPLS-DA）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，驗(yàn)證OPLS-DA模型的擬合程度?；贠PLS-DA結(jié)果，差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）與VIP結(jié)合篩選差異代謝物。篩選標(biāo)準(zhǔn)為FC≥1.5或≤0.66，且VIP值≥1。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)量及代謝物總體分析

2.1.1 主成分分析結(jié)果 在PC1維中，MeJ、鯊烯（SS）以及MeJ和鯊烯共處理（MS）樣品與對(duì)照組（CK）存在顯著的分離趨勢(shì)，表明3種處理代謝物與對(duì)照組存在顯著差異（圖1）。SS組與MeJ和MS組之間分離顯著，表明鯊烯對(duì)代謝物影響與MeJ存在差異。MeJ、SS、MS和CK4種處理在PC2維上分離顯著。

圖1 主成分分析結(jié)果Figure 1 Results of principal component analysis

2.1.2 OPLS-DA分析結(jié)果 MeJ、鯊烯以及MS分別與對(duì)照組比較，3組的預(yù)測(cè)參數(shù)R2X、R2Y和Q2均接近1，表明模型穩(wěn)定可靠，可以做后續(xù)的差異成分的篩選（圖2）。

圖2 OPLS-DA分析圖Figure 2 OPLS-DA analysis diagram

2.1.3 代謝物種類及其分布 基于MWDB數(shù)據(jù)庫及代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫，通過質(zhì)譜信息檢索，共鑒定出767種代謝物。442個(gè)代謝物分布在初生代謝途徑，其中有機(jī)酸及其衍生物、氨基酸及其衍生物和脂質(zhì)3類物質(zhì)數(shù)目最多，分別占初級(jí)代謝物的26.7%、21.9%和15.6%。鑒定次生代謝產(chǎn)物287個(gè)，其中黃酮類代謝物最多（169個(gè)），占次生代謝物的58.9%，萜類代謝物14個(gè)。有38個(gè)代謝物未得到明確分類（圖3）。

圖3 代謝物總分布Figure 3 Metabolite profile

2.2 鯊烯和MeJ對(duì)印楝愈傷組織初生代謝的影響

2.2.1 MeJ對(duì)印楝愈傷組織初生代謝的影響 MeJ處理影響印楝52種初級(jí)代謝物，27種表達(dá)上調(diào)，25種表達(dá)下調(diào)，見圖4（a）。涉及糖類、氨基酸和脂類等8類，其中對(duì)有機(jī)酸及衍生物（17種）、脂質(zhì)（14種）和氨基酸及衍生物（10種）影響較大。除5種奎寧酸類物質(zhì)外，其余有機(jī)酸類均有明顯的增加。MeJ強(qiáng)烈促進(jìn)脂肪酸十三烷內(nèi)脂的合成，多數(shù)甘油磷脂的代謝明顯提高。L-高瓜氨酸、高精氨酸和N-(3-吲哚乙?；?-L-丙氨酸代謝降低，其余氨基酸類代謝均增強(qiáng)。

2.2.2 鯊烯對(duì)印楝愈傷組織初生代謝物的影響 鯊烯影響49種初生代謝物的合成，其中36種表現(xiàn)為下調(diào)，見圖4（b）。共有8類差異代謝物，對(duì)有機(jī)酸及衍生物影響最大（15種），除3,5-二羥基-3-甲基戊酸、6-氨基己酸、延胡索酸和D-泛酸等4種上調(diào)，其余有機(jī)酸均受到抑制。13種胺類代謝物受到影響，酚胺類物質(zhì)受到抑制，色胺類物質(zhì)代謝增強(qiáng)。

2.2.3 鯊烯和MeJ共同作用對(duì)印楝愈傷組織初生代謝物的影響 鯊烯和MeJ的協(xié)同作用顯著調(diào)控愈傷組織的初生代謝，影響7類53種初生代謝物，34種表現(xiàn)下調(diào)，19種為上調(diào)，見圖4（c）。有機(jī)酸及衍生物受影響最大（17種），8種表現(xiàn)為上調(diào)。與單獨(dú)處理結(jié)果一致，兩者共處理抑制奎寧酸的代謝。其次為胺類物質(zhì)（10種），其中酚胺和色胺類物質(zhì)的代謝受到抑制。10種氨基酸及衍生物受到兩者共同調(diào)控，其中4種氨基酸的代謝上調(diào)。

圖4 MeJ和鯊烯處理影響初生代謝物分布Figure 4 The distribution of primary metabolites treated with MeJ and squalene

2.3 鯊烯和MeJ對(duì)印楝愈傷組織次生代謝物影響

2.3.1 MeJ對(duì)印楝愈傷組織次生代謝的影響 經(jīng)MeJ處理后，差異次生代謝物有80種，47表達(dá)上調(diào)，33種下調(diào)，包括4種生物堿類、4種萜類和72種苯丙烷類及衍生物。其中黃酮類物質(zhì)最多（47種），大部分受到抑制；其次為酚類物質(zhì)（25種），13種代謝上調(diào)。這與甘草、蒙古黃芪等植物中的研究結(jié)果一致[12-15]。MeJ調(diào)控的4種萜類物質(zhì)為印楝素B、諾米林、葫蘆素E和Azadiradione，其中前3種代謝受到抑制。

2.3.2 鯊烯對(duì)印楝愈傷組織次生代謝物的影響 鯊烯處理后差異次生代謝物共88種，20種上調(diào)，68種下調(diào)（圖5）。苯丙烷類及衍生物中差異代謝物最多（80種），其中黃酮類物質(zhì)65種，占74.7%。其次為萜類物質(zhì)，包括印楝素A、B、H及Salannin、Nimbin。除印楝素B外，其余物質(zhì)代謝均上調(diào)。

圖5 MeJ和鯊烯影響次生代謝物分布Figure 5 The distribution of secondary metabolites treated with MeJ and squalene

2.3.3 MeJ和鯊烯對(duì)印楝愈傷組織次生代謝物的共同影響 MeJ和鯊烯對(duì)印楝代謝有協(xié)同增效作用。MeJ和鯊烯共處理有79種差異次生代謝物，33種上調(diào)，46種下調(diào)。6種萜類物質(zhì)代謝發(fā)生明顯變化，其中印楝素A、Azadiradione和Nimbin代謝上調(diào)，印楝素B、諾米林和葫蘆素E代謝受抑制。此外，MeJ和鯊烯的協(xié)同作用對(duì)4種生物堿的代謝也有明顯調(diào)控。

2.4 種檸檬苦素類物質(zhì)的靶向代謝分析結(jié)果

選取印楝素A、B、D、H及Azadiradione、Nimbin、Salannin等7種檸檬苦素類物質(zhì)進(jìn)行靶向代謝分析，結(jié)果表明，鯊烯、MeJ以及兩者共存時(shí)，均能顯著促進(jìn)印楝素A、Azadiradione、Nimbin和Salannin的合成，對(duì)印楝素B、D的合成具有抑制作用。鯊烯促進(jìn)印楝素H的合成，MeJ不僅抑制印楝素H的合成，并能抵消鯊烯的作用（表1）。MeJ和鯊烯處理后印楝素A合成增加，印楝素B、D合成受到抑制，表明其存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。印楝素A和B結(jié)構(gòu)相似，僅丁烯酯部分環(huán)氧結(jié)構(gòu)上的-H和-OH不同[16]。說明MeJ可能通過調(diào)控印楝素B合成后期修飾酶活性，使更多的前體進(jìn)入印楝素A的代謝流。

表1 MeJ和鯊烯處理對(duì)檸檬苦素類代謝物的影響Table 1 Effects of MeJ and squalene on 7 limonin metabolites

前人研究發(fā)現(xiàn)，紫外燈照射下，印楝粗提物溶液通氧后Salannin和Nimbin可分別氧化為含有印楝素結(jié)構(gòu)和高生物活性的Isosalanninolide和Isonimbinolide，在植物體內(nèi)亦發(fā)現(xiàn)了此類物質(zhì)[17-18]。謝婷婷等亦發(fā)現(xiàn)，以Nimbin和Salannin為底物時(shí)印楝素A的產(chǎn)量顯著增加，認(rèn)為兩者是印楝素A的合成前體[6]，代謝物差異分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證Nimbin和Salannin是印楝素A合成前體。

Hansen等發(fā)現(xiàn)，Azadirone經(jīng)氧化、環(huán)化及質(zhì)子化等反應(yīng)，最終可合成Salannin和Nimbin[19]。由于具有特有的氧化模式，Azadiradione和Azadione是許多檸檬苦素類和四環(huán)三萜類化合物的合成前體[20]。Azadiradione合成與印楝素A變化趨勢(shì)一致，可推測(cè)Azadiradione亦為印楝素A合成前體。

2.5 鯊烯和MeJ對(duì)印楝素合成代謝網(wǎng)絡(luò)的影響

2.5.1 MeJ和鯊烯對(duì)印楝素合成初生代謝網(wǎng)絡(luò)的影響 印楝中碳水化合物代謝為MVA及MEP途徑提供乙酰CoA、丙酮酸和3-磷酸甘油醛。三萜類物質(zhì)的前體主要來自MVA途徑，MVA途徑和MEP途徑在植物體中可通過IPP進(jìn)行交流，因此兩種途徑均調(diào)控三萜物質(zhì)的合成（圖6）。

圖6 萜類代謝相關(guān)網(wǎng)絡(luò)Figure 6 Network diagram of terpenoids metabolism

MeJ和鯊烯影響葡糖酸內(nèi)酯、葡萄糖酸、D-果糖-6-磷酸和D-葡萄糖-6-磷酸等4種糖類物質(zhì)的代謝。葡糖酸內(nèi)酯和葡萄糖酸可通過Entner-Doudoroff pathway反應(yīng)產(chǎn)生3-磷酸甘油醛，D-果糖-6-磷酸和D-葡萄糖-6-磷酸經(jīng)糖酵解過程生成丙酮酸。乙酰CoA不僅是MVA途徑合成萜類物質(zhì)的前體，也是三羧酸循環(huán)不可或缺的參與者。經(jīng)鯊烯處理后，愈傷組織中延胡索酸和蘋果酸含量有不同程度地增加，而檸檬酸和α-酮戊二酸含量減少，表明TCA循環(huán)增強(qiáng)且向合成更多的乙酰CoA的方向進(jìn)行，釋放大量的能量，利于印楝素的合成。此外，乙酰CoA還是一種重要的乙?；w[21]，從鯊烯到印楝素的合成過程，涉及多步乙酰化反應(yīng)，大量乙酰CoA的合成有利于鯊烯向印楝素的合成。

MeJ和鯊烯調(diào)控豆蔻酸的代謝，且多種不飽和脂肪酸產(chǎn)量顯著變化。研究表明，豆蔻酸調(diào)控MVA途徑，不飽和脂肪酸通過提高胞壓和影響酶活促進(jìn)MVA途徑的代謝[22]。因此MeJ利用調(diào)控部分糖類和脂類的代謝影響印楝素的合成，鯊烯通過部分糖類和脂類的代謝以及TCA循環(huán)影響印楝素的合成。

2.5.2 MeJ和鯊烯對(duì)印楝素合成次生代謝網(wǎng)絡(luò)的影響 鯊烯是植物三萜和固醇類物質(zhì)的共同前體，減少固醇類物質(zhì)的合成有利于鯊烯參與三萜類化合物的合成。MeJ處理后，愈傷組織中印楝素A合成增加，而固醇類物質(zhì)維生素D的含量下降。同時(shí)添加MeJ和鯊烯，愈傷組織中維生素D含量仍明顯減少，印楝素A的增加量高于MeJ單獨(dú)處理，表明MeJ可通過抑制固醇類物質(zhì)的合成促進(jìn)印楝素代謝。磷酸吡哆醛是140多種細(xì)胞酶的輔酶，涉及氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶及合成酶6大酶類，在眾多細(xì)胞代謝中不可或缺[23]。印楝素生物合成涉及多種氧化、環(huán)化和異構(gòu)等酶的參與，鯊烯促進(jìn)磷酸吡哆醛的合成，有利于提高印楝素后期結(jié)構(gòu)修飾相關(guān)酶的活性。

綜上所述，MeJ通過促進(jìn)Entner-Doudoroff pathway反應(yīng)，糖酵解等初生代謝，抑制固醇類物質(zhì)合成等次生代謝，進(jìn)而調(diào)控印楝素的合成。鯊烯除影響Entner-Doudoroff pathway反應(yīng)和糖酵解外，還通過調(diào)控三羧酸循環(huán)、脂質(zhì)代謝以及結(jié)構(gòu)修飾相關(guān)酶的活性，影響印楝素的合成。

3 結(jié)論

MeJ和鯊烯顯著影響印楝愈傷組織的代謝活動(dòng)，MeJ處理后共檢132種差異代謝物，包括52種初生代謝物和80種次生代謝物。MeJ調(diào)控有機(jī)酸、脂質(zhì)、氨基酸以及黃酮類和酚類物質(zhì)的代謝，抑制印楝素B、諾米林和葫蘆素E的合成。鯊烯處理檢出137種差異代謝物，32種代謝物表達(dá)上調(diào)。靶向代謝組分析表明，MeJ和鯊烯顯著促進(jìn)印楝素A、Azadiradione、Nimbin和Salannin的合成，對(duì)印楝素B，D的合成具有抑制作用。表明Nimbin和Salannin是印楝素A生物合成途徑的中間代謝物，Azadiradione參與印楝素A的合成。

基于差異代謝物的分析，繪制了MeJ和鯊烯影響印楝素合成的相關(guān)代謝網(wǎng)絡(luò)，MeJ通過促進(jìn)Entner-Doudoroff pathway反應(yīng)，糖酵解等初生代謝，抑制固醇類物質(zhì)的次生代謝，調(diào)控印楝素A的合成。鯊烯影響Entner-Doudoroff pathway反應(yīng)和糖酵解，通過干預(yù)三羧酸循環(huán)、脂質(zhì)代謝以及結(jié)構(gòu)修飾相關(guān)酶的活性影響印楝素A的合成。