張伊動(dòng)，馬 香，李 宏，唐鴻倩，劉 柱，唐燕瓊

（海南大學(xué) 生命科學(xué)與藥學(xué)院，?？?570228）

維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）是一種革蘭氏陰性兼性厭氧菌，隸屬于氣單胞菌科、氣單胞菌屬[1]。有研究表明，這種新興的水生病原菌可以引起人類和動(dòng)物（包括水生動(dòng)物）的腹瀉、傷口感染和出血性敗血癥[2?3]。它兼具腸毒素、Ⅲ型分泌效應(yīng)蛋白AexU、組氨酸激酶BvgS、絲氨酸蛋白酶、外膜蛋白和鞭毛等多種毒力因子[4?5]，能給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)食品安全造成威脅[6?7]。例如：養(yǎng)殖場(chǎng)的鯰魚和黃顙魚感染維氏氣單胞菌后，會(huì)大量死亡[8?9]。因此，維氏氣單胞菌引起的魚類細(xì)菌性疾病是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展的重要因素，而解構(gòu)維氏氣單胞菌的抗逆性對(duì)維氏氣單胞菌的疾病防治具有重要意義。類CysB蛋白Cbl（CysB like protein）是LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。1995年，首次在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了cbl基因，它與cys調(diào)控子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CysB蛋白非常相似，與CysB具有40%的氨基酸序列同源性[10]。在硫代謝中，Cbl作為細(xì)胞內(nèi)硫酸鹽水平的傳感器，在體內(nèi)和體外激活tau和ssu啟動(dòng)子，控制?；撬岷椭咀寤撬猁}的轉(zhuǎn)運(yùn)及脫硫所需的tauABCD和ssuEADCB的轉(zhuǎn)錄，從而穩(wěn)定細(xì)菌體內(nèi)的硫酸鹽水平[11?13]。Cbl的功能與CysB高度同一，目前對(duì)Cbl的研究較少，但鑒于CysB現(xiàn)有的功能，可以推斷Cbl存在的潛在毒力控制、參與細(xì)菌體內(nèi)氧化應(yīng)激機(jī)制等重要功能[14?16]。因此，本研究以維氏氣單胞菌為研究對(duì)象，對(duì)Cbl蛋白進(jìn)行原核表達(dá)和純化，旨在為進(jìn)一步揭示Cbl蛋白的功能和機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）C4菌株、大腸桿菌BL21（DE3）以及含pET-28a質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α均為課題組保存菌株。

1.2 主要試劑與儀器Bacteria DNA Extraction Kit、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、FastPure Plasmid Mini Kit、2 × Phanta Max Master Mix以及2 × Rapid Taq Master Mix均購自Vazyme公司；限制性內(nèi)切酶（EcoRI-HF和HindIII-HF）及Fast T4 DNA Ligase /Buffers均購自NEB公司；卡那霉素（Kan，水溶，儲(chǔ)存的質(zhì)量濃度為50 g·L?1，工作質(zhì)量濃度為50 mg·L?1，?20 ℃保存）、異丙基?β?D 硫代半乳糖苷（IPTG，水溶，儲(chǔ)存濃度為0.1 mol·L?1，工作濃度為0.1 mmol·L?1，?20 ℃保存）、聚丙烯酰胺混合液（29∶1，體積比）、Tris、乙二胺四乙酸（EDTA）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）以及LB培養(yǎng)基（w=1%NaCl、w=1%蛋白胨和w=0.5%酵母提取物）均購自Solarbio公司。

Eppendorf Centrifuge 5418高速臺(tái)式離心機(jī)（Eppendorf 中國(guó)有限公司）、Life ECO-PCR 基因擴(kuò)增儀（杭州博日科技有限公司）、Bio-Rad MicroPulser電穿孔儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）、HZQ-F100 振蕩培養(yǎng)箱（哈爾濱市東聯(lián)生化儀器有限公司）、SYNERGY-H1多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司）、PowerPac?電泳儀（美國(guó)Bio-rad 公司）以及Typhoon FLA 9500多功能生物分子成像儀（浙江德力西電器有限公司）。

1.3 cbl基因片段的擴(kuò)增設(shè)計(jì)cbl基因擴(kuò)增引物（表1）。使用Bacteria DNA Extraction Kit提取維氏氣單胞菌C4總DNA，以維氏氣單胞菌C4基因組DNA為模板，利用cbl-F和cbl-R對(duì)cbl基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其片段大小為948 bp。PCR反應(yīng)體系為2 × Phanta Max Master Mix 25 μL，cbl-F（10 μmol·L?1）1 μL，cbl-R（10 μmol·L?1）1 μL，基因組DNA 1 μL，ddH2O 22 μL，反應(yīng)總體積為50 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min，94oC變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃后延伸10 min。PCR完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠（w=0.5%）電泳鑒定，再用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit純化回收擴(kuò)增的DNA片段。

表1 引物序列Tab. 1 Primer sequence

1.4 重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建使用FastPure Plasmid Mini Kit提取pET-28a質(zhì)粒，再用EcoRI-HF和HindⅢ-HF對(duì)純化回收的DNA片段和pET-28a質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit純化回收后按一定比例（質(zhì)?！闷蔚哪柋葹?∶5）使用Fast T4 DNA Ligase過夜連接，將擴(kuò)增出的cbl基因連入pET-28a載體的EcoRI（GAATTC）～ HindⅢ（AAGCTT）位點(diǎn)之間。將連接產(chǎn)物通過電擊轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，復(fù)蘇后涂布于含卡那霉素LB平板，過夜培養(yǎng)后挑菌驗(yàn)證，陽性克隆子送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.5 Cbl蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將含有pET-28a-Cbl重組載體的大腸桿菌BL21(DE3)菌株接種至含有50 mg·L?1卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃搖床培養(yǎng)至OD600在0.4～0.6之間，加入IPTG至終濃度為100 μmol·L?1，在150 r·min?1、15 ℃條件下，過夜誘導(dǎo)表達(dá)12 h。然后將菌液冷凍離心（4 ℃，4 000 r·min?1）10 min，用10 mL的 Tris-HCl（50 mmol·L?1Tris，350 mmol·L?1NaCl）緩沖液重懸菌體。超聲破碎儀設(shè)置：超聲時(shí)間5 s，間隙時(shí)間7 s，總時(shí)間25 min，溫度25～28 ℃，功率35%。冰上超聲破碎重懸的菌體后將破碎的菌體冷凍離心（4 ℃，12 000 r·min?1）10～15 min，分離得到沉淀和上清。提前取出鎳柱，用20 mL Tris-HCl緩沖液清洗2～3遍后關(guān)閉鎳柱閥門，將破碎上清注入鎳柱中并封口，置于冰上150 r·min?1孵育1 h。打開鎳柱閥門，流盡孵育上清，用50 mmol·L?1咪唑洗脫雜蛋白，100 mmol·L?1咪唑收集目的Cbl蛋白，500 mmol·L?1咪唑清洗鎳柱。最后進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。

1.6 Cbl蛋白純化剪下合適大小的透析袋，放入含有1 mmol·L?1EDTA-2Na的w=2% NaHCO3溶液中煮10 min，去離子水清洗后放入1 mmol·L?1EDTA-2Na溶液中再次煮10 min，再次用去離子水清洗透析袋。將誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白加入透析袋中，用含有φ=30%甘油的Tris-HCl作為透析液于4 ℃進(jìn)行透析，每6 h更換1次透析液，共透析12 h。取出透析袋中透析好的蛋白，SDS-PAGE觀察目的條帶，用BOSTER的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)量Cbl蛋白質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 pET-28a-Cbl重組載體構(gòu)建使用Bacteria DNA Extraction Kit提取維氏氣單胞菌C4基因組DNA，并用維氏氣單胞菌特異性引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，維氏氣單胞菌C4破碎菌體作為陽性對(duì)照。從圖1-A可知，提取的維氏氣單胞菌C4基因組DNA條帶單一清晰無雜帶，大小與陽性對(duì)照相比一致，約為200 bp，符合理論預(yù)期。而后經(jīng)功能酶標(biāo)儀檢測(cè)維氏氣單胞菌C4基因組DNA濃度為672.76 μg·L?1，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

將雙酶切后的維氏氣單胞菌cbl基因擴(kuò)增片段和pET-28a質(zhì)粒雙酶切片段用Fast T4 DNA Ligase酶連，電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中并涂布于含有50 mg·L?1卡那霉素的LB平板上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，對(duì)平板上長(zhǎng)出的單菌落使用pET-28a載體引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。從圖1-B可知，挑取的陽性克隆子的條帶處于1 000～1 500 bp之間，條帶單一清晰無雜帶，且與以空載的pET-28a質(zhì)粒作為模板的陽性對(duì)照相比相差約948 bp，符合理論預(yù)期，說明陽性克隆子成功的將cbl基因片段連入pET-28a載體。

圖1 構(gòu)建pET-28a-Cbl 重組載體Fig. 1 Construction of pET-28a-Cbl recombinant vector

富集培養(yǎng)后提取質(zhì)粒送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAMAN進(jìn)行分析，結(jié)果如圖1-C所示，陽性克隆子序列與維氏氣單胞菌C4基因組中cbl序列一致。進(jìn)一步驗(yàn)證了成功構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-Cbl。

2.2 Cbl蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將含有重組pET-28a-Cbl載體的大腸桿菌BL21（DE3）于37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6后，加入IPTG于37 ℃誘導(dǎo)表達(dá)2、4、6 h，以未加IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-Cbl以及加入IPTG的空載pET-28a作為對(duì)照，對(duì)得到的樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析Cbl蛋白在上清和沉淀中的表達(dá)情況。從圖2可見，于37 ℃條件下，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，pET-28a-Cbl在35.35 kDa左右有1條明顯的特異性的蛋白條帶，并且條帶濃度明顯大于對(duì)照組，且2、4、6 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的蛋白誘導(dǎo)量隨時(shí)間的增長(zhǎng)而變大，但是Cbl蛋白結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，易出現(xiàn)錯(cuò)配的二硫鍵，導(dǎo)致包涵體的形成，因此，Cbl蛋白大多在沉淀中表達(dá)，在上清中只有少量表達(dá)。為了解決該問題，在相同條件下加入IPTG后，15 ℃低溫誘導(dǎo)表達(dá)，以Tris-HCl作為緩沖液超聲破碎細(xì)胞，破碎得到的上清蛋白使用鎳柱純化。使用不同濃度的咪唑（50、100、150、200、300、400、500 mmol·L?1）進(jìn)行梯度洗脫，對(duì)得到的樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析。分析結(jié)果（圖3）表明：經(jīng)過低溫誘導(dǎo)后，Cbl蛋白在上清中表達(dá)量明顯增加，鎳柱孵育后大小為35.35 kDa，帶有His標(biāo)簽的Cbl蛋白成功與鎳柱結(jié)合，并且比較不同濃度咪唑洗脫得到的蛋白，其中，100 mmol·L?1咪唑洗脫時(shí)能將大部分目的蛋白洗脫下來，此時(shí)蛋白條帶單一濃度較高，能用于下一步實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同條件下Cbl蛋白的表達(dá)圖譜Fig. 2 Expression profile of Cbl protein under different conditions

圖3 Cbl蛋白的純化圖譜Fig. 3 Purification map of Cbl protein

2.3 Cbl蛋白純化使用含φ=30%甘油的Tris-HCl緩沖液作為透析液，4 ℃過夜透析Cbl蛋白充分去除咪唑。取出透析蛋白，用BOSTER的BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)量Cbl蛋白OD562值，進(jìn)而根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到Cbl蛋白的濃度。制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，橫坐標(biāo)表示蛋白的OD562，縱坐標(biāo)表示蛋白質(zhì)量濃度（μg·L?1，標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值=0.967 6，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線可信度高，透析所得蛋白OD562=0.555，根據(jù)公式y(tǒng)=1 112x?237.74，代入計(jì)算可得Cbl蛋白質(zhì)量濃度為601.405 mg·L?1。

圖4 蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 4 Standard curve of protein concentration

3 討 論

漁業(yè)在我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)貿(mào)易中的作用日益增強(qiáng)，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)已經(jīng)成為促進(jìn)漁業(yè)可持續(xù)、快速、穩(wěn)定發(fā)展的重要力量[17]。然而，魚類細(xì)菌性疾病的頻繁發(fā)生是制約水產(chǎn)養(yǎng)殖發(fā)展的重要因素[7]。近年來，維氏氣單胞菌大規(guī)模爆發(fā)的病例越來越多。有報(bào)道稱，維氏氣單胞菌可感染淡水魚[18?19]、兩棲動(dòng)物[20]和哺乳動(dòng)物[2]，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，并威脅食品安全。此外，人們也可能通過接觸維氏氣單胞菌污染的表面而感染，如被污染的家畜和家禽肉類和海產(chǎn)品，從而導(dǎo)致腸胃炎[21]。但是維氏氣單胞菌致病機(jī)制復(fù)雜，其致病機(jī)理尚未研究透徹，治療維氏氣單胞菌引起的各種疾病顯得至關(guān)重要。

Cbl作為硫酸鹽水平的感應(yīng)器，在硫代謝途徑中有著重要作用。在大腸桿菌中，迄今為止鑒定的ssi基因包括ssuEADCB和tauABCD操縱子，分別編碼有機(jī)硫化合物、脂肪族磺酸鹽和?；撬釘z取系統(tǒng)的，以及從各自底物中釋放亞硫酸鹽的氧化還原酶型酶[22]。tau和ssu的表達(dá)僅在無無機(jī)硫酸鹽的情況下誘導(dǎo)，且需要轉(zhuǎn)錄因子Cbl的存在[23]。盡管與CysB高度同源，但與CysB不同的是Cbl不需要誘導(dǎo)配體就能從目標(biāo)啟動(dòng)子中激活轉(zhuǎn)錄，其功能受到硫酸同化途徑中的第一個(gè)中間體腺苷5?磷酸硫酸酯(APS)的負(fù)調(diào)控[24]。因此，cbl介導(dǎo)的調(diào)節(jié)解釋了大腸桿菌利用硫源的層次：半胱氨酸>硫酸鹽>磺酸鹽[25]。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明，Cbl與維氏氣單胞菌H2S的合成密不可分，而在細(xì)菌中，H2S參與了細(xì)菌對(duì)活性氧(ROS和抗生素誘導(dǎo)的氧化損傷的防御[26]。因此，Cbl對(duì)維氏氣單胞菌的氧化耐受也起著重要作用。

本研究成功構(gòu)建了Cbl蛋白編碼基因cbl的原核表達(dá)載體pET-28a-Cbl，并根據(jù)Cbl與CysB蛋白的高同源性，參考CysB的蛋白表達(dá)條件[17]，摸索出了Cbl蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化的適宜條件。本研究表明，Cbl蛋白在37 ℃時(shí)，主要在細(xì)菌裂解后沉淀中表達(dá)，易形成包涵體，所以對(duì)Cbl蛋白進(jìn)行低溫誘導(dǎo)，減少包涵體的形成。因此，得出Cbl蛋白誘導(dǎo)的適宜條件：誘導(dǎo)時(shí)間為8 h，IPTG終濃度為0.1 mmol·L?1，誘導(dǎo)溫度為15 ℃。Cbl蛋白經(jīng)由Ni柱純化后主要分布于100 mmol·L?1咪唑的洗脫液中，純化得到的Cbl蛋白條帶清晰單一，透析后蛋白濃度較高，能滿足后續(xù)功能研究實(shí)驗(yàn)的要求。

本研究對(duì)Cbl進(jìn)行了原核表達(dá)載體的構(gòu)建以及蛋白表達(dá)純化，最后得到理想的Cbl蛋白，為下一步進(jìn)行Cbl蛋白的功能及其分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，也為維氏氣單胞菌氧化耐受抗逆性的研究提供了理論依據(jù)。