韓 帥，吳 婕，張河慶，梁根云，席亞東

（1四川省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室，成都610066；2四川省農(nóng)業(yè)科學院園藝研究所/蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點實驗室，成都610066）

0 引言

四川省宜賓市常年種植黃瓜，是川南地區(qū)重要的黃瓜種植區(qū)，在當?shù)卣{(diào)查黃瓜病害的過程中發(fā)現(xiàn)一種新的病害，癥狀類似炭疽病，有的田塊全田發(fā)病，且病葉率過半，給當?shù)剞r(nóng)戶造成了較大的經(jīng)濟損失。為解決這一生產(chǎn)問題，需對該病害進行準確鑒定。

引起黃瓜炭疽病的病原菌主要為瓜類炭疽菌(Colletotrichumorbiculare)[1]和平頭炭疽菌(Colletotrichum truncatum)[2]，而 C.brevisporum 為害黃瓜未有報道。C.brevisporum的模式菌株分離自泰國的鳳梨屬植物，其培養(yǎng)性狀為氣生菌絲為白色、較稀疏，菌落背面為深綠色，培養(yǎng)后期有分生孢子堆；分生孢子為長柱型，透明無隔，表面光滑，內(nèi)有油球，大小為(12～17)μm×(5～6)μm，孢子附著胞深褐色，卵形、紡錘形或不規(guī)則形，大小為(10～13)μm×(8～11)μm[3]。C.brevisporum可為害蔬菜和水果的葉片、莖部或果實，在四川引起辣椒炭疽病[4]；在福建為害百香果藤蔓，典型癥狀為產(chǎn)生橢圓或不規(guī)則形的褐色凹陷病斑[5]；在吉林引起南瓜果實炭疽病，病果表面散布近圓形的黑色凹陷壞死斑，濕度大時病斑上形成白色菌絲，同心輪紋處可見橙紅色的分生孢子堆[6]；在海南引起咖啡樹炭疽病[7]；在臺灣引起木瓜炭疽病，于成熟果實表面可見水浸狀或深褐色的凹陷斑，濕度大時可見橙紅色孢子堆[8]；在巴西引起佛手瓜和木瓜炭疽病[9-10]，前者在果實上可見橢圓形的淺褐色或黑色的凹陷斑，后者癥狀與臺灣分離物的相似；在韓國為害枸杞[11]；在泰國為害鳳梨屬植物和木鱉果[3,12]。

筆者于2019年在宜賓市蕨溪鎮(zhèn)采集疑似炭疽病的黃瓜病葉，通過組織分離、柯赫氏法則驗證、病原菌形態(tài)學和分子生物學鑒定，確定病原菌的種類，并對其進行生物學特性的研究，以期為當?shù)攸S瓜炭疽病的綜合防治提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

光學顯微鏡(Olympus 51BX)，PCR儀(Bio-Rad T100)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad Gel Dox XR)。

1.2 試驗材料

1.2.1 植物材料 黃瓜品種為‘新選二早子’。

1.2.2 供試菌株 菌株編號為J1-1-2，分離自黃瓜病葉上，經(jīng)單孢純化保存于4℃冰箱備用。

1.2.3 培養(yǎng)基（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 L。（2）水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂6 g，蒸餾水1 L。（3）燕麥瓊脂(oatmeal agar，OA)培養(yǎng)基：燕麥片20 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 L。（4）麥芽浸膏(malt extract agar，EMA)培養(yǎng)基：麥芽膏40 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 L。（5）察氏(Czapek-Dox agar，CDA)培養(yǎng)基 ：NaNO33 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 L。（6）V8(V8 agar)培養(yǎng)基：V8果汁180 mL，CaCO33 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 L。（7）黃瓜煎汁培養(yǎng)基(cucumber juice agar，CJA)：黃瓜葉片10 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 L。（8）碳源培養(yǎng)基：NaNO31 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，蔗糖（葡萄糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉）15 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 L。（9）氮源培養(yǎng)基：NaNO3（蛋白胨、酵母膏、NH4Cl和尿素）1 g，K2HPO41 g，MgSO40.5 g，蔗糖15 g，瓊脂12 g，蒸餾水1 L。

1.3 病原菌的分離純化

采用常規(guī)組織分離法進行病原菌的分離[13]。病樣用清水洗凈后自然風干，使用消毒剪刀截取病健交界處5 mm×5 mm的組織塊，75%乙醇浸泡1 min，然后用5%次氯酸鈉處理30 s，無菌水漂洗3次后用無菌濾紙吸干水分，將組織塊轉(zhuǎn)至PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)。菌株純化采用單孢分離法。使用無菌水沖洗菌絲制備孢子懸浮液，取上清涂布于PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)3～4天挑取單菌落，轉(zhuǎn)接于PDA斜面上，待長滿后4℃保存。

1.4 病原菌的柯赫氏法則驗證

待黃瓜幼苗長至2片真葉時，分別使用直徑為6 mm的菌餅和濃度為1.0×105個/mL的孢子懸浮液（接種量為5 μL）在葉背面進行接種，分別接種15株，每株選擇1片真葉，每片葉設(shè)置2個點，在25℃、85%相對濕度、16 h光照//20℃、90%相對濕度、8 h黑暗條件下進行培養(yǎng)，每天觀察和記錄發(fā)病情況。比較田間黃瓜病葉和回接后葉片的發(fā)病癥狀，同時截取病斑進行組織分離，比較新分離獲得的菌株和原始菌株是否一致。

1.5 病原菌的形態(tài)學鑒定

將純化后的病原菌接種于PDA培養(yǎng)基上，7天后觀察并記錄菌落以及分生孢子、剛毛和產(chǎn)孢器等結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征。孢子附著胞的誘導參照Yang等[14]的方法，將滴有孢子懸浮液的載玻片置于鋪有棉花的培養(yǎng)皿上，加入適量無菌水保濕，25℃黑暗培養(yǎng)。菌絲附著胞的誘導參照Sutton和Cai等的方法[15-16]，吸取100 μL WA培養(yǎng)基滴加在無菌載玻片上，將直徑約2 mm的菌絲塊放置于WA培養(yǎng)基1/3處27℃保濕培養(yǎng)，5～7天后觀察附著胞。

1.6 病原菌的分子生物學鑒定

病原菌總DNA的提取采用CTAB法。待菌株在PDA平板上長滿后，輕輕刮取表面菌絲，使用液氮研磨至粉狀，加入預(yù)熱的CTAB液，于65℃恒溫水浴30 min。冷卻后加入等體積的酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)抽提取上清，然后加入等體積的酚:氯仿(24:1)抽提2次。向上清液中加入0.6倍體積的異丙醇，使DNA沉淀，使用70%乙醇洗滌2次，干燥處理后加入TE緩沖液溶解DNA，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

使用引物 ITS1/ITS4[17]、ACT-512F/ACT-783R[18]和GDF/GDR[19]對相應(yīng)的rDNA ITS、ACT和GDPH基因進行PCR擴增。25 μL PCR反應(yīng)體系為：Taq PCR Master Mix 12.5 μL、正向引物和反向引物(10 μmol/L)各 0.5 μL、模板 DNA（約 30～50 ng/μL）1 μL、ddH2O 10.5 μL。PCR的擴增條件：98℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，56℃退火10 s，72℃延伸10 s，共32個循環(huán)；最后72℃延伸10 min，4℃保存。擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳，使用凝膠成像系統(tǒng)進行觀察和拍照。PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行純化和測序，將測序結(jié)果和GenBank中已知種屬的DNA進行Blast比對分析，同時下載相似的序列，使用MEGA 7.0軟件，基于p-distance模型以鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)Bootstrap 1000次循環(huán)檢驗。

1.7 病原菌生物學特性研究

1.7.1 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 將直徑4 mm的菌餅接種于6種不同的培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)，5天后使用十字交叉法測定菌落直徑，待菌落長滿皿后刮取表面菌絲，置于10 mL無菌水中充分震蕩，3層無菌紗布過濾后使用紐鮑爾(Neubauer)血球計數(shù)板上測定分生孢子濃度，每個處理設(shè)置5個重復。

1.7.2 溫度對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 將菌餅接種于PDA培養(yǎng)基上，分別置于10、15、20、25、30、35、40℃共7個溫度梯度下黑暗培養(yǎng)，7天后測定菌落直徑，待菌長滿皿后測定產(chǎn)孢量，培養(yǎng)條件和測定方法同1.7.1。

1.7.3 pH對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 使用HCl(1 mol/mL)和NaOH溶液(1 mol/mL)將PDA培養(yǎng)基調(diào)至pH 4、5、6、7、8、9、10共7個梯度，7天后測定菌落直徑，待菌長滿皿后測定產(chǎn)孢量，培養(yǎng)條件和測定方法同1.7.1。

1.7.4 碳源、氮源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 5種碳源分別為葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉，5種氮源分別為硝酸鈉、蛋白胨、酵母膏、NH4Cl和尿素，7天后測定菌落直徑，待菌長滿皿后測定產(chǎn)孢量，培養(yǎng)條件和測定方法同1.7.1。

1.7.5 致死溫度的測定 將直徑為6 mm的菌餅置于裝有1 mL無菌水的EP管中，將EP管分別放入40、42、44、45、46、47、48、49、50℃的水浴鍋中處理10 min，然后轉(zhuǎn)至PDA培養(yǎng)基上25℃黑暗培養(yǎng)，7天后觀察菌絲的生長情況，每個處理設(shè)置6個重復。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件和DPS v7.05軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，使用Duncan新復極法比較差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間發(fā)病癥狀

在四川省宜賓市蕨溪鎮(zhèn)的露地黃瓜進行病害普查，發(fā)現(xiàn)該地一種新的病害發(fā)生嚴重，病葉率達43.07%～51.37%。癥狀表現(xiàn)為病斑多角形或近圓形，呈褐色，邊緣褪綠，中心漸變?yōu)樯n白色（圖1A）。

2.2 柯赫氏法則驗證

通過組織分離及純化獲得1株分離物，編號為J1-1-2。使用菌餅接種葉片3天后，接種點出現(xiàn)褪綠斑（圖1B），10天后病斑變褐，邊緣黃化（圖1C），這與田間癥狀相似；接種孢子懸浮液10天后出現(xiàn)邊緣黃化的圓形褐斑（圖1D）。對病葉進行組織分離，新獲得的菌株與原始菌株相比，其形態(tài)學特征一致，表明該菌為引起黃瓜炭疽病的病原菌。

圖1 田間及人工接種后發(fā)病癥狀

2.3 病原菌的形態(tài)學鑒定

菌株J1-1-2在PDA上的菌落呈黑色，氣生菌絲為灰白色，較稀疏，培養(yǎng)基內(nèi)密布小黑點（圖2A）。通過顯微觀察可知分生孢子呈長柱形，透明無隔，有油球，大小為(14.4～18.4)μm×(4.0～5.8)μm(xˉ=(16.3±1.1)μm×(4.7±0.4)μm，n=30)，孢子附著胞呈卵圓形，淺裂，淺褐色，個別孢子能產(chǎn)生兩個附著胞，大小為(7.8～10.6)μm×(6.8～9.9)μm(xˉ=(9.1±0.7)μm×(7.9±0.7)μm，n=30)（圖2B）；分生孢子盤中著生黑色剛毛（圖2C）；菌絲附著胞為不規(guī)則形，深褐色，淺裂或深裂，大小為(11.4～15.6)μm×(9.3～13.7)μm(xˉ=(11.9±1.7)μm×(8.6±1.3)μm，n=30)（圖2D）。

圖2 病原菌的形態(tài)學特征

2.4 病原菌分子生物學鑒定

使用引物ITS1/ITS4、ACT-512F/ACT-783R和GDF/GDR進行PCR擴增，分別獲得長度為534、244、258 bp的擴增片段，將測序結(jié)果上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得相應(yīng)的登錄號(MT626673、MT636879、MW316323)，同時與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行Blast比對，使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建基于三基因序列聯(lián)合的系統(tǒng)發(fā)育樹，以Monilochaetes infuscans為外群，結(jié)果顯示菌株J1-1-2與C.brevisporum(LJTJ24)和C.brevisporum(L57/LC0600)聚為一支，支持率為100%（圖3），由此可知該菌為C.brevisporum。

圖3 基于ITS、ACT和GDPH序列構(gòu)建對C.brevisporum的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 病原菌生物學特性測定

2.5.1 培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 菌株J1-1-2在PDA培養(yǎng)基上生長最快，菌絲生長速度為(12.66±0.31)mm/d，其次為V8培養(yǎng)基，生長最慢的為黃瓜煎汁培養(yǎng)基。在OA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最多，產(chǎn)孢量為(144.45±25.07)×105個/mL，其次為PDA和V8培養(yǎng)基，其他培養(yǎng)基均不產(chǎn)孢（圖4）。

圖4 不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.5.2 不同溫度對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 菌株J1-1-2在10～35℃均能生長，40℃停止生長，最適生長溫度為25℃，菌絲生長速度為(10.88±0.12)mm/d。在20℃和25℃能產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量分別為(31.67±3.33)×105和(34.43±2.55)×105個/mL，無顯著性差異，其他試驗溫度未產(chǎn)孢（圖5）。

圖5 不同溫度對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.5.3 pH對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 菌株J1-1-2在pH 4～10的條件下均能生長，pH 8時生長最快，菌絲生長速度為(11.82±0.07)mm/d，在pH≤5時菌絲生長明顯受到抑制。pH 6～10時均能產(chǎn)孢，最適產(chǎn)孢為pH 8，產(chǎn)孢量為(33.32±2.89)×105個/mL，該菌在堿性條件下更適合生長及產(chǎn)孢（圖6）。

圖6 不同pH對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.5.4 碳源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 5種碳源對菌株J1-1-2的菌絲生長和產(chǎn)孢量影響差異明顯，其中葡萄糖最有利于菌絲生長，生長速度為(8.14±0.40)mm/d，其次為可溶性淀粉、蔗糖和麥芽糖，生長最慢的碳源為乳糖。該菌能利用可溶性淀粉和乳糖產(chǎn)孢，且產(chǎn)孢量無顯著性差異，其余碳源不產(chǎn)孢（圖7）。

圖7 不同碳源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.5.5 氮源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響 5種氮源對菌株J1-1-2的菌絲生長和產(chǎn)孢量影響差異明顯，其中蛋白胨和酵母浸粉最適合菌絲生長，且均能產(chǎn)孢，后者產(chǎn)孢量最多，為(608.89±54.38)×105個/mL，其余氮源不產(chǎn)孢（圖8）。

圖8 不同氮源對病原菌菌絲生長和產(chǎn)孢量的影響

2.5.6 病原菌致死溫度的測定 當菌餅在40～48℃的水浴鍋中處理10 min后，菌株J1-1-2在PDA培養(yǎng)基上仍能生長，當處理溫度上升至49、50℃時，該菌停止生長，表明其致死溫度為49℃。

3 結(jié)論與討論

基于Sutton的分類系統(tǒng)，微觀形態(tài)特征、純培養(yǎng)特征和寄主范圍是鑒定炭疽菌的重要指標。將模式菌株和國內(nèi)已報道的菌株相比，本研究的分離物分生孢子長度在兩者之間，寬度偏小，這種差異可能是由培養(yǎng)基基質(zhì)種類或培養(yǎng)條件不同造成的[20]。孢子附著胞的大小與Liu等[4]分離自辣椒的菌株相比偏大，和楊友聯(lián)等[21]報道的菌株基本一致，這可能與菌株來源、孢子附著胞的成熟度有關(guān)。吳文平和張志銘[22]認為菌絲附著胞體積較大，但種間和種內(nèi)的形態(tài)差異也大，且誘發(fā)時間長，操作繁瑣，而孢子附著胞雖然較小，但形態(tài)穩(wěn)定，且操作簡便，因此后者更適合作為分種依據(jù)。本研究的結(jié)果與之相似，菌株J1-1-2的孢子附著胞規(guī)格變化幅度顯著低于菌絲附著胞，表明前者形態(tài)穩(wěn)定、變異小，可作為該菌形態(tài)鑒定的分類指標。部分學者的研究結(jié)果也表明憑借孢子附著胞的形態(tài)學特征可以將Colletotrichumsp.、C.scovillei和C.acutatum與其他菌區(qū)分開[4,23]，可見孢子附著胞在炭疽菌屬部分種的鑒定上有應(yīng)用價值。在PDA培養(yǎng)基上菌株J1-1-2的生長速度與國內(nèi)菌株基本一致，培養(yǎng)性狀更接近于Lui等[4]分離的菌株，氣生菌絲為淺灰色，菌落背面呈黑色。C.brevisporum的寄主廣泛，包括辣椒、西紅柿、南瓜、木瓜、豇豆、百香果等多種作物，但能否侵染黃瓜未有報道，楊友聯(lián)等[21]在離體黃瓜果實上分離獲得了2株C.brevisporum，但未做致病性測定，本研究表明C.brevisporum的菌絲體和分生孢子均能使黃瓜葉片發(fā)病，這是國內(nèi)首次報道該菌是黃瓜炭疽病的病原菌之一。

炭疽菌某些近緣種種間形態(tài)和純培養(yǎng)特征差異小，導致近緣種不易區(qū)分，且某些種種內(nèi)的形態(tài)特征不穩(wěn)定，致使同種菌株在不同培養(yǎng)條件下差異明顯，因此，單純使用形態(tài)學方法進行分類鑒定比較困難。隨著分子生物學手段在真菌鑒定中不斷應(yīng)用和完善，炭疽菌的鑒定更為精準。核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)是最早應(yīng)用于炭疽菌分類的DNA序列[24]，Wire等[25]對Colletotrichum gloeosporioide復合群中的22個種進行基于ITS的系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)有13個種不能被準確識別，表明ITS在炭疽菌近緣種的分類應(yīng)用上分辨率較低。本研究的分離物僅通過ITS序列不能和C.gloeosporioide區(qū)分開，加入ACT和GDPH基因進行聯(lián)合建樹可準確鑒定到種。

就不同培養(yǎng)基、溫度、pH和碳氮源等環(huán)境因素對菌株J1-1-2菌絲生長速度和產(chǎn)孢能力的影響進行測評，該菌在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀差異明顯，在PDA培養(yǎng)基和V8培養(yǎng)基上菌絲生長快，氣生菌絲致密，且可以產(chǎn)孢，在OA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天即可產(chǎn)生黑色的分生孢子盤，產(chǎn)孢最多，但氣生菌絲較少，表明產(chǎn)孢能力和菌絲致密程度沒有相關(guān)性。該菌適宜的生長溫度為25～30℃，20～25℃利于產(chǎn)孢，在10℃以下菌絲生長明顯受阻，無氣生菌絲，高于48℃時菌絲停止生長。堿性條件更適合菌絲生長且利于產(chǎn)孢。最適生長的碳源為葡萄糖，氮源為蛋白胨和酵母浸粉，后者產(chǎn)孢最多，碳源中可溶性淀粉和乳糖有利于產(chǎn)孢。關(guān)于C.brevisporum生物學特性的研究未見報道，本研究結(jié)果可作為參考。

筆者在對川南黃瓜主產(chǎn)區(qū)病害調(diào)查的過程中發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)江威遠、樂山夾江、宜賓和瀘州均有炭疽病發(fā)生，但主要是由C.orbiculare引起的，僅在宜賓蕨溪鎮(zhèn)的病樣上分離到C.brevisporum，關(guān)于該菌的來源及病害循環(huán)需作進一步研究。