徐幸 楊芳 王燕平 謝家廉 李躍建 彭云良 姬紅麗

摘要 調(diào)查四川省成都平原地區(qū)水旱輪作田根結線蟲發(fā)生情況及種類分布，為水旱輪作田根結線蟲的防治提供依據(jù)。對成都平原15個縣（市、區(qū)）28個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）共159塊水旱輪作田的土樣進行根結線蟲普遍率調(diào)查，利用線蟲ITS通用引物和8對根結線蟲特異性引物對其中檢出率高的地區(qū)重新采集的土樣進行根結線蟲種類分子鑒定。結果表明，成都平原水旱輪作田根結線蟲平均檢出率為40.25%。重新采集的土樣共鑒定出5種根結線蟲：擬禾谷根結線蟲Meloidogyne graminicola、花生根結線蟲M.arenaria、南方根結線蟲M.incognita、北方根結線蟲M.hapla和爪哇根結線蟲M.javanica，各線蟲的檢出率分別為40.91%、34.09%、13.64%、13.64%和2.27%，其中2955%的樣品由2種以上根結線蟲混合侵染。擬禾谷根結線蟲和花生根結線蟲為該地區(qū)優(yōu)勢種群。

關鍵詞 普遍率; 特異性引物PCR; 擬禾谷根結線蟲; 花生根結線蟲; 混合侵染

中圖分類號： S 432.45

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020294

Prevailing species of root-knot nematodes from paddy-upland rotation fields in Chengdu plain

XU Xing1， YANG Fang1， WANG Yanping1， XIE Jialian1， LI Yuejian2， PENG Yunliang1， JI Hongli1*

（1. MARA Key Laboratory of Integrated Management of Pests on Crops in Southwest China， Institute of Plant Protection，

Sichuan Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066， China; 2. Institute of Horticulture Research， Sichuan

Academy of Agricultural Sciences， Chengdu 610066， China）

Abstract

To investigate the prevailing species of root-knot nematodes （RKNs） from paddy-upland rotation fields in Chengdu plain of Sichuan province， 159 soil samples were taken from 28 townships in 15 counties （districts or cities）. The RKNs species were identified by universal primer pair for ITS region of RKNs and eight species of species-specific primers amplification from re-collected samples where high infestation incidence was found in the first round of sampling and bioassay. 40.25% of 159 samples were found to be able to cause root knots in the root systems of either rice or tomato. Five species of RKNs， i.e.， Meloidogyne graminicola， M.arenaria， M.incognita， M.hapla and M.javanica were identified， with the infestation incidence of 40.91%， 34.09%， 1364%， 13.64% and 2.27%， respectively. 2955% of the re-investigation samples were infested with two or more species of RKNs. M.graminicola and Marenaria were the dominant species in paddy-upland rotation fields in Chengdu plain.

Key words

infestation incidence; species-specific PCR; Meloidogyne graminicola; M.arenaria; mixed infestation

根結線蟲Meloidogyne spp.作為全球農(nóng)業(yè)經(jīng)濟危害最嚴重的植物病原線蟲，其寄主和地理分布范圍廣泛[1]。根結線蟲侵染植物根部后，根部細胞過度分裂、膨大，使根部形成根結，導致根系的吸收能力降低，被害株長勢衰弱、甚至提早死亡。此外根結線蟲侵染造成植物根系的損傷還利于土壤中植物寄生真菌的侵入和危害。目前世界上報道有98種根結線蟲，其中有40余種在我國已有發(fā)生記載[2]。隨著種植結構調(diào)整，根結線蟲病在我國發(fā)生和危害日益加重，一般導致作物減產(chǎn)15%～25%，部分田塊損失高達70%以上，甚至絕收[2]。在根結線蟲研究中，國內(nèi)外文獻報道中最常見、危害最重的有南方根結線蟲M.incognita、花生根結線蟲M.arenaria、爪哇根結線蟲M.javanica、北方根結線蟲M.hapla[2]，以及近年來新發(fā)生并嚴重威脅水稻等作物生產(chǎn)的擬禾谷根結線蟲M.graminicola[3]。擬禾谷根結線蟲廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在水稻、旱稻、直播稻、秧田和育秧工廠內(nèi)均可危害，受害水稻產(chǎn)量損失率最高可達 80%以上[1]。該線蟲于2000年在我國海南三亞首次發(fā)現(xiàn)以來已陸續(xù)在福建、湖北、湖南、浙江等地有發(fā)生報道[4-6]，本實驗室也在四川水稻種植區(qū)發(fā)現(xiàn)其危害[7]。已有研究表明，多種根結線蟲混合發(fā)生在我國南方是常見現(xiàn)象[8-9]。

水旱輪作是我國南方最主要的耕作形式之一，僅西南地區(qū)常年實行水旱輪作的稻田即超過250萬hm2[10]，成都平原水旱輪作歷史悠久，是西南地區(qū)最重要的糧食和經(jīng)濟作物產(chǎn)區(qū)。長期以來，水旱輪作被認為是控制根結線蟲病危害的有效手段[11-12]，但近年來屢有根結線蟲在稻田發(fā)生和危害的報道，因此有必要對成都平原水旱輪作田根結線蟲發(fā)生普遍率以及發(fā)生種類進行調(diào)查，為整個生態(tài)系統(tǒng)的健康管理提供依據(jù)。本研究對該區(qū)域水旱輪作田分布區(qū)的土壤進行了抽樣，調(diào)查了根結線蟲發(fā)生普遍率。采用通用引物和8種常見根結線蟲的特異性引物擴增的方法鑒定了根結線蟲混合種群。明確了成都平原水旱輪作田根結線蟲發(fā)生普遍程度和種類分布，以期進一步明確其傳播、發(fā)生規(guī)律，制定科學合理的防控策略。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2017年12月-2018年2月在成都平原選擇15個區(qū)（縣、市）28個鄉(xiāng)（鎮(zhèn)）共159塊田（表1）采集土樣。自田一邊起沿“Z”字形路線取樣10點至田對邊，各點取樣深度約10～15 cm，每塊田土樣總重量在750～1 000 g之間，于室外遮陰保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樣品生物測定

將采集的各田塊土樣擂碎，加入營養(yǎng)土和滅菌河沙（3∶1）后充分混勻，平均分成3份放入帶托盤（15 cm×15 cm）的花盆（14 cm×14 cm）中，每盆土壤表面一半播種20粒左右番茄（‘美國紅冠，四川省良明農(nóng)業(yè)科技有限公司）種子，另半邊播種20粒左右水稻（‘日本晴）種子，種子上面覆蓋一層滅菌細土后，用有效成分75%百菌清600倍稀釋液噴霧至表土充分濕潤預防立枯病。28℃溫室中培養(yǎng)50 d后，拔取水稻和番茄根系洗去泥沙后，調(diào)查兩種植物根系有無根結形成，產(chǎn)生根結土樣記為陽性+，無根結記為陰性-。檢出根結土樣數(shù)占總土樣數(shù)的百分比即為該地區(qū)根結線蟲普遍率。

1.3 根結線蟲種類重檢測與鑒定

2018年8月和2019年3月分別在上述測定中土樣根結線蟲檢出率較高的什邡、廣漢和綿陽市安州區(qū)按照上述1.1方法重新采集44塊田土樣（表2），按1.2方法進行根結線蟲發(fā)生普遍率重復測定。

1.3.1 土樣線蟲DNA提取

收集重復測定中檢出根結土樣的水稻和番茄根系后，清洗掉泥沙，用剪刀剪碎根系并剪破根結以淺盤分離法分離獲得2齡幼蟲懸浮液。線蟲懸浮液于4℃冰箱靜置過夜后，收集根結線蟲于2 mL離心管中，再將離心管液氮速凍30 s后放在振動磨樣機中磨樣30 s，參照崔汝強等的方法[13]提取線蟲DNA。

1.3.2 根結線蟲種類分子鑒定

根據(jù)已發(fā)表文獻中線蟲DNA通用引物和特異性擴增引物進行PCR擴增[14-18]（引物序列見表3）。采用25 μL反應體系： 2×Master MIX（北京擎科生物） 12.5 μL， 10 μmol/L

上、下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR擴增條件：94℃ 3 min;94℃ 30 s，退火溫度（表3）30 s，72℃ 50 s，35個循環(huán);72℃ 5 min。其中不加模板DNA的滅菌ddH2O作為陰性對照，用收集的8種已知種類根結線蟲DNA樣品作為陽性對照。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠110 V電泳 20 min進行檢測，在紫外照膠儀上觀察并照相，剩余PCR產(chǎn)物送擎科生物公司進行測序，測序結果在NCBI網(wǎng)站進行BLAST比對分析，并將序列上傳至GenBank得到登錄序列號。

2 結果與分析

2.1 成都平原根結線蟲發(fā)生普遍率

采集的159塊田土樣（表1）中，有64塊田土樣在所播種的水稻或番茄根系產(chǎn)生根結，根結線蟲發(fā)生普遍率平均為40.25%，其中25.16%的土樣中種植的番茄感染根結線蟲，17.61%的土樣中種植的水稻感染根結線蟲，8.81%的土樣中兩種作物均感染根結線蟲。

根據(jù)調(diào)查結果，我們選取土樣根結線蟲檢出率高的3個地區(qū)，即在什邡市采集22塊田、廣漢市10塊田和綿陽市安州區(qū)12塊田，共重新采集44塊田土樣并進行土樣根結線蟲檢測，其中共26塊田土樣能使水稻或番茄產(chǎn)生根結，根結線蟲發(fā)生普遍率為59.09%，其中使番茄或水稻感染根結線蟲的土樣各占54.55%。使兩種作物感染根結線蟲的土樣占50%（表2）。

2.2 病原線蟲分子生物學鑒定

利用線蟲ITS通用引物RK28SF/MR對重新采集的26個檢出根結土樣中分離出的線蟲DNA樣品進行PCR擴增，均能得到約612 bp的唯一擴增片段，與根結線蟲DNA標準樣品的PCR擴增片段大小一致。隨后，用8種常見根結線蟲的特異性引物對26個陽性土樣的線蟲DNA進行PCR擴增，共得到5種大小不同的片段，其大小分別與標準樣品DNA的擴增產(chǎn)物長度一致（圖1）。從5種擴增片段中每種選擇1個進行雙向測序，并進行BLAST比對。結果表明，樣品YX8序列（登錄號：MT406773）與已知擬禾谷根結線蟲M.graminicola（登錄號：MK559561.1）序列相似度99%以上，ZH1（登錄號：MT406772）與已知南方根結線蟲M.incognita（登錄號：MK292132.1）序列相似性為100%，YX2（登錄號：MT408129）與已知花生根結線蟲M.arenaria（登錄號：KP253748.1）序列相似度99%以上，XL3（登錄號：MT408130）與已知爪哇根結線蟲M.javanica（登錄號：KF041313.1）序列相似度在91%以上，YX1（登錄號：MT408131）與已知北方根結線蟲M.hapla（登錄號：GQ130137.1）序列相似度在99%以上。

44份新采集土樣中，共有26份含根結土樣，其中18份土樣中檢出擬禾谷根結線蟲，在44份總樣品中的發(fā)生率為40.91%，檢出的其他幾種線蟲發(fā)生率分別為：花生根結線蟲（34.09%）、南方根結線蟲（13.64%）、北方根結線蟲（13.64%）以及爪哇根結線蟲（2.27%）。44份重測樣品中未檢出象耳豆根結線蟲M.enterolobii、奇特伍德根結線蟲M.chitwoodi和偽哥倫比亞根結線蟲M.fallax（表4）。

44份樣品中29.55%的樣品僅檢測出1種根結線蟲，其中擬禾谷根結線蟲占13.64%，花生根結線蟲占11.36%，北方根結線蟲和南方根結線蟲各占227%;29.55%的樣品由兩種以上根結線蟲混合侵染，其中2種、3種、4種和5種根結線蟲混合侵染的土樣占重測樣品的比例分別為15.91%、11.36%、2.27%和0?；旌锨秩緲悠分凶畛Ｒ姷臑閿M禾谷根結線蟲和花生根結線蟲兩種根結線蟲混合侵染，占重測樣品的9.09%，擬禾谷根結線蟲、花生根結線蟲與南方根結線蟲等3種根結線蟲混合侵染，以及擬禾谷根結線蟲、花生根結線蟲與北方根結線等3種根結線蟲混合侵染的土壤樣品數(shù)均為2個，占重測樣品的4.55%，新采集樣品中有一份樣品是由擬禾谷根結線蟲、花生根結線蟲、南方根結線蟲和北方根結線蟲等4種線蟲混合侵染，占2.27%。

3 結論與討論

成都平原是西南地區(qū)糧食和蔬菜等作物最重要的產(chǎn)區(qū)，也是全國重要農(nóng)區(qū)[10]。水旱輪作是成都平原最主要的耕作方式，但關于水旱輪作田根結線蟲發(fā)生情況報道較少[7， 19-20]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)成都平原水旱輪作田已經(jīng)是根結線蟲重發(fā)區(qū)，土樣根結線蟲普遍率達40.25%，而在根結線蟲普遍率高的區(qū)縣，根結線蟲土樣普遍率高達59.09%，50%的土樣屬于2種及以上根結線蟲混合侵染，為根結線蟲的防控增加了難點。以往研究結果表明，水灌溉和非寄主作物輪作是防控根結線蟲病害的有效手段[11]。一般認為，水旱輪作中水稻生長期淹水時間長能滿足防治線蟲的淹水條件[11];而在冬季間種芥末和小油菜，然后再間種水稻和芝麻，土壤中擬禾谷根結線蟲幼蟲數(shù)能降低65%[21];烤煙與菽麻Crotalaria juncea間作對根結線蟲病防效為64.23%[22];高丹草Sorghum bicolor × sudanense與感病蔬菜輪作亦能明顯減少根結線蟲種群數(shù)量[23]。然而，此次調(diào)查發(fā)現(xiàn)侵染水稻的擬禾谷根結線蟲已成為成都平原的優(yōu)勢種，擬禾谷根結線蟲與其他根結線蟲的混合發(fā)生降低了水旱輪作和不同作物輪作、套作和間作的根結線蟲的防治效果，并將使成都平原水旱輪作田根結線蟲的發(fā)生和危害進一步加重。

利用根結線蟲特異性引物PCR擴增鑒定出這些地區(qū)共5種根結線蟲，包括發(fā)生率高的擬禾谷根結線蟲和花生根結線蟲，其次南方根結線蟲，北方根結線蟲常有發(fā)生，爪哇根結線蟲零星發(fā)生。劉國坤等[24]發(fā)現(xiàn)水稻田周邊雜草油芒Eccoilopus sp.是水稻根結線蟲的寄主，來自油芒的根結線蟲能嚴重侵染水稻，油芒根部根結卵囊孵化產(chǎn)生的2齡幼蟲通過灌溉水進入水稻田，成為水稻根結線蟲病的重要侵染源，導致該區(qū)域水稻嚴重侵染。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)田埂，稻田周邊旱地、綠化帶以及水渠破損處都生長有大量雜草，多為根結線蟲適宜的寄主，導致根結線蟲可能通過雨水、灌溉水從稻田周邊環(huán)境中侵入稻田。水渠灌溉水、稻田之間自流灌溉以及成都平原稻田的跨區(qū)域機械化耕作，同樣也將導致根結線蟲的長距離傳播使得該區(qū)域根結線蟲分布更加廣泛和嚴重。

本次研究發(fā)現(xiàn)成都平原地區(qū)水旱輪作田根結線蟲分布廣泛、種類多樣，多數(shù)田塊不同種類混合發(fā)生，迫切需要進一步深入研究，尋找可利用的非寄主作物輪作減少根結線蟲基數(shù)，阻斷各種侵染來源，篩選有效的輪作植物、防治藥劑，并且協(xié)助育種家加速抗根結線蟲品種的選育，為制定科學合理的綜合防控措施提供依據(jù)。

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（責任編輯：田 喆）