錢寧 吳雨紅 馮彩蓮 張國(guó)珍 盧訓(xùn)莉 趙文生

摘要 2019年-2020年，在我國(guó)河南省信陽(yáng)市和廣西壯族自治區(qū)南寧市種植紫云英的田間發(fā)現(xiàn)一種紫云英葉斑病。通過(guò)常規(guī)組織分離法分離得到7株真菌（菌株號(hào)為XZYB1～XZYB6、GX1），經(jīng)單孢純化、形態(tài)學(xué)觀察和多基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析（ITS-GAPDH-CAL），結(jié)果顯示7株真菌均為黃芪匍柄霉Stemphylium astragali。依據(jù)柯赫氏法則，選取菌株XZYB1和XZYB4無(wú)傷接種紫云英離體葉片，選取菌株GX1活體接種紫云英葉片進(jìn)行致病性測(cè)定。接種5 d后離體葉片和活體植株葉片均發(fā)病，發(fā)病癥狀與田間癥狀一致，且再分離得到的菌株與接種菌株相同。據(jù)此，確定黃芪匍柄霉為該葉斑病的病原菌，并將病害定名為紫云英匍柄霉葉斑病。這是該病害在河南和廣西發(fā)生的首次報(bào)道。本研究也為匍柄霉葉斑病的診斷與后續(xù)的防治策略提供了科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 形態(tài)學(xué); 系統(tǒng)發(fā)育學(xué); 致病性測(cè)定; 黃芪匍柄霉; 紫云英

中圖分類號(hào)： S 435. 5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.

2021048

Identification of the pathogen caused a leaf spot disease in Astragalus sinicus in Henan province and Guangxi Zhuang autonomous region

QIAN Ning， WU Yuhong， FENG Cailian， ZHANG Guozhen， LU Xunli， ZHAO Wensheng*

（Key Laboratory of Pest Monitoring and Green Management， Ministry of Agriculture and Rural Affairs; College of

Plant Protection， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract

A leaf spot disease was found in the milk vetch fields of Henan province and Guangxi Zhuang autonomous region （GZAR） in 2019-2020. Seven strains （XZYB1-XZYB6 and GX1） were isolated using the conventional tissue isolation method. After single spore purification， morphological observation and multi-gene phylogenetic analysis （ITS-GAPDH-CAL）， these strains were all identified as Stemphylium astragali. According to Kochs postulate， strain XZYB1 and XZYB4 were selected for noninvasive inoculation to milk vetch leaves and strain GX1 for noninvasive inoculation to milk vetch living plants for pathogenicity test. Disease can be developed in both the detached leaves and the in vivo leaves， and the symptoms on the inoculated leaves were consistent with those in the field. The re-isolated strains were still identified as S.astragali. Therefore S.astragali was determined as the pathogen of the milk vetch leaf spot disease， which was called as milk vetch Stemphylium leaf spot. This is the first report of the disease in Henan province and GZAR， which also provides a scientific basis and theoretical guidance for the diagnosis of Stemphylium leaf spot of other crops and follow-up control strategies of the leaf spot disease.

Key words

morphological; phylogenetic tree; pathogenicity test; Stemphylium astragali; Astragalus sinicus

紫云英Astragalus sinicus L.又名紅花草，是豆科黃芪屬二年生草本植物。它常作為重要的蜜源植物和綠肥作物而被廣泛栽培。作為綠肥作物，紫云英常與稻田輪作，在水稻種植前將上一季的紫云英翻壓入土以提高土壤肥力，并且它還能改善土壤理化性質(zhì)，最終提高作物產(chǎn)量[1]。在中國(guó)，一千多年前吳陸璣的《毛詩(shī)草木鳥(niǎo)獸蟲(chóng)》中就記載了紫云英已經(jīng)被人們使用[2];明清時(shí)代，長(zhǎng)江流域的紫云英已經(jīng)種植廣泛;民國(guó)時(shí)期，我國(guó)南部地區(qū)、中原地區(qū)均有紫云英種植，分布十余省[3]。

紫云英主要在中日韓等亞洲國(guó)家種植較為普遍，因此，目前關(guān)于紫云英的真菌病害記錄也多集中于這些地區(qū)，記錄較多的為白粉病和菌核病。中國(guó)和日本均有黃芪白粉菌Erysiphe astragali侵染引起的紫云英白粉病的記錄[4-6]。中國(guó)、日本和韓國(guó)均有豌豆白粉菌E.pisi侵染引起的紫云英白粉病的記錄[4，7-8]。據(jù)戴芳瀾《中國(guó)真菌總匯》記載，蓼白粉菌Erysiphe polygoni也可以侵染紫云英葉片引起紫云英白粉病，而核盤菌Sclerotinia sclerotiorum和杯狀核盤菌S.ciborioides可侵染紫云英引起菌核病[5]。日本報(bào)道了由三葉草核盤菌S.trifoliorum侵染引起的紫云英菌核病[9]。據(jù)《中國(guó)真菌志》第26卷記載，灰葡萄孢Botrytis cinerea可以侵染紫云英引起灰霉病[10]。此外，據(jù)美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究局?jǐn)?shù)據(jù)中心記錄顯示，早在1952年日本就報(bào)道了由苜蓿霜霉Peronospora aestivalis侵染引起的紫云英霜霉病;在1955年日本報(bào)道了由黃芪枝孢Cladosporium astragali侵染引起的紫云英葉枯病。據(jù)《中國(guó)真菌志》第14卷記載，變黑枝孢菌C.nigrellum可以侵染紫云英葉片引起葉斑病[11]。在我國(guó)大陸和臺(tái)灣地區(qū)有記載黃芪尾孢菌Cercospora astragali可以侵染引起紫云英褐斑病[5，12]。中國(guó)和日本曾報(bào)道了Neoovularia nomuriana 可以侵染紫云英葉片引起紫云英白斑病[13-15]。日本、韓國(guó)及我國(guó)浙江省曾有記錄黃芪匍柄霉Stemphylium astragali可以侵染紫云英葉片引起紫云英葉斑病[16-18]，但缺乏詳細(xì)的病害癥狀、病原菌形態(tài)及分子生物學(xué)證據(jù)。

為加速現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展，我國(guó)正大力恢復(fù)和發(fā)展綠肥生產(chǎn)，紫云英的種植面積和產(chǎn)量也在逐步增大，因此控制紫云英病害的發(fā)生和危害極為重要。本研究在紫云英的主產(chǎn)區(qū)河南和廣西進(jìn)行田間調(diào)查時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種紫云英葉斑病。為明確其病原菌種類，我們進(jìn)行了病原菌的分離、鑒定及致病性測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 田間癥狀的觀察與樣品的采集

2019年4月上旬和2020年3月中旬分別在河南省信陽(yáng)市和廣西壯族自治區(qū)南寧市紫云英種植田發(fā)現(xiàn)一種癥狀相似的紫云英葉斑病。對(duì)其發(fā)病癥狀、發(fā)病部位進(jìn)行拍照記錄，并采集病樣帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 病原菌的分離、純化及保存

采用常規(guī)組織分離法對(duì)病樣進(jìn)行病原菌的分離，待菌株產(chǎn)孢后，挑取單孢純化。純化得到的菌株分別用斜面（PDA）法和濾紙片法各保存一份，斜面于4℃冰箱保存，帶菌濾紙片放入滅菌的羊皮紙袋中，置于超凈工作臺(tái)吹干后-20℃冰箱保存。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

將菌株在PDA平板上活化5 d后，用滅菌的打孔器在菌落邊緣打取菌餅（d=5 mm）備用。

菌落形態(tài)特征觀察：將菌餅接種于PCA平板（d=60 mm）中央，置于25℃恒溫溫箱持續(xù)光照培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)狀況并測(cè)量菌落直徑計(jì)算生長(zhǎng)速率。

產(chǎn)孢表型觀察：參考《中國(guó)真菌志》第30卷[19]的方法誘導(dǎo)產(chǎn)孢，7～10 d后，取載玻片置顯微鏡下觀察，并拍照記錄分生孢子在分生孢子梗上的著生情況（產(chǎn)孢表型）和產(chǎn)孢梗（細(xì)胞）延伸的方式。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂 20 g、蒸餾水1 000 mL;馬鈴薯胡蘿卜瓊脂（PCA）培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、胡蘿卜200 g、瓊脂 20 g、蒸餾水1 000 mL。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

將菌株在PDA平板上培養(yǎng)5 d后，收集菌絲，使用QS法[20]快速提取DNA。用引物（表1）分別擴(kuò)增ITS、GAPDH和CAL基因。擴(kuò)增體系（50 μL）： 2×PCR-MIX溶液（聚合美生產(chǎn)，速率為1 kb/10～15 s）25 μL，無(wú)菌去離子水20 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，模板DNA 1 μL。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至鉑尚生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用Chromas軟件進(jìn)行檢查校對(duì)，最終將所得的所有序列上傳NCBI序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲得登錄號(hào)（表2）。依據(jù)Woudenberg 等[21]的報(bào)道下載相關(guān)參考序列，參考序列登錄號(hào)及相關(guān)菌株信息見(jiàn)表2。使用MAFFT v.7.221、Bioedit和ALTER（http：∥www.sing-group.org/ALTER/）分別進(jìn)行序列比對(duì)、修剪拼接和格式轉(zhuǎn)換，使用Cipres網(wǎng)頁(yè)上（https：∥www.phylo.org/）的XSEDE工具進(jìn)行ML法（最大似然法）的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析;使用PAUP軟件（4.0b10版本）進(jìn)行MP法（最大簡(jiǎn)約法）的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析。選擇Alternaria alternata作為系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的外群。

1.5 致病性測(cè)定

依據(jù)柯赫氏法則，選取紫云英健康植株，分別采用離體葉片接種法和活體植株接種法進(jìn)行致病性測(cè)定。將保藏的分離物移到PDA平板上置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 d，用滅菌的打孔器在菌落的邊緣打取多個(gè)菌餅（d=5 mm）備用。溫室內(nèi)種植紫云英，離體接種選取健康的帶葉莖段，并使用棉簽蘸取75%乙醇對(duì)葉片進(jìn)行表面消毒處理。采用無(wú)傷接種法，將菌餅接于葉片上，重復(fù)3次，以無(wú)菌PDA塊作對(duì)照，接種后用濕棉花包裹莖段，放在鋪有濕潤(rùn)濾紙的保鮮盒中保濕，在培養(yǎng)箱中25℃恒溫避光培養(yǎng)，定期觀察并記錄葉片發(fā)病情況。活體接種選取健康的紫云英植株，用棉簽蘸取75%乙醇對(duì)紫云英活體植株葉片進(jìn)行表面消毒處理。采用無(wú)傷接種法，每株紫云英隨機(jī)接15個(gè)菌餅，重復(fù)3次，以無(wú)菌PDA塊作對(duì)照，將接種的盆栽紫云英放在大的塑料收納箱中，用加濕器加濕，塑料收納箱用保鮮膜密封后放在恒溫溫室（25±1℃）培養(yǎng)，定期觀察并記錄植株發(fā)病情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫云英葉斑病田間癥狀

在河南信陽(yáng)市紫云英田間和廣西南寧市田間所發(fā)現(xiàn)的葉斑病，病斑淡褐色至褐色，形狀不規(guī)則，邊緣帶有黃色暈圈，有的具輪紋，濕度高時(shí)病斑中央產(chǎn)生灰褐色霉層。單個(gè)小葉片上可出現(xiàn)多個(gè)病斑，發(fā)病后期多個(gè)病斑可連成片，造成整個(gè)葉片干枯死亡（圖1）。該病害在紫云英生長(zhǎng)中后期普遍發(fā)生，田間植株發(fā)病率高達(dá)60%～100%。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察

從河南省紫云英葉斑病病樣上共分離得到6株菌，編號(hào)為XZYB1～XZYB6;從廣西壯族自治區(qū)紫云英葉斑病病樣上分離得到1株菌，編號(hào)為GX1。純化時(shí)發(fā)現(xiàn)這7株菌形態(tài)學(xué)特征基本一致。代表性菌株XZYB4在PCA平板上（25℃下全光照）菌落初期為白色，隨著生長(zhǎng)，菌落正面逐漸變?yōu)榛野咨?，菌落背面逐漸變?yōu)榛液谏囵B(yǎng)5 d后菌落直徑可達(dá)50 mm。

分生孢子梗直立，單生，不分支，淡褐色，分為短梗和長(zhǎng)梗兩種。短梗無(wú)隔，長(zhǎng)度（6.2～）6.3～12.1（～14.9）μm;長(zhǎng)梗2～5個(gè)橫隔，長(zhǎng)度（21.2～）26.8～41.3（～44.1）μm，分生孢子梗寬度（4.4～）4.9～6.7（～7.3）μm。分生孢子梗末端形成膨大且顏色加深的產(chǎn)孢細(xì)胞，分生孢子著生于產(chǎn)孢細(xì)胞上，褐色，卵形或橢圓形，表面具疣狀突起，具橫隔、縱隔或斜縱隔（橫隔1～4個(gè)，縱隔或斜縱隔1～5個(gè)），分隔處明顯縊縮，大小為（10.5～）14.4～23.4（～29.5）μm ×（9.3～）11.9～17.4（～18.5）μm，隨著孢子成熟顏色加深（圖2）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

首先將所獲得的ITS序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，初步確定它們?yōu)橘楸箤賁temphylium真菌。進(jìn)一步，聯(lián)合ITS-GAPDH-CAL三個(gè)基因片段（其中ITS：1-540;GAPDH：545-1 113;CAL：1 118-1 832，不同基因片段之間插入了4個(gè)N）使用最大似然法和最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，MP、ML兩種建樹(shù)方法獲得相似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，ML的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表示的系統(tǒng)學(xué)關(guān)系見(jiàn)圖3，結(jié)果顯示菌株XZYB1～XZYB6、GX1與黃芪匍柄霉S.astragali的衍生注釋模式菌株（CBS 116383）聚在一個(gè)進(jìn)化支，其自舉值均為100，此外這8個(gè)菌株的DNA堿基序列完全相同或幾乎完全相同。

2.4 致病性測(cè)定

菌株XZYB1和XZYB4離體葉片接種60 h后可見(jiàn)菌餅萌發(fā)的菌絲侵染葉片。取下菌餅，繼續(xù)觀察發(fā)病情況，在接種5 d后接種點(diǎn)出現(xiàn)褐色病斑，病斑周圍失綠呈現(xiàn)黃色暈圈，該癥狀與田間癥狀相似，而空白對(duì)照組葉片不發(fā)病。從發(fā)病葉片病健交界處再分離得到的菌株與接種菌株相同。

菌株GX1活體植株接種5 d后，植株均出現(xiàn)發(fā)病癥狀，15個(gè)接種點(diǎn)的發(fā)病數(shù)分別為12、8個(gè)和12個(gè)。發(fā)病葉片出現(xiàn)褐色不規(guī)則病斑，有的呈輪紋狀，病斑邊緣失綠為黃色暈圈。從發(fā)病葉片病健交界處再分離得到的菌株與接種菌株相同。

3 結(jié)論與討論

對(duì)我們分離獲得的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定（ITS、GAPDH和CAL多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析），確定XZYB1～XZYB6、GX1等7株菌為黃芪匍柄霉S.astragali。依據(jù)柯赫氏法則，將田間病樣上分離得到的菌株進(jìn)行回接做致病性測(cè)定，獲得與寄主在自然狀態(tài)下非常相似的發(fā)病癥狀，同時(shí)將接種發(fā)病部位進(jìn)行再分離，得到和最初分離菌株一樣的菌株，驗(yàn)證了黃芪匍柄霉就是該紫云英葉斑病的致病菌。為與其他葉斑類病害相區(qū)別，將該菌引起的病害命名為紫云英匍柄霉葉斑病。

黃芪匍柄霉最早由日本科學(xué)家Yoshii于1929年從日本的紫云英上分離得到，最初命名為Thyrospora astragali，在1956年，確定該種衍生注釋模式菌株為CBS 116583。1960年由日本科學(xué)家Yamamoto對(duì)其重新進(jìn)行分類并正式歸為匍柄霉屬，更名為Stemphyliun astragali[17，21，25]。1991年，《浙江植物病蟲(chóng)志：病害篇（第一集）》中首次記錄了我國(guó)浙江省發(fā)現(xiàn)由黃芪匍柄霉侵染引起的紫云英葉斑病[16]，但僅有對(duì)其病原菌形態(tài)學(xué)的文字描述，無(wú)形態(tài)附圖和分子證據(jù)。2001年出版的《Korean species of Alternaria and Stemphylium》和2004年出版的《List of plant diseases in Korea》中記錄，在韓國(guó)，黃芪匍柄霉可以侵染紫云英葉片引起葉斑病[8，18]。從該病原菌被首次鑒定至2019年，已報(bào)道的寄主均為紫云英。 Vaghefi等2020年首次報(bào)道在澳大利亞黃芪匍柄霉可以侵染小扁豆Lens culinaris葉片引起葉斑病[26]。至此，黃芪匍柄霉引起病害的寄主僅有紫云英和小扁豆，均屬豆科綠肥作物，分布于中國(guó)、日本、澳大利亞和韓國(guó)。

本研究首次在我國(guó)河南省和廣西壯族自治區(qū)發(fā)現(xiàn)由黃芪匍柄霉引起的紫云英葉斑病，并基于多基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析和形態(tài)學(xué)鑒定相結(jié)合的方法對(duì)病原菌進(jìn)行了鑒定。紫云英匍柄霉葉斑病在中日韓三國(guó)均有報(bào)道，尤其是國(guó)內(nèi)近幾年恢復(fù)了綠肥生產(chǎn)，多個(gè)省已經(jīng)大面積種植紫云英，該病害很可能在今后流行至河南、廣西、浙江以外的其他省份，這將對(duì)我國(guó)綠肥產(chǎn)業(yè)發(fā)展產(chǎn)生不利影響。此外，黃芪匍柄霉在澳大利亞已經(jīng)有對(duì)小扁豆的侵染致病記錄，因此該病原菌對(duì)我國(guó)小扁豆的生產(chǎn)也具有潛在威脅，進(jìn)一步研究紫云英葉斑病的發(fā)病規(guī)律、防治策略等十分重要。

參考文獻(xiàn)

[1] 曹衛(wèi)東， 包興國(guó)， 徐昌旭， 等. 中國(guó)綠肥科研60年回顧與未來(lái)展望[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)， 2017， 23（6）： 1450-1461.

[2] 李忠義， 唐紅琴， 何鐵光， 等. 綠肥作物紫云英研究進(jìn)展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 36（11）： 27-32.

[3] 周健， 袁國(guó)保， 耿月明， 等. 對(duì)我國(guó)紫云英發(fā)展的思考[J]. 中國(guó)種業(yè)， 2012（12）： 19-22.

[4] HANLIN R T， AMANO K. Host range and geographical distribution of the powdery mildew fungi [J]. Mycologia， 1986， 82（4）： 533.

[5] 戴芳瀾. 中國(guó)真菌總匯[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 1979.

[6] PEREGRINE W T H， SIDDIQI M A. A revised and annotated list of plant diseases in Malawi [J]. Phytopathological Papers， 1972， 16：1-51.

[7] SHIN H D. Erysiphaceae of Korea [M]. Suwon， Korea： National Institute of Agricultural Science and Technology， 2000.

[8] CHO W D， SHIN H D. List of plant diseases in Korea [M]. Fourth edition. Korean Society of Plant Pathology， 2004.

[9] RICHARDSON M J. An annotated list of seed-borne diseases [M]. Fourth Edition. Zurich： International Seed Testing Association， 1990.

[10]張中義. 中國(guó)真菌志. 第二十六卷， 葡萄孢屬 柱隔孢屬[M]. 北京：科學(xué)出版社， 2006.

[11]張中義. 中國(guó)真菌志. 第十四卷， 枝孢屬 黑星孢屬 梨孢屬[M]. 北京：科學(xué)出版社， 2003.

[12]HSIEH W H， GOH T K. Cercospora and similar fungi from Taiwan [M]. Taiwan： Maw Chang Book Company， 1990.

[13]BRAUN U. A monograph of Cercosporella， Ramularia and allied genera （phytopathogenic hyphomycetes）. Additions to host range and distribution [M]. München： IHW-Verlag： 1995.

[14]VIDEIRA S I R， GROENEWALD J Z， BRAUN U， et al. All that glitters is not Ramularia [J]. Studies in Mycology， 2016， 83： 49-163.

[15]VIDEIRA S I R， GROENEWALD J Z， NAKASHIMA C， et al. Mycosphaerellaceae-Chaos or clarity？[J]. Studies in Mycology， 2017， 87： 257-421.

[16]葛起新. 浙江植物病蟲(chóng)志 病害篇 （第一集）[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社， 1991.

[17]YOSHII H. Studies on leaf spot disease of milk vetch [J]. Journal of Plant Protection， 1929， 16： 533-537.

[18]YU S H. Korean species of Alternaria and Stemphylium [M].? Suwon， Republic of Korea，

National Institute of Agricultural Science and Technology： 2001.

[19]張?zhí)煊? 中國(guó)真菌志. 第三十卷， 蠕形分生孢子真菌[M]. 北京：科學(xué)出版社， 2010.

[20]CHI M H， PARK S Y， LEE Y H. A quick and safe method for fungal DNA extraction [J]. The Plant Pathology Journal， 2009， 25（1）： 108-111.

[21]WOUDENBERG J H C， HANSE B， VAN LEEUWEN G C M， et al. Stemphylium revisited [J]. Studies in Mycology， 2017， 87： 77-103.

[22]WHITE T J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics [M]. San Diego： CA Academic Press， 1990.

[23]BERBEE M L， PIRSEYEDI M， HUBBARD S. Cochliobolus phylogenetics and the origin of known， highly virulent pathogens， inferred from ITS and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene sequences [J]. Mycologia， 1999， 91（6）： 964-977.

[24]CARBONE I， KOHN L M. A method for designing primer sets for speciation studies in filamentous ascomycetes [J]. Mycologia， 1999， 91（3）： 553-556.

[25]YAMAMOTO W. Synonymous species of Alternaria and Stemphylium in Japan [J]. Transactions of the Mycological Society of Japan， 1960， 2： 88-93.

[26]VAGHEFI N， THOMPSON S M， KIMBER R B E， et al. Multi-locus phylogeny and pathogenicity of Stemphylium species associated with legumes in Australia [J]. Mycological Progress， 2020， 19（4）： 381-396.

（責(zé)任編輯：田 喆）