劉娟 陳斌 閆福華

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院·南京市口腔醫(yī)院牙周病科 南京 210008

牙周炎是由菌斑生物膜引起的慢性感染性疾病，會導(dǎo)致牙周組織炎癥感染甚至喪失，是成年人失牙的主要原因之一。同時(shí)，牙周炎的疾病發(fā)展與全身健康密切相關(guān)。牙周治療的最終目標(biāo)是修復(fù)和重建已破壞的牙周組織，實(shí)現(xiàn)牙周組織再生[1]。目前的牙周治療可以有效控制牙周炎癥，尚不能獲得理想的組織再生，因此，尋找有效的促進(jìn)牙周組織再生的方法具有重要的臨床意義。

牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cells，PDLCs）是牙周組織的主要構(gòu)成細(xì)胞，是一個(gè)異質(zhì)性很強(qiáng)的細(xì)胞群，其中包含的牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）具有自我更新和多向分化的潛能[2]，可以分化為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等，在維持牙周組織穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)牙周組織修復(fù)再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

血小板濃縮制品是近年來臨床上比較常用的自體來源性生長因子，包含多種生長因子且質(zhì)量濃度較高，各種生長因子的比例與人體中生長因子的比例相符，生物安全性高且外源性感染風(fēng)險(xiǎn)低。目前常用的血小板濃縮制品主要包括富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）和濃縮生長因子（concentrate growth factor，CGF）。PRP是自體全血經(jīng)二次離心得到的血小板濃縮物，其血小板質(zhì)量濃度至少為全血血小板的4倍以上[3-4]；CGF是全血通過加速離心制取的新一代血小板濃縮制品，呈凝膠狀，富含生長因子的同時(shí)兼具了纖維團(tuán)塊的立體構(gòu)架，可以壓制成膜狀，有利于手術(shù)創(chuàng)面的初期穩(wěn)定[5]。

張宇等[6]使用PRP聯(lián)合磷酸三鈣修復(fù)種植體周骨缺損，對術(shù)后骨組織標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：與對照組相比，PRP組新骨形成更為致密。Choi等[7]的研究則表明：低質(zhì)量濃度的PRP可促進(jìn)牙槽骨相關(guān)細(xì)胞的增殖，而高質(zhì)量濃度的PRP反而會抑制細(xì)胞的增殖。Bozkurt Do?an等[8]通過膜齦手術(shù)的臨床對照試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：加入CGF的實(shí)驗(yàn)組，其角化齦寬度和厚度的增量均高出對照組約0.4 mm，且術(shù)后牙齦退縮的風(fēng)險(xiǎn)更低。Pirpir等[9]通過研究發(fā)現(xiàn)：CGF可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖能力，亦可促進(jìn)細(xì)胞的分化速度，促進(jìn)骨修復(fù)過程；然而Honda等[10]則認(rèn)為：高質(zhì)量濃度CGF會抑制干細(xì)胞的增殖和分化。魏中武等[11]通過對比大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)：CGF雖然在口腔臨床的應(yīng)用廣泛，但作用機(jī)制有待研究。

鑒于PDLCs在牙周穩(wěn)態(tài)和牙周組織修復(fù)再生過程中的作用，筆者有理由提出設(shè)想：PRP和CGF對PDLCs的增殖和分化存在影響，從而影響著牙周組織修復(fù)再生的過程，因此有必要對PRP、CGF在牙周組織修復(fù)再生過程中發(fā)揮的作用進(jìn)行探討，以期指導(dǎo)其在臨床上的有效應(yīng)用。本文通過研究 PRR、CGF 對人PDLCs （human PDLCs，hPDLCs）增殖、遷移及成骨分化的影響，進(jìn)一步探討PRP、CGF在牙周組織再生中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料和設(shè)備

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco公司，美國），抗波形絲蛋白抗體、抗角蛋白抗體（Bioworld 公司，美國），茜素紅、油紅O、CCK-8（Cell Counting Kits-8） 試劑盒 （Sigma公司，美國），結(jié)晶紫染液（南京凱基生物公司），Runx2（runt-related transcription factor 2）（Cell Signaling Technology，美國），Dlx5（distal-less homebox 5）抗體、Msx2 （mu-scle segment homeobox gene 2）抗體（Abcam公司，英國）和Osx（Osterix）抗體（R&D公司，美國）等。

一次性真空采血管、細(xì)胞培養(yǎng)皿（Corning公司，美國）、倒置相差顯微鏡（Nikon公司，日本）、CGF離心機(jī)（Medifuge公司，意大利）。

1.2 hPDLCs的培養(yǎng)與鑒定

收集18~30歲志愿者拔除的健康的正畸減數(shù)牙或阻生牙，反復(fù)沖洗后刮取牙根中1/3部位的牙周膜組織，采用組織塊法進(jìn)行原代培養(yǎng)。選取生長良好的第2代hPDLCs行波形絲蛋白、角蛋白染色，通過免疫組織化學(xué)法檢測細(xì)胞來源，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，油紅O和茜素紅染色分別檢測細(xì)胞成脂分化和成骨分化的潛能。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號為ChiCTR-OCH-13004679），所有志愿者均已知情同意。

1.3 血小板濃縮制品的制備與血小板計(jì)數(shù)

選取7名健康志愿者制備血小板濃縮制品。7名志愿者年齡22~26歲，無全身系統(tǒng)性疾病，女性處于非經(jīng)期和孕期。實(shí)驗(yàn)經(jīng)南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號為ChiCTROCH-13004679），所有志愿者均已知情同意。

抽取志愿者肘靜脈全血25 mL，分為3組。1）對照組：5 mL全血加入抗凝劑；2）PRP組：10 mL全血加入抗凝劑，制備PRP；3）CGF組：10 mL全血不加抗凝劑，制備CGF。

1.3.1 PRP 制備 肘靜脈全血10 mL（加入抗凝劑），1 000 r·min-1離心15 min，吸取上層血漿（包括血小板和白細(xì)胞層）及下方1 mm以內(nèi)的紅細(xì)胞層，3 000 r·min-1離心8 min，上層的貧血小板血漿棄去，將底層的血小板、少量的紅細(xì)胞和白細(xì)胞混合物充分懸浮置于EP管中，即為PRP。對PRP進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)。將含有100 U·mL-1人凝血酶的10% CaCl2混合液按1∶9的體積比加入PRP中，4 ℃過夜；待血塊充分收縮后，4 000 r·min-1重離心20 min；吸取上清液置于EP管中，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CGF 制備 肘靜脈全血10 mL（不加入抗凝劑），按照CGF制備程序（加速30 s，2 700 r·min-1離心2 min，2 400 r·min-1離心4 min，2 700 r·min-1離心4 min，3 000 r·min-1離心3 min，減速36 s至停止）離心，分為3層：上層為貧血小板血漿層，下層為紅細(xì)胞層，中間即為CGF凝膠層（圖1）。取CGF層及部分與紅細(xì)胞層交界的沉淀物置于離心管中，室溫下靜置60 min，3 000 r·min-1離心20 min，取上清部分即為實(shí)驗(yàn)用CGF。對制備的CGF進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，分裝，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

圖1 全血制備CGFFig 1 The preparation of CGF from the whole blood

1.4 CCK-8 法 檢 測 PRP、CGF 對 hPDLCs 增 殖 能力的影響

選取生長良好的第3、4代hPDLCs細(xì)胞，以每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板，每孔接種100 μL，根據(jù)添加培養(yǎng)基不同分為3組。1）對照組：基礎(chǔ)培養(yǎng)基；2）PRP組：含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%PRP的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；3）CGF組：含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% CGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。3組細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d更換1次培養(yǎng)液；每天隨機(jī)選取8個(gè)檢測孔，每檢測孔加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；采用酶聯(lián)免疫檢測儀測量450 nm波長下各組的吸光度值。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測PRP、CGF對hPDLCs遷移能力的影響

選取生長良好的第3~4代hPDLCs細(xì)胞，以每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種于6 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，每皿接種3 mL，根據(jù)添加培養(yǎng)基不同分為3組。1）對照組：基礎(chǔ)培養(yǎng)基；2）PRP組：含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% PRP的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；3）CGF組：含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% CGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。3組細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d后，使用無菌細(xì)胞刮在培養(yǎng)皿底壁輕刮、旋轉(zhuǎn)，制造直徑約8 mm的圓形損傷區(qū)域，光學(xué)顯微鏡下檢查損傷模型區(qū)域無細(xì)胞殘留，分別在培養(yǎng)第1、4、7、10、13天每組選取1個(gè)培養(yǎng)皿進(jìn)行結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察hPDLCs的遷移能力。

1.6 PRP、CGF對hPDLCs成骨分化影響的研究

選取第3~4代hPDLCs細(xì)胞，以每毫升1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種；24 h細(xì)胞貼壁后，用無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化，將細(xì)胞分為3組。1）對照組：用無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；2）PRP組：分別用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、5%、10%PRP的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；3）CGF組：分別用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、5%、10% CGF的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。以上各組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 h，進(jìn)行礦化誘導(dǎo)，提取各組hPDLCs細(xì)胞總蛋白，Western blot檢測hPDLCs成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osx、Dlx5和Msx2的表達(dá)情況，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，組間差異比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 hPDLCs的分離培養(yǎng)及鑒定

采用組織塊法培養(yǎng)細(xì)胞在第4~5天可在顯微鏡下看見細(xì)胞從組織塊周圍游出，呈放射狀生長。細(xì)胞呈長梭形，漩渦狀排列；抗波形絲蛋白染色陽性，抗角蛋白染色陰性。CCK-8法檢測顯示細(xì)胞具備增殖能力，生長曲線基本呈S形；經(jīng)礦化誘導(dǎo)，可見礦化結(jié)節(jié)形成，經(jīng)成脂誘導(dǎo)，可見脂滴形成（圖2）。

圖2 hPDLCs的分離培養(yǎng)及鑒定Fig 2 The isolation culture and identification of hPDLCs

2.2 血小板計(jì)數(shù)

PRP中的血小板計(jì)數(shù)均為全血血小板數(shù)量的5倍以上，達(dá)到PRP的制備標(biāo)準(zhǔn)（表1）。全血制備出的CGF樣本中，通過血小板檢測儀未檢測出血小板存在（表1）。

表1 全血、PRP和CGF的血小板計(jì)數(shù)Tab 1 The platelet count of whole blood,PRP and CGF

2.3 PRP和CGF對hPDLCs增殖能力的影響

3組的增殖曲線見圖3：與對照組相比，5%PRP和5% CGF組hPDLCs的增殖明顯增強(qiáng)，細(xì)胞生長曲線基本呈S形；在快速增殖期（4~6 d），對照組與2個(gè)實(shí)驗(yàn)組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示PRP、CGF均可促進(jìn)hPDLCs的增殖。

圖3 PRP、CGF對hPDLCs增殖能力的影響Fig 3 The effect of PRP and CGF on the proliferation ability of hPDLCs

2.4 PRP和CGF對hPDLCs遷移能力的影響

3組的細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4：與對照組相比，PRP和CGF組的細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)；第13天，PRP、CGF組無細(xì)胞區(qū)域有70%~80%的面積鋪滿細(xì)胞，而對照組無細(xì)胞區(qū)域僅約50%鋪滿細(xì)胞。與對照組相比，PRP、CGF組對hPDLCs遷移能力的影響具有明顯差異（P<0.05）；而CGF與PRP組相比，兩組無明顯差異（P>0.05）。結(jié)果提示：PRP和CGF均可促進(jìn)hPDLCs的遷移，但二者促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用無明顯差異。

圖4 PRP、CGF對hPDLCs遷移能力的影響 結(jié)晶紫染色Fig 4 The effect of PRP and CGF on the migration ability of hPDLCs crystal violet staining

2.5 PRP、CGF對hPDLCs成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的影響

Western blot檢測結(jié)果見圖5、6。與對照組相比，PRP、CGF組Runx2、Osx、Dlx5的表達(dá)升高，Msx2表達(dá)降低；在PRP、CGF質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，與對照組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與PRP組相比，10%CGF組Runx2的表達(dá)升高，Dlx5在培養(yǎng)24、48 h時(shí)的表達(dá)升高，10%CGF組Msx2的表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖5 Western blot 法檢測PRP、CGF對成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Msx2、Osx、Dlx5、Runx2表達(dá)的影響Fig 5 The effect of PRP and CGF on the expression of Msx2,Osx,Dlx5 and Runx2 detected with Western blot

3 討論

PRP、CGF作為血小板濃縮制品，在血小板被激活后，可釋放多種生物活性物質(zhì)，包括多種生長因子，如血小板源性生長因子（platelet-derived growth factors，PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、胰島素樣生長因子（insulin like growth factor，IGF）等，可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖和分化、血管生成，促進(jìn)傷口愈合[12]。PRP具有促進(jìn)骨重建、減輕術(shù)后反應(yīng)、抗感染及炎癥調(diào)節(jié)等作用[13]。CGF作為第3代血小板濃縮制品，也具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、成骨分化和促進(jìn)血管生成等作用[14]。

本研究血小板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示：PRP中血小板計(jì)數(shù)量約為全血的5倍，符合PRP的制備標(biāo)準(zhǔn)[15]。CGF在制備過程中，未加入外源性抗凝劑，在變速離心、室溫靜置、再離心等過程中，血小板被激活，血小板計(jì)數(shù)未檢測出。另外，值得注意的是，不同志愿者的全血制備出的血液制品中血小板計(jì)數(shù)存在差異，提示血小板計(jì)數(shù)存在個(gè)體差異性。

本研究通過組織塊法獲得hPDLCs，多數(shù)細(xì)胞的胞體較大，呈長梭形（圖2），提示分離的細(xì)胞主要由成纖維樣細(xì)胞和不同分化階段的細(xì)胞共同組成，是含有干細(xì)胞成分的細(xì)胞群；經(jīng)免疫組織化學(xué)鑒定為間質(zhì)細(xì)胞來源，與既往的研究[16]相符。本實(shí)驗(yàn)采用第3~4代hPDLCs，具備較好的增殖能力，在培養(yǎng)4~6 d增殖明顯，之后增殖能力逐漸趨于平穩(wěn)。對hPDLCs進(jìn)行多向誘導(dǎo)，脂滴和礦化結(jié)節(jié)的形成證明細(xì)胞具備成脂、成骨分化的能力，說明本實(shí)驗(yàn)獲得的是一群異質(zhì)性，具有增殖、多向分化潛能的hPDLCs[17]。

圖6 PRP、CGF對成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Dlx5、Osx、Msx2表達(dá)的影響Fig 6 The effect of PRP and CGF on the expression levels of Runx2,Dlx5,Osx and Msx2

本實(shí)驗(yàn)中CCK-8實(shí)驗(yàn)（圖3）結(jié)果顯示：PRP、CGF均可促進(jìn)hPDLCs的增殖，促進(jìn)效果明顯優(yōu)于對照組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CGF組促進(jìn)hPDLCs增殖水平最高。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（圖4）結(jié)果顯示：PRP和CGF均能夠促進(jìn)hPDLCs的細(xì)胞遷移，且CGF的促進(jìn)效果優(yōu)于PRP。其可能原因是：PRP和CGF作為血小板濃縮制品，富含多種生長因子，包括TGF-β、VEGF、PDGF等，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移；CGF通過加速離心方式，最大限度地富集了血小板中的生長因子，可能具有更優(yōu)的促進(jìn)作用。

Runx2、Osx、Dlx5和Msx2等成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子通過參與轉(zhuǎn)化生長因子-β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白（transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein）信號通路、Notch信號通路及Wnt信號通路等參與調(diào)節(jié)骨代謝過程，對骨代謝及骨重塑具有重要意義[18]。Runx2 的表達(dá)提示成骨細(xì)胞 （osteoblast，OB）開始分化，可以激活相關(guān)成骨蛋白（骨鈣蛋白、骨橋蛋白、骨涎蛋白和Ⅰ型膠原蛋白等）的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞向分化[19]。Osx處于OB分化路徑中Runx2的下游，受Runx2表達(dá)的影響[20]。Dlx5能夠調(diào)節(jié)BMP-2誘導(dǎo)Runx2、Osx的表達(dá)過程[21]，Msx2能抑制Runx2的轉(zhuǎn)錄活性；Msx2與Dlx5相互協(xié)調(diào)，Dlx5可干擾Msx2對Runx2的抑制作用。

本實(shí)驗(yàn)以不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（1%、5%、10%）的PRP、CGF分別與hPDLCs共培養(yǎng)不同的時(shí)間（24、48、72 h），Western blot結(jié)果（圖5）顯示：隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，Runx2、Osx、Dlx5的蛋白表達(dá)量增加，且呈時(shí)間依賴性，在72 h達(dá)到最高；在同樣時(shí)間下，隨著PRP、CGF質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，蛋白表達(dá)量增加，在10%時(shí)達(dá)到最高；而Msx2蛋白表達(dá)量在24 h時(shí)相對最高，隨著PRP、CGF質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，其表達(dá)量降低。這與以往的研究[22-24]基本相符。本實(shí)驗(yàn)中，與PRP相比，CGF對Runx2、Dlx5的促進(jìn)作用在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)存在明顯差異，而對Osx的促進(jìn)作用在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間則沒有明顯差異；CGF對Msx2的抑制作用較弱，僅在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)與其他質(zhì)量分?jǐn)?shù)存在差異。此外，本研究發(fā)現(xiàn)：hPDLCs成骨分化過程中，Runx2、Osx、Dlx5和Msx2的表達(dá)受PRP和CGF的影響，提示PRP、CGF對hPDLCs成骨分化具有促進(jìn)作用，其過程是多重轉(zhuǎn)錄因子和信號通路共同調(diào)控的結(jié)果。后續(xù)的研究中需要進(jìn)一步明確發(fā)揮主要作用的轉(zhuǎn)錄因子，必要時(shí)進(jìn)行進(jìn)一步的靶向抑制劑的調(diào)控研究。

有研究[7,10]發(fā)現(xiàn)：低濃度、高濃度的PRP和CGF對細(xì)胞的增殖、分化能力影響不同。筆者在前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)中，采用的是5%和8%的RPR和CGF觀察其對hPDLCs增殖能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：RPR和CGF均可促進(jìn)hPDLCs的增殖能力，但是兩者間無明顯差異。同時(shí)，由于從全血中制備PRP和CGF的量不多，因此，在本研究采用1%、5%、10%的PRP、CGF與hPDLCs共培養(yǎng)，結(jié)果顯示均具備促進(jìn)增殖、遷移和分化的能力。但是，本實(shí)驗(yàn)中PRP、CGF對hPDLCs的促進(jìn)作用未能達(dá)到并形成一個(gè)峰值進(jìn)而出現(xiàn)拐點(diǎn)，因此后續(xù)研究中需要進(jìn)一步提高PRP、CGF的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，研究其對hPDLCs的作用，進(jìn)一步探討臨床應(yīng)用的最適宜質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

綜上所述：PRP、CGF可以促進(jìn)hPDLCs增殖，增強(qiáng)Runx2、Osx、Dlx5表達(dá)并抑制Msx2表達(dá)，達(dá)到促進(jìn)hPDLCs成骨分化的作用。PRP和CGF有望在牙周組織重建中發(fā)揮重要作用，但其作用機(jī)制、最適宜的作用質(zhì)量分?jǐn)?shù)及臨床療效尚需要進(jìn)行進(jìn)一步的臨床研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。