陳 帥，陸登成，王 維，韋姍姍

原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EH)是常見的慢性疾病之一，是多種心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。EH發(fā)病涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，但由于其受多基因、多因素影響，遺傳和環(huán)境因素通過什么途徑和環(huán)節(jié)升高血壓，至今尚無確切定論，治療效果也不盡如人意。

近年來，隨著系統(tǒng)生物學(xué)的不斷完善，對高血壓的研究角度逐漸由局部轉(zhuǎn)向整體。代謝組學(xué)通過對生物體體液或組織中的代謝物(分子量<1 000)進(jìn)行檢測、確定、定量和分類，并將代謝物與生物過程關(guān)聯(lián)起來。磁共振(NMR)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)等技術(shù)是目前應(yīng)用于代謝組學(xué)領(lǐng)域的主流手段。NMR無須前處理，對樣本沒有損傷，但靈敏度較低[1]。GC-MS具有高精密度、高靈敏度、高耐用性的特點(diǎn)，但對于生物體系中極性比較大的糖類、氨基酸等成分的分析，需要進(jìn)行衍生化處理才能得到較多的代謝組分信息[2]。LC-MS具有對復(fù)雜生物樣本的分離能力以及更好的靈敏度，其中超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF/MS)以其高分離度、高靈敏度、對難揮發(fā)或熱穩(wěn)定性差代謝物的高分辨率，在分析機(jī)體復(fù)雜的代謝物中有極大優(yōu)勢。

自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)是目前全球公認(rèn)最近似于人類EH的動(dòng)物模型，其血壓一般在12周齡達(dá)到穩(wěn)定，8周齡時(shí)屬血壓升高早期。本實(shí)驗(yàn)通過UPLC-Q-TOF/MS技術(shù)檢測早期SHR和Wistar大鼠血漿差異性代謝物，并尋找潛在生物標(biāo)志物，以期為高血壓發(fā)病早期的病理過程提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8只無特定病原體(SPF)級SHR，雄性，8周齡，體質(zhì)量160～180 g；8只SPF級Wistar大鼠，雄性，8周齡，體質(zhì)量250～280 g，均來源于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[動(dòng)物合格證：SCXK(京)2016-0006]。動(dòng)物飼養(yǎng)光暗周期為12 h/12 h，自由飲食進(jìn)水。所有實(shí)驗(yàn)操作符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.1.2 試劑與儀器 儀器與耗材：Triple TOF 6600質(zhì)譜儀(ABSCIEX，美國)；Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(Agilent，美國)；低溫高速離心機(jī)(Eppendorf5430R，德國)；色譜柱： A CQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column(Waters，美國)；ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm， 2.1×100 mm column(Waters，美國)；Softron智能無創(chuàng)血壓計(jì)BP-2010E(北京軟隆生物技術(shù)有限公司，中國)。

試劑：乙腈(Merck，1499230-935)；乙酸銨(Sigma，70221)；肝素(BioFroxx，EZ2811F323)等。

1.2 方法

1.2.1 血壓檢測 適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，每日09：00～11：00完成對SHR和Wistar血壓的測量，實(shí)驗(yàn)期間共監(jiān)測6次安靜狀態(tài)下大鼠血壓。測量前開啟預(yù)熱泵，溫度設(shè)定為37 ℃，預(yù)熱10 min后將大鼠放置于固定器中，把無創(chuàng)血壓測量尾套放置于大鼠尾部近根部，以未接觸尾部白毛為準(zhǔn)，測量大鼠安靜狀態(tài)下尾壓，連續(xù)測量3次取平均值。

1.2.2 血漿收集及樣品處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以戊巴比妥鈉麻醉心臟取血，將血液放入置有20 μL肝素(10 mg/mL)的1.5 mL離心管中抗凝。離心后收集血漿，用液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存。檢測時(shí)取出樣本，在4 ℃環(huán)境下緩慢解凍后，加入400 μL預(yù)冷甲醇/乙腈/水溶液(2∶2∶1，V/V)混合，低溫超聲30 min，-20 ℃靜置10 min，14 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液真空干燥，質(zhì)譜分析時(shí)加入100 μL乙腈水溶液(乙腈∶水=1∶1，V/V)復(fù)溶，渦旋，14 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.2.3 UPLC-Q-TOF/MS分析條件 樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)HILIC色譜柱進(jìn)行分離，柱溫25 ℃，流速0.3 mL/min，流動(dòng)相組成A：水+25 mmol乙酸銨+25 mmol氨水，B：乙腈；梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，95%B；0.5～7.0 min，B從95%線性變化至65%；7.0～8.0 min，B從65%線性變化至40%；8.0～9.0 min，B維持在40%；9.0～9.1 min，B從40%線性變化至95%；9.1～12.0 min，B維持在95%。整個(gè)分析過程中樣品置于4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中。為避免儀器檢測信號波動(dòng)而造成的影響，采用隨機(jī)順序進(jìn)行樣本的連續(xù)分析。樣本隊(duì)列中插入QC樣品，用于監(jiān)測和評價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

質(zhì)譜條件：在正負(fù)模式下均使用電噴霧電離(ESI)。ESI源條件設(shè)置為：干燥氣溫度250 ℃，流量16 L/min；鞘氣溫度400 ℃，流速12 L/min；霧化器壓20 psig；毛細(xì)管電壓3 000 V；錐孔電壓0 V；裂解電壓175 V；采集頻率4 Hz；掃描范圍50～1 200；循環(huán)時(shí)間250 ms。在自動(dòng)MS/MS采集中設(shè)置ESI源條件：霧化氣40，輔助氣80，氣簾氣30；源溫度650 ℃；源噴霧電壓±5 500 V。在高靈敏度模型下對二級離子掃描進(jìn)行信息依賴采集(IDA)。參數(shù)設(shè)置：去簇電壓±60 V，碰撞能(35±15)eV，排除4 Da以內(nèi)的同位素，每個(gè)循環(huán)監(jiān)測10個(gè)離子。數(shù)據(jù)采集按質(zhì)量范圍進(jìn)行分段，50～300、290～600、590～900、890～1 200，從而擴(kuò)大二級質(zhì)譜的采集率，每個(gè)方法每段采取4個(gè)重復(fù)。所采得數(shù)據(jù)分別使用自建MetDDA和LipDDA，進(jìn)行代謝物的鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 血壓水平 SHR組收縮壓(160～180 mmHg，1 mmHg=0.133 kPa)、舒張壓(120～140 mmHg)及平均壓(130～150 mmHg)均高于Wistar組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖1～圖3。

2.2 代謝組學(xué)分析 血漿樣本正離子模式PCA圖(見圖4)與血漿樣本負(fù)離子模式PCA圖(見圖5)，兩種模式下都能較好區(qū)分兩組大鼠。

圖4 PCA得分散點(diǎn)圖(正離子模式)

圖5 PCA得分散點(diǎn)圖(負(fù)離子模式)

為了更好地驗(yàn)證兩組大鼠血漿樣本分離情況，對SHR組和Wisar組數(shù)據(jù)進(jìn)行OPLS-DA分析(見圖6、圖7)。在OLPS-DA分析中兩組大鼠血漿樣本分離程趨勢更加明顯，正離子模式R2X=0.947，R2Y=0.999，Q2=0.777，負(fù)離子模式R2X=0.78，R2Y=0.998，Q2=0.879，證明該模型可靠。

圖6 OPLS-DA得分散點(diǎn)圖(正離子模式)

圖7 OPLS-DA得分散點(diǎn)圖(負(fù)離子模式)

在OPLS-DA模型分析中獲得SHR和Wistar大鼠S-Plot載荷圖(見圖8、圖9)。載荷圖中每一個(gè)位點(diǎn)代表一個(gè)變量，為造成SHR和Wistar大鼠差異的內(nèi)在分子。變量的重要程度由VIP值決定，離中心越遠(yuǎn)的位點(diǎn)其VIP值越大，根據(jù)VIP值的大小篩選出差異性變量，VIP值大于1的變量可能為潛在生物標(biāo)記物。

圖8 S-Plot載荷圖(正離子模式)

圖9 S-Plot載荷圖(負(fù)離子模式)

2.3 差異性代謝物的鑒定 血漿樣本中共鑒定出差異性代謝物13種。詳見表1。

表1 SHR與Wistar大鼠血漿樣本中差異性代謝物情況

2.4 潛在代謝通路分析 利用Metabo Analyst數(shù)據(jù)庫及KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行處理分析，選取P<0.05的代謝通路，其中涉及纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝、初級膽汁酸的生物合成、組氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝這4種代謝途徑。各途徑及其相關(guān)差異性代謝物見表2，差異性代謝物及相關(guān)代謝通路見圖10。

表2 各代謝途徑及涉及的代謝物

圖10 相關(guān)代謝通路

3 討 論

纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸是支鏈必需氨基酸。這3種氨基酸對人類生活至關(guān)重要，主要作用于修復(fù)機(jī)體肌肉，控制血糖，并給身體組織提供能量[3]。一項(xiàng)前瞻性研究顯示，過高的支鏈必需氨基酸(特別是纈氨酸)的攝入與高血壓發(fā)病率有較高關(guān)聯(lián)[4]，過量的纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸累積會抑制葡萄糖代謝，導(dǎo)致胰島素抵抗[3]。而胰島素抵抗可以通過幾種機(jī)制來升高血壓：腎吸收鈉增加，交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖和血管平滑肌細(xì)胞合成[5]。反之，高血壓通過改變胰島素和葡萄糖向骨骼肌細(xì)胞的輸送，導(dǎo)致葡萄糖攝取受損，加劇胰島素抵抗。L-亮氨酸還可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞中L-精氨酸的一氧化氮(NO)合成，6-果糖磷酸氨基轉(zhuǎn)移酶(GFAT)是合成葡萄糖胺(一種抑制內(nèi)皮細(xì)胞合成NO的抑制劑)中的一種速率控制酶。L-亮氨酸通過增強(qiáng)GFAT蛋白表達(dá)，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞中的NO合成[6]。本實(shí)驗(yàn)中SHR血漿內(nèi)纈氨酸、L-異亮氨酸、亮氨酸相對含量較高與該研究具有一致性，推測SHR的血壓升高或與纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸的過量堆積導(dǎo)致的胰島素抵抗及L-亮氨酸抑制NO的合成有關(guān)。

L-精氨酸是一種在體內(nèi)具有多種功能的氨基酸?？捎糜谏蒒O、肌酸、L-谷氨酸和L-脯氨酸等化合物[7]。L-精氨酸是合成NO的唯一底物[8]，而NO通過擴(kuò)張血管、抑制血管平滑肌增殖等作用降低血壓[9]。精氨酸酶會誘導(dǎo)L-精氨酸分解為鳥氨酸，在病理生理狀態(tài)下，例如高血壓和缺血性再灌注等，內(nèi)皮精氨酸酶活性增加，促進(jìn)L-精氨酸分解為鳥氨酸，降低L-精氨酸濃度，進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明SHR的L-精氨酸含量低于Wistar大鼠，提示精氨酸的缺乏可能是EH發(fā)展的原因之一。

L-谷氨酰胺是精氨酸和脯氨酸代謝中的重要底物。L-谷氨酰胺通過誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1、熱休克蛋白和谷胱甘肽表達(dá)在循環(huán)中發(fā)揮抗氧化和抗炎作用，也可作為L-精氨酸的前體促進(jìn)NO合成[11]。L-組氨酸是組胺和肌肽生物合成的前體，通過脂肪細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)途徑抑制促炎性細(xì)胞因子的表達(dá)[12]。本實(shí)驗(yàn)中SHR的組氨酸含量高于Wistar大鼠，提示SHR可能處于炎癥狀態(tài)，SHR中L-谷氨酰胺含量高于Wistar大鼠，并且L-精氨酸含量較低，推測SHR存在以L-谷氨酰胺為前體的L-精氨酸合成障礙。

膽汁酸分為初級膽汁酸和次級膽汁酸。初級膽汁酸是肝細(xì)胞以膽固醇為原料直接合成的膽汁酸，包括膽酸、鵝去氧膽酸及相應(yīng)結(jié)合型膽汁酸，次級膽汁酸是初級膽汁酸隨膽汁進(jìn)入腸道，由腸道菌酶催化，經(jīng)去結(jié)合反應(yīng)，脫去羥基轉(zhuǎn)化而成[13]。鵝去氧膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、?；侨パ跄懰?、膽酸、牛磺膽酸都屬于初級膽汁酸。膽汁酸是生理性清潔劑，促進(jìn)脂類的消化吸收，抑制膽汁中膽固醇的析出，調(diào)節(jié)膽汁流量和脂質(zhì)分泌，對于膳食脂肪和維生素的吸收必不可少[14]。膽汁酸是11β-羥化固醇脫氫酶Ⅱ型的內(nèi)源性抑制劑，當(dāng)膽汁酸代謝發(fā)生障礙反流入血，抑制11β-羥化固醇脫氫酶Ⅱ型活性，導(dǎo)致皮質(zhì)醇激活鹽皮質(zhì)激素受體，引發(fā)鈉潴留，促進(jìn)高血壓發(fā)展[15-16]，在臨床研究中也發(fā)現(xiàn)，高血壓病人總膽汁酸水平在服用不同降壓藥物(氨氯地平和吲達(dá)帕胺)后均顯著降低[17]，而高血壓病人總膽汁酸水平相對正常人群較高[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，鵝去氧膽酸、甘氨鵝去氧膽酸、?；侨パ跄懰?、膽酸、?；悄懰岷吭赟HR中均高于Wistar大鼠，可能是因?yàn)槌跫壞懼岷铣蛇^多或者次級膽汁酸合成障礙導(dǎo)致膽汁酸代謝障礙，反流入血以致總膽汁酸水平升高，導(dǎo)致血壓升高。

本實(shí)驗(yàn)考察早期SHR和Wistar大鼠的血漿代謝物差異，為參與高血壓早期階段的主要代謝物及通路提供初步依據(jù)。