張文思，朱文卿，邱 憬*

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院種植科，2江蘇省口腔疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3江蘇省口腔轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)工程研究中心，江蘇 南京210029

純鈦具有良好的生物相容性，因此鈦種植體廣泛應(yīng)用于牙列缺損和牙列缺失的種植體修復(fù)材料。目前臨床多采用大顆粒噴砂-酸蝕、微弧氧化等技術(shù)構(gòu)建表面微米級(jí)粗糙形貌以增加種植體與骨的接觸面積和機(jī)械嵌合力，促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附、增殖和分化［1-3］。一直以來，如何使鈦種植體與周圍骨組織產(chǎn)生快速穩(wěn)固的結(jié)合是研究的熱點(diǎn)。雖然對(duì)鈦表面改性的研究從未停止，但鈦表面有機(jī)生物涂層能否更好地促進(jìn)鈦種植體骨結(jié)合仍有待進(jìn)一步探索。

膠原蛋白是主要的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）蛋白之一。它具有纖維結(jié)構(gòu)，這對(duì)于組織支架執(zhí)行功能至關(guān)重要［4］。ECM中膠原蛋白的存在決定了機(jī)體組織的結(jié)構(gòu)完整性、生化特性和生理功能。它通過特定受體和結(jié)合位點(diǎn)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，包括細(xì)胞黏附、遷移、增殖、分化和基因表達(dá)［5］。膠原蛋白還可通過向細(xì)胞提供生長因子來增強(qiáng)細(xì)胞功能［6］。到目前為止，已鑒定和表征了29種膠原蛋白［7］。其中，Ⅰ型膠原作為人體內(nèi)含量最豐富的基質(zhì)蛋白廣泛存在于皮膚、肌腱、骨骼、韌帶和角膜等結(jié)締組織中［8］。Ⅰ型膠原蛋白具有低抗原性、可生物降解性、良好的生物相容性以及細(xì)胞增殖作用［9］。從天然原料提取和純化的Ⅰ型膠原蛋白缺乏足夠的機(jī)械強(qiáng)度，可通過交聯(lián)改性法、重度脫水法、側(cè)鏈修飾法以及生理活性物固定化來提升膠原的拉伸強(qiáng)度和抗降解能力，改善其力學(xué)性能和抗水性，以形成單一或復(fù)合形式的多孔支架或薄膜［10-11］，從而為細(xì)胞附著和增殖提供有利形貌。因此，Ⅰ型膠原蛋白具有應(yīng)用于材料表面有機(jī)涂層的潛力。

基于Ⅰ型膠原蛋白在維持組織結(jié)構(gòu)和功能方面的重要性及其在生物醫(yī)學(xué)、組織工程、藥物發(fā)現(xiàn)和藥物遞送中的應(yīng)用［12-13］，可利用膠原蛋白生物膜進(jìn)行鈦表面有機(jī)生物涂層改性。改性方法包括物理交聯(lián)法和化學(xué)交聯(lián)法，化學(xué)交聯(lián)法是使用戊二醛等有毒物質(zhì)對(duì)膠原蛋白進(jìn)行改性，物理交聯(lián)法則不會(huì)引入毒性物質(zhì)。通過物理交聯(lián)法將Ⅰ型膠原蛋白附著于鈦表面，可模仿天然微環(huán)境或作為運(yùn)載工具對(duì)成骨起促進(jìn)作用。然而，這種通過膠原纖維改性制備的鈦表面生物涂層能否促進(jìn)成骨分化、加速成骨進(jìn)程，仍有待探究。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過物理改性法在純鈦表面制備Ⅰ型膠原蛋白生物涂層，并初步研究其對(duì)成骨細(xì)胞行為的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

商用級(jí)純鈦（Tal，99.5%，寶雞盛輝鈦業(yè)），SiC砂紙（天津南景磨料磨具有限公司）、0.9%生理鹽水、Ⅰ型牛骨膠原蛋白（上海國藥公司），小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1（上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫），α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶/EDTA（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，Gibco BRL 公司，美國），青霉素/鏈霉素雙抗溶液（Gibco 公司，美國），胰蛋白酶（Sigma公司，美國），4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、CCK-8 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）、羅丹明標(biāo)記的鬼比環(huán)肽（Cytoskeleton 公司，美國），BCA 蛋白定量試劑盒（南京凱基生物），堿性磷酸酶（ALP/AKP）測試盒（南京建成生物科技有限公司），Runx相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt-related transcription factor-2，CST 公司，美國）、OSX（Osterix，CST 公司，美國）、骨鈣素（osteocalcin，OCN，Abcam 公司，美國）、GAPDH 抗體（Sigma 公司，美國），辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠、山羊抗兔、兔抗山羊二抗（Santa Cruz 公司，美國），ECL Western blot 試劑盒（Millipore 公司，美國）。掃描電子顯微鏡（1530VP，LEO 公司，德國），X 射線光電子能譜儀（Thermo Escalab 250Xi，Thermo 公司，美國），紅外光譜測試儀（Nicolet ISSO，Thermo公司，美國），標(biāo)準(zhǔn)型光學(xué)接觸角儀（SL200B，科諾公司，美國），細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（Thermo 公司，美國），激光共聚焦顯微鏡（LSM710，Zeiss 公司，德國），微孔板分光光度計(jì)（MD 公司，美國），化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（LAS4000mini，GE公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 試件及Ⅰ型膠原蛋白凝膠制備

光滑鈦（cp-Ti）試件：碳化硅砂紙（320目、600目、800 目、1 200 目、1 500 目）逐級(jí)打磨拋光，依次置于雙蒸水、無水乙醇、雙蒸水中超聲清洗10 min，60 ℃干燥，高壓滅菌。

鈦表面Ⅰ型膠原蛋白涂層改性試件（cp-Ticol）：根據(jù)說明書采用冰醋酸調(diào)節(jié)Ⅰ型膠原蛋白pH為中性，用去離子水與Ⅰ型膠原蛋白混合，經(jīng)過37 ℃溫度變化，膠原蛋白自組裝為膠原纖維形成凝膠，配制1 mg/mL的Ⅰ型膠原蛋白凝膠后，置于光滑鈦試件表面制成涂層，經(jīng)過5 h 紫外線照射使膠原纖維凝膠再次發(fā)生交聯(lián)［14］，膠原蛋白涂層重度脫水后具有良好的抗膠原酶解能力，降低了膠原的水溶性，有利于提升其生物相容性。

1.2.2 鈦表面理化性能表征

兩組試件制備完成后，采用掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）觀察試件的表面微形貌；采用X 射線光電子能譜儀（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）分析試件的表面元素組成；采用紅外光譜測試儀（fourier transform infrared spectrometer，F(xiàn)T-IR），在波長400～4 000 cm-1范圍內(nèi)檢測試件表面的基團(tuán)；采用SL200B 型自動(dòng)接觸角儀，將2 μL水滴于試件表面，測量水接觸角，評(píng)估試件的表面親水性。

1.2.3 成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)

復(fù)蘇凍存的小鼠MC3T3-E1 成骨細(xì)胞，采用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)基，在37 ℃、95%相對(duì)濕度、5%CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)。定期傳代，采用3 次傳代后24 h 的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%～90%后用0.25%胰蛋白酶/EDTA消化，離心后重懸，計(jì)數(shù)并分離細(xì)胞。

1.2.4 成骨細(xì)胞黏附觀察

將MC3T3-E1 細(xì)胞（5×103個(gè)/孔）接種于兩組試件表面。分別培養(yǎng)2 h 和4 h 后，室溫下4%多聚甲醛固定30 min，羅丹明標(biāo)記的鬼比環(huán)肽室溫下避光染色30 min，PBS清洗后，DAPI室溫避光染色2 min。激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）下隨機(jī)選取視野，觀察兩組試件表面的細(xì)胞黏附形態(tài)。

1.2.5 成骨細(xì)胞增殖活性檢測

采用CCK-8 法檢測兩組試件表面成骨細(xì)胞的增殖活性。分別將兩組試件置于96 孔板中，將MC3T3-E1細(xì)胞（5×103個(gè)/孔）接種于試件表面，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)1、3、6 d 后，每孔加入200 μL 含10%CCK-8試劑的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育2 h后，采用微孔板分光光度計(jì)測定各孔450 nm 處的吸光度值。吸光度值越高表示細(xì)胞增殖活性越高。

1.2.6 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測

微板法檢測：兩組試件預(yù)置于6 孔板中，將MC3T3-E1細(xì)胞（8×104個(gè)/孔）接種于試件表面，進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，培養(yǎng)7、14 d后，棄培養(yǎng)基，PBS清洗，每孔加入200 μL RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，收集裂解細(xì)胞，4 ℃12 000 r/min 離心10 min，收集上清液。使用BCA 試劑盒和ALP 試劑盒測定蛋白濃度和ALP值，評(píng)估各組試件表面ALP活性。

染色法檢測：兩組試件預(yù)置于6 孔板中，將MC3T3-E1細(xì)胞（8×104個(gè)/孔）接種于試件表面，培養(yǎng)7、14 d后，PBS清洗，用4%福爾馬林固定30 min，使用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate，BCIP）/硝基藍(lán)四唑（Nitrobluetetrazolium chloride，NBT）堿性磷酸酶染色30 min。再次在PBS中洗滌樣品，比較各組ALP染色強(qiáng)度。

1.2.7 Western blot檢測成骨相關(guān)蛋白表達(dá)

兩組試件預(yù)置于6 孔板中，將MC3T3-E1 細(xì)胞（8×104個(gè)/孔）接種于試件表面，培養(yǎng)7、14 d后，提取細(xì)胞總蛋白，加熱變性后-20°C保存。BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。Western blot 檢測細(xì)胞中Runx2、OSX、OCN 的蛋白表達(dá)水平，以GAPDH 為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)細(xì)胞增殖活性和ALP 活性數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鈦表面形貌觀察

cp-Ti、cp-Ti-col 試件表面形貌和掃描電鏡觀察圖像見圖1。經(jīng)過物理改性后的Ⅰ型膠原蛋白在鈦表面發(fā)生交聯(lián)，形成穩(wěn)定均勻的膠原蛋白凝膠涂層。掃描電鏡低倍和高倍視野顯示，cp-Ti試件表面有清晰的機(jī)械劃痕，而cp-Ti-col 試件表面由于膠原蛋白涂層的存在使得機(jī)械劃痕變淺。

圖1 cp-Ti、cp-Ti-col試件表面形貌和掃描電鏡圖像Figure 1 Surface morphology and SEM images of cp-Ti and cp-Ti-col specimens

2.2 鈦表面元素組成和特征基團(tuán)

兩組試件表面的XPS元素分析和FT-IR檢測結(jié)果見圖2。與cp-Ti 試件比較，cp-Ti-col 試件表面存在明顯的氮（N）元素特征峰，且由于膠原蛋白涂層的存在，未檢測出鈦（Ti）元素（圖2A）。在膠原蛋白改性過程中，只有蛋白質(zhì)或多肽含有N元素。cp-Ti-col試件表面在3 400 cm-1附近呈現(xiàn)蛋白質(zhì)的特征吸收峰。在1 651 cm-1附近的吸收峰為膠原蛋白酰胺Ⅰ帶。1 546 cm-1附近的吸收峰為膠原蛋白酰胺Ⅱ帶，反映了C-N伸縮和N-H彎曲。由于膠原蛋白的甘氨酸和特征氨基酸含量高且形成獨(dú)特序列（Gly-Pro-Hyp）n，使得膠原蛋白在1 200 cm-1～1 400 cm-1處具有其他蛋白質(zhì)所沒有的紅外光譜特征。1 200 cm-1～1 360 cm-1譜帶是由C-N 伸縮和N-H 彎曲引發(fā)的酰胺Ⅲ帶，出現(xiàn)歸屬于Gly 骨架和Pro 側(cè)鏈的CH2搖擺振動(dòng)峰，其中，在1 238 cm-1附近的吸收峰為膠原蛋白N-H彎曲引發(fā)的酰胺Ⅲ帶特征峰（圖2B）。因此，PS分析和FT-IR檢測結(jié)果相一致，證實(shí)cp-Ti-col試件表面存在膠原蛋白凝膠涂層。

圖2 cp-Ti、cp-Ti-col試件的XPS分析（A）和FT-IR檢測（B）Figure 2 XPS（A）and FT-IR（B）analysis of cp-Ti and cp-Ti-col specimens

2.3 鈦表面接觸角

兩組試件表面接觸角測量結(jié)果如圖3 所示，相對(duì)于cp-Ti試件，cp-Ti-col試件表面的接觸角明顯減小。接觸角大小與親水性呈反比，因而cp-Ti-col 試件表面具有更好的親水性。

圖3 cp-Ti、cp-Ti-col試件表面接觸角Figure 3 Surface contact angles of cp-Ti and cp-Ti-col specimens

2.4 鈦表面成骨細(xì)胞的黏附鋪展

兩組試件表面接種MC3T3-E1細(xì)胞2 h、4 h后的黏附形態(tài)見圖4。低倍鏡觀察顯示：兩組試件表面的成骨細(xì)胞數(shù)量均隨時(shí)間延長而增加，且cp-Ti-col試件表面的成骨細(xì)胞數(shù)量較cp-Ti 試件更多。高倍鏡觀察顯示：兩組試件表面成骨細(xì)胞鋪展面積均隨時(shí)間延長而增大，相對(duì)于cp-Ti 試件，cp-Ti-col 試件表面的成骨細(xì)胞骨架清晰，胞漿內(nèi)可見絲狀骨架，細(xì)胞鋪展更加充分。

圖4 兩組試件表面MC3T3-E1細(xì)胞接種2 h、4 h后的黏附形態(tài)Figure 4 Adhesion morphology of MC3T3-E1 cells cultured on two substrates after 2 and 4 hours

2.5 鈦表面成骨細(xì)胞的增殖活性

兩組試件表面MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性的CCK-8檢測結(jié)果見圖5。兩組試件表面成骨細(xì)胞增殖水平隨培養(yǎng)時(shí)間延長逐漸升高。培養(yǎng)第1、3、6 d，相對(duì)于cp-Ti試件，相同時(shí)間點(diǎn)cp-Ti-col試件表面成骨細(xì)胞的增殖活性均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖5 兩組試件表面培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞1、3、6 d的CCK-8檢測結(jié)果Figure 5 The results of CCK-8 assay for MC3T3-E1 cells cultured on two substrates after 1，3 and 6 days

2.6 鈦表面成骨細(xì)胞的ALP活性

微板法檢測兩組試件表面MC3T3-E1 細(xì)胞的ALP活性結(jié)果見圖6A。隨著時(shí)間增加，兩組試件表面成骨細(xì)胞的ALP 活性均有所增加。在兩組試件表面培養(yǎng)成骨細(xì)胞7 d、14 d 后，cp-Ti-col 組的ALP活性均顯著高于cp-Ti 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。染色法檢測兩組試件表面MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性結(jié)果見圖6B。隨著時(shí)間增加，兩組試件表面成骨細(xì)胞的ALP 活性染色均有所增強(qiáng)。在兩組試件表面培養(yǎng)成骨細(xì)胞7 d、14 d 后，cp-Ti-col 組的ALP活性染色均明顯強(qiáng)于cp-Ti組。

圖6 兩組試件表面培養(yǎng)MC3T3-E1 細(xì)胞7 d、14 d 的ALP活性檢測結(jié)果Figure 6 The results of ALP activity assay for MC3T3-E1 cells cultured on two substrates after 7 and 14 days

2.7 鈦表面成骨細(xì)胞的成骨相關(guān)蛋白表達(dá)

兩組試件表面培養(yǎng)MC3T3-E1 成骨細(xì)胞7 d、14 d 后的成骨相關(guān)蛋白表達(dá)見圖7A。相對(duì)于cp-Ti試件，cp-Ti-col 試件表面成骨細(xì)胞的Runx2、OSX、OCN蛋白表達(dá)水平均顯著提高（圖7B、C）。

圖7 兩組試件表面培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞7 d、14 d的成骨相關(guān)蛋白（Runx2、OSX、OCN）表達(dá)Figure 7 Osteogenic-related protein expressions of Runx2，OSX and OCN in MC3T3-E1 cells cultured on two substrates after 7 and 14 days

3 討論

膠原蛋白具有良好的生物相容性和可降解性，可作為天然支架材料而備受關(guān)注。Fang 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，將人牙髓干細(xì)胞接種于Ⅰ型膠原蛋白中，培養(yǎng)一段時(shí)間后出現(xiàn)持續(xù)性骨再生。Prescott 等［16］將人牙髓干細(xì)胞、膠原支架和牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白移植于小鼠皮下，可生成牙髓樣組織。此外，Kim等［17］的研究表明，在膠原、明膠和殼聚糖3種天然支架材料中分別培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞，一定時(shí)間后膠原能更好地促進(jìn)牙髓干細(xì)胞增殖。由此可見，膠原作為一種天然支架材料在組織工程領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。

良好的生物相容性是種植體材料的首要因素。在本研究中，XPS 和FT-IR 檢測發(fā)現(xiàn)鈦表面存在膠原蛋白的特征性氮元素和基團(tuán)，而接觸角測量結(jié)果顯示，膠原蛋白涂層改性鈦表面的水接觸角減小，表現(xiàn)出更好的親水性。材料表面的細(xì)胞黏附是細(xì)胞增殖的前提，而細(xì)胞的早期黏附與材料表面的形貌和基質(zhì)有關(guān)。與此同時(shí)，成骨細(xì)胞的增殖能力決定了細(xì)胞成骨分化的速度和時(shí)間。較之光滑鈦表面，鈦表面復(fù)合膠原蛋白凝膠涂層能促進(jìn)成骨細(xì)胞的黏附和增殖。究其原因，可能是膠原在紫外線和重度脫水條件下發(fā)生交聯(lián)［14］，進(jìn)而為成骨細(xì)胞提供有力的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)其早期黏附，而成骨細(xì)胞黏附后偽足的充分伸展更有利于細(xì)胞增殖。該結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致［5，10］。

鈦表面復(fù)合膠原蛋白凝膠涂層除了為成骨細(xì)胞提供有力的結(jié)合位點(diǎn)外，能夠加速成骨進(jìn)程也至關(guān)重要。隨后，我們針對(duì)兩種鈦表面的成骨細(xì)胞分化進(jìn)行了研究。成骨細(xì)胞在增殖后開始分化，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，基質(zhì)礦化成熟后形成骨組織。在此過程中，ALP活性與成骨細(xì)胞的分化程度密切相關(guān)［18］。在本研究中，膠原蛋白涂層改性鈦表面的成骨細(xì)胞具有更強(qiáng)的ALP活性，因而隨著細(xì)胞黏附定植時(shí)間的延長，表現(xiàn)出更顯著的成骨分化。

Runx2 是骨形成過程中的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在成骨細(xì)胞的早期分化中起促進(jìn)作用［19］。OSX 特異性表達(dá)于發(fā)育的骨組織中，能誘導(dǎo)前成骨細(xì)胞分化為成熟的成骨細(xì)胞［20］。OCN是骨基質(zhì)礦化過程中由成骨細(xì)胞形成的非膠原蛋白，是成骨活動(dòng)和骨轉(zhuǎn)換的重要標(biāo)志。Runx2、OSX和OCN的蛋白表達(dá)水平能夠反映成骨細(xì)胞的分化情況。在本研究中，相對(duì)于光滑鈦表面，膠原蛋白涂層改性鈦表面培養(yǎng)成骨細(xì)胞7 d和14 d后均顯示成骨相關(guān)蛋白（Runx2、OSX和OCN）表達(dá)水平顯著提高，表現(xiàn)出更強(qiáng)的成骨分化能力。該結(jié)果與ALP活性檢測結(jié)果相一致。

膠原蛋白肽鍵之間存在離子鍵、范德華力以及非極性基團(tuán)產(chǎn)生的疏水鍵作用力，在其自組裝形成凝膠到紫外線照射干燥的過程中，通過物理吸附穩(wěn)定存在于鈦表面，進(jìn)而在鈦表面形成膠原蛋白涂層。Hong等［21］研究發(fā)現(xiàn)，在鈣磷涂層表面物理吸附膠原蛋白條件下，MG-63 細(xì)胞的黏附能力無明顯提高，但細(xì)胞增殖和成骨分化能力顯著增強(qiáng)。同時(shí)，對(duì)比分析了物理吸附法和仿生共沉積法固定膠原蛋白對(duì)MG-63 細(xì)胞黏附、增殖和成骨分化的影響，發(fā)現(xiàn)物理吸附法的效果更優(yōu)。本研究將Ⅰ型膠原蛋白經(jīng)恒溫及紫外線照射產(chǎn)生交聯(lián)后物理吸附于鈦表面形成穩(wěn)定涂層，并初步探究其表面的成骨細(xì)胞行為，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白凝膠涂層顯著增強(qiáng)了鈦表面的生物活性，為成骨細(xì)胞提供有力的結(jié)合位點(diǎn)，有利于成骨細(xì)胞的黏附、增殖和成骨分化。該研究結(jié)果可為鈦表面有機(jī)生物涂層改性的進(jìn)一步拓展提供參考依據(jù)。