廖勤儉，趙 東，安明哲，李楊華，喬宗偉，郭 艷，王小琴，周韓玲

(宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007)

丟糟是傳統(tǒng)固態(tài)釀造白酒酒醅蒸酒后丟棄的糟醅，是釀酒的副產(chǎn)物。20 年前，我國白酒年產(chǎn)量就已達(dá)600多萬噸，丟糟年產(chǎn)量高達(dá)1800多萬噸[1]，近年來大多白酒企業(yè)都有擴(kuò)產(chǎn)，丟糟產(chǎn)量也隨之增加。雖然丟糟中尚殘留有不少的營養(yǎng)物質(zhì)，但由于發(fā)酵填充物稻殼質(zhì)量分?jǐn)?shù)占40%～50%，而稻殼主要成分為粗纖維，因此限制了丟糟的回收利用。此外，丟糟中水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在60%左右，貯存困難，易霉變，常常只能作為廢棄物丟掉，既污染環(huán)境，又造成了極大的資源浪費(fèi)。

綠色木霉(Trichoderma viride)通常能產(chǎn)生多種具有生物活性的酶系，是產(chǎn)纖維素酶活性最高的菌株之一，所產(chǎn)生的纖維素酶對(duì)作物有降解作用，國內(nèi)外對(duì)綠色木霉在纖維素降解方面的研究很多[2-6]，同時(shí)綠色木霉又是一種資源豐富的拮抗微生物，在植物病理生物防治中具有重要的作用[7-15]。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，6-戊基-2H-吡喃-2-酮是木霉屬代謝產(chǎn)生的一種抗生素，是起抑菌作用的主要物質(zhì)[18-21]。該物質(zhì)生物活性高,可作為生物抗菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，同時(shí)又具有乳酪、椰香等風(fēng)味，是安全的食品添加劑。

2021 年1 月，百潤(rùn)*天貓*青年志發(fā)布的中國年輕人低度潮飲酒Alco-pop 品類文化白皮書顯示，低度潮飲酒Alco-pop 正在顛覆中國傳統(tǒng)的白酒文化，成為年輕人可以自主掌控的新酒精生活方式。由此，本研究從白酒釀造生產(chǎn)環(huán)境中分離篩選耐乳酸的木霉屬菌株，探討以丟糟為原料發(fā)酵生產(chǎn)6-戊基-2H-吡喃-2-酮的可行性，以提高丟糟的循環(huán)利用價(jià)值，進(jìn)一步探索發(fā)酵產(chǎn)物6-戊基-2H-吡喃-2-酮在低度潮飲酒Alco-pop 方面的應(yīng)用前景，具有一定的環(huán)保效益和經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料及耗材：丟糟，宜賓五糧液股份有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；采集培養(yǎng)基：乳酸濃度20 g/L 的霉菌液體培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；乳酸（88.9%），美國奧泊麗公司；甲醇（LC-MS 級(jí)），德國默克公司。

儀器設(shè)備：電熱壓力滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技儀器有限公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司；美國Agilent 公司1290 高效液相色譜儀(HPLC)-6520B質(zhì)譜檢測(cè)器（Q-TOF）；美國Agilent 公司7890 氣相質(zhì)譜儀（GC-MS）；Agilent MassHunter 數(shù)據(jù)采集工作軟件、定性分析軟件；Milli-Q 超純水機(jī)（美國Mimpore公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 木霉菌株的分離鑒定

1.2.1.1 菌株分離純化

利用重力沉降法，將制備好的采集培養(yǎng)基100 mL，于四川宜賓市五糧液釀酒生產(chǎn)區(qū)敞口放置6 h，無菌紗布封口后于28 ℃下恒溫培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)基中長(zhǎng)出疑是木霉屬絲狀菌體，接種環(huán)挑取菌體于PDA 培養(yǎng)基中，編號(hào)并劃線純化，重復(fù)純化2～3次，直至平板上的菌落都為同一形態(tài)。挑取單菌落制成水浸片，于顯微鏡下觀察菌體細(xì)胞形態(tài)，環(huán)境木霉分離純化完成，斜面試管保存于4 ℃冰箱。

1.2.1.2 菌株的鑒定和歸類

菌株形態(tài)學(xué)鑒定：將經(jīng)活化的木霉屬新菌株用接種環(huán)劃線接種于PDA 培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)特征；挑取菌絲，以乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液進(jìn)行染色制片，于顯微鏡下觀察菌株細(xì)胞特征。

菌株分子生物學(xué)鑒定：取純菌的菌體富集液6000 r/min 離心10 min，棄上清液，采用SK8259 真菌試劑盒提取菌株基因組DNA；選用ITS 通用引物對(duì)正向引物ITS1（tccgtaggtgaacctgcgg）、反向引物ITS4（tcctccgcttattgatatgc），擴(kuò)增基因組DNA，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)入以下循環(huán)：94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物寄送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 菌株乳酸耐受力及最適代謝條件測(cè)定

將適量的無菌水加入已活化的綠色木霉PDA試管斜面培養(yǎng)基中，用無菌接種環(huán)洗脫孢子，制備孢子懸液。PDA 培養(yǎng)基，分裝15 份，各50 mL 于150 mL 三角瓶中，其中10 份加入不同量的乳酸調(diào)節(jié)pH 值，另5 份空白對(duì)照樣加入等量的PDA 培養(yǎng)基補(bǔ)充，自然pH 值；121 ℃滅菌20 min，冷卻，無菌條件下，各接入1 mL綠色木霉菌懸液，10份乳酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基和1份空白對(duì)照培養(yǎng)基于28 ℃恒溫培養(yǎng)，另4 份空白對(duì)照培養(yǎng)基分別放置在24 ℃、26 ℃、30 ℃、32 ℃4 個(gè)不同溫度下恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)15 d后，LC-TOF測(cè)定6-戊基-2H-吡喃-2-酮的產(chǎn)率。

1.2.3 菌株抗菌性測(cè)定

將適量的無菌水加入已活化的黃曲霉（編號(hào)WLY-L-HQM-1，來自于釀酒大曲）試管斜面培養(yǎng)基中，用無菌接種環(huán)洗脫孢子，制備孢子懸液；再將孢子懸液稀釋至適宜梯度，涂布于已滅菌PDA平板培養(yǎng)基上，另空白對(duì)照平板上不涂布黃曲霉菌懸液，在平板培養(yǎng)基中心，用打孔器各接入直徑5 mm 的綠色木霉PDA 平板菌，在28 ℃下恒溫培養(yǎng)3 d，觀察綠色木霉對(duì)黃曲霉的抑制效果。

1.2.4 GC-MS分析條件

色譜條件：色譜柱為HP-5MS 毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：柱初溫40 ℃，保持2 min，以4 ℃/min 升溫至220 ℃，保持15 min；載氣(He)流速1.2 mL/min，2.4 kPa，進(jìn)樣量1μL；分流比：10∶1。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；傳輸線溫度275 ℃；離子源溫度200 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500。

1.2.5 6-戊基-2H-吡喃-2-酮定量檢測(cè)前處理方法

液體樣品：取樣品0.1 mL 于5 mL 離心管中，甲醇逐級(jí)稀釋至原樣的1/100，膜過濾后進(jìn)樣LCQTOF。

固體樣品：稱取樣品10 g 于100 mL 燒杯中，加入30 mL 甲醇超聲提取10 min，甲醇定容至100 mL為提取液，甲醇逐級(jí)稀釋至提取液的1/100，膜過濾后進(jìn)樣LC-QTOF。

1.2.6 LC-QTOF定量分析條件

流動(dòng)相：A 為超純水溶液(含0.5 g/L 甲酸)，B 為甲醇，梯度洗脫為：0～7 min：30%v/v～98%v/v B（儀器自動(dòng)實(shí)現(xiàn)梯度變化）；7.1～12 min：98%v/v B；12.1～14 min：30%v/v B；停止洗脫。色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18柱，柱長(zhǎng)100 mm，內(nèi)徑為2.1 mm，粒徑為1.8 μm，柱溫為30 ℃，流速為0.2 mL/min，進(jìn)樣量為2 μL。

質(zhì)譜條件為：采用電噴霧離子源，負(fù)模式，干燥氣溫度325 ℃，干燥氣流量10 L/min，霧化氣壓力40 psig，毛細(xì)管電壓4000 V，毛細(xì)管出口電壓110 V。

1.2.7 丟糟培養(yǎng)基制備

種子培養(yǎng)基：丟糟∶高粱∶水質(zhì)量比為10∶10∶6，按比例混合均勻，120 ℃高壓滅菌30 min，冷卻后，用接種環(huán)挑取綠色木霉平板菌絲接種到種子培養(yǎng)基，接種量10%，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。

發(fā)酵培養(yǎng)基：（A）純丟糟；(B)高粱粉∶水質(zhì)量比為6∶4；(C)丟糟∶高粱粉∶水質(zhì)量比為7∶2∶1；分別置于5 L 的不銹鋼桶中，混勻，于120 ℃滅菌30 min。滅菌結(jié)束后，取出，倒入已滅菌淺盤中冷卻至30 ℃以下，無菌條件下，各接入種子培養(yǎng)基并混勻，接種量10%，放置于28 ℃下恒溫培養(yǎng)，間歇噴灑無菌水并攪拌。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株純化鑒定結(jié)果

利用高乳酸濃度的PDA 培養(yǎng)基分離純化出1株可培養(yǎng)木霉，在PDA 平板上培養(yǎng)3 d，菌落呈圓形、白色菌絲發(fā)散狀，中心出現(xiàn)綠色孢子，如圖1 所示。染色鏡檢，可見分生孢子梗，分生孢子梗有隔膜，垂直對(duì)稱分枝，產(chǎn)生分生孢子，分生孢子單生或簇生，圓形或卵形，如圖2 所示。根據(jù)菌株的形態(tài)特征，初步判定為木霉。提取菌株基因組DNA，通過真菌通用引物擴(kuò)增ITS 序列，將得到的菌株核糖體DNA（rDNA）的ITS 序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行BLAST 序列比對(duì)，確定為綠色木霉，并命名為WLY-L-M-1。該菌株已于2020 年9 月2 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.20254。

圖1 菌落形態(tài)

圖2 鏡檢細(xì)胞形態(tài)

2.2 菌株產(chǎn)物分析結(jié)果

打孔器取直徑5 mm 的平板菌5 份于頂空瓶中，采用頂空固相微萃取，結(jié)合氣相質(zhì)譜法鑒別分析菌株揮發(fā)性產(chǎn)物。該菌株在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 后，感官嗅覺具有明顯的椰香風(fēng)味，木霉具有產(chǎn)6-戊基-2H-吡喃-2-酮的能力[18-21]，該物質(zhì)是具有乳酪、蘑菇、椰香等風(fēng)味的食品香料。由此利用GC-MS 進(jìn)行菌株揮發(fā)性產(chǎn)物分析，結(jié)果表明，菌株主產(chǎn)物為6-戊基-2H-吡喃-2-酮；副產(chǎn)物主要有3-甲基丁醇、苯乙醇、己醇，都是白酒中存在的風(fēng)味成分，GC-MS總離子流圖如圖3所示。

圖3 GC-MS分析圖

2.3 乳酸對(duì)菌株生長(zhǎng)代謝的影響及最適代謝條件

各發(fā)酵培養(yǎng)基0.1 mL，甲醇稀釋，0.2 μm 膜過濾后作為待測(cè)樣品，進(jìn)樣液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-QTOF），測(cè)定6-戊基-2H-吡喃-2-酮含量。各乳酸-PDA 發(fā)酵培養(yǎng)基，過濾得菌體，菌體烘干稱重，與1 mL 綠色木霉菌懸液烘干重量（初始菌體重量）對(duì)比。表1 所示為乳酸耐受性情況表，大于初始菌體重量則說明菌體生長(zhǎng)，以“√”表示，小于或等于初始菌體重量則說明菌體沒有生長(zhǎng)，以“×”表示。由表1 可看出，該綠色木霉菌株最高耐受乳酸濃度為52.62 g/L，最低耐受pH 值為1.97。但是，隨著乳酸濃度的增高，6-戊基-2H-吡喃-2-酮的產(chǎn)率會(huì)受到影響。5 個(gè)空白PDA 培養(yǎng)液放置在不同溫度下培養(yǎng)15 d，如圖4 所示，當(dāng)培養(yǎng)溫度在26～30 ℃之間時(shí)，6-戊基-2H-吡喃-2--酮產(chǎn)率較高且基本一致，為該菌株的最適培養(yǎng)溫度范圍。

表1 乳酸耐受性

圖4 培養(yǎng)溫度與產(chǎn)率關(guān)系

2.4 綠色木霉菌株對(duì)大曲黃曲霉抑制能力

綠色木霉菌株代謝產(chǎn)物6-戊基-2H-吡喃-2-酮具有植物病毒抗菌性[18-21]，由此針對(duì)釀酒生產(chǎn)用大曲或原輔料中可能污染的黃曲霉，進(jìn)行該菌株的抗菌性實(shí)驗(yàn)，空白對(duì)照平板與黃曲霉涂布平板對(duì)比如圖5 所示。PDA 平板中心綠色木霉圓形發(fā)射狀生長(zhǎng)區(qū)域未見黃曲霉生長(zhǎng)，平板邊緣，未生長(zhǎng)綠色木霉的地方才可見黃曲霉菌落，由此說明，該綠色木霉對(duì)大曲黃曲霉生長(zhǎng)具有一定的抑制能力。

圖5 黃曲霉抑制能力對(duì)照?qǐng)D

2.5 綠色木霉利用丟糟為原料發(fā)酵生產(chǎn)6-戊基-2H-吡喃-2-酮的應(yīng)用

木霉屬具有較強(qiáng)分解纖維素能力，綠色木霉通常能夠產(chǎn)生高度活性的纖維素酶，對(duì)纖維素的分解能力很強(qiáng)；2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該綠色木霉菌株具有高乳酸濃度耐受性，釀酒生產(chǎn)中產(chǎn)生的副產(chǎn)物丟糟中乳酸含量通常在2%左右，低于該菌株的乳酸最高耐受濃度；由此，以丟糟為原料，通過淺盤固態(tài)發(fā)酵法，對(duì)比不同培養(yǎng)基方案（1.2.7）6-戊基-2H-吡喃-2-酮的產(chǎn)率。試驗(yàn)結(jié)果如圖6 所示，該木霉在三組培養(yǎng)基中都能代謝產(chǎn)6-戊基-2H-吡喃-2-酮，發(fā)酵培養(yǎng)15 d，純丟糟培養(yǎng)基A中產(chǎn)率最低，也能達(dá)120 mg/L以上；純高粱培養(yǎng)基B中產(chǎn)率次之；丟糟混合少量高粱的培養(yǎng)基C 產(chǎn)率最高，達(dá)1200 mg/L 以上。培養(yǎng)基C 因丟糟中添加了少量的高粱，補(bǔ)充了碳氮源，同時(shí)丟糟中存在的大量糠殼成分提高了原料的疏松度和透氣性，便于木霉菌絲蔓延生長(zhǎng)，產(chǎn)率更高。

圖6 不同培養(yǎng)基產(chǎn)率對(duì)比圖

2.6 綠色木霉發(fā)酵產(chǎn)物6-戊基-2H-吡喃-2-酮在低度潮飲酒方面的應(yīng)用

取2.5 中培養(yǎng)基C 組發(fā)酵醅與固態(tài)釀酒糟醅以1∶10 比例混合均勻?yàn)樵囼?yàn)糟醅，上10 L 的不銹鋼蒸餾裝置中蒸餾，每100 mL 分段收集餾出液，同時(shí)以純固態(tài)釀酒出窖糟醅作為空白對(duì)照糟醅進(jìn)行蒸餾。利用LC-QTOF檢測(cè)綠色木霉發(fā)酵主產(chǎn)目標(biāo)物6-戊基-2H-吡喃-2-酮，確定目標(biāo)物在蒸餾各段的餾出情況，檢測(cè)結(jié)果表明，試驗(yàn)糟各段餾出液中均有一定量的目標(biāo)物，說明目標(biāo)物易于隨著蒸餾過程餾出。圖7 和圖8 分別為試驗(yàn)樣1#和對(duì)照樣1#的LC-QTOF 檢測(cè)總離子流圖(TIC)和提取離子流圖(EIC)，表2 為專業(yè)品評(píng)組對(duì)試驗(yàn)樣和對(duì)照樣各段餾出液進(jìn)行盲評(píng)后綜合的嘗品記錄結(jié)果，可以看出，各試驗(yàn)樣和對(duì)照樣香氣基本一致，但1#—4#試驗(yàn)樣沒有對(duì)照樣中味不凈的香味缺陷，也沒有明顯的異雜味，優(yōu)于對(duì)照樣；隨著餾出液中乙醇濃度的降低，試驗(yàn)樣中6-戊基-2H-吡喃-2-酮的香味凸顯出來，5#—8#試驗(yàn)樣中逐漸呈現(xiàn)出了乳酪香、椰香風(fēng)味，為具有水果風(fēng)味的低度潮飲酒的開發(fā)提供了可行性。

表2 嘗品記錄表

圖7 試驗(yàn)糟醅TIC和EIC圖

圖8 對(duì)照糟醅TIC和EIC圖

3 結(jié)論

本研究從釀酒生產(chǎn)環(huán)境中篩選到1 株耐乳酸的綠色木霉新菌株，該菌株最高耐受乳酸濃度為52.62 g/L；最低耐受pH 值為1.97；最適代謝溫度為26～30 ℃。經(jīng)GC-MS 對(duì)綠色木霉揮發(fā)性產(chǎn)物分析，該綠色木霉代謝主產(chǎn)物為6-戊基-2H-吡喃-2-酮，代謝副產(chǎn)物主要有3-甲基丁醇、苯乙醇、己醇等香氣成分。針對(duì)釀酒生產(chǎn)環(huán)境存在的潛在生物污染進(jìn)行菌株抗菌性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株具有一定的大曲黃曲霉抑制能力。

分別以純丟糟、純高粱、丟糟和高粱混合物3種培養(yǎng)基進(jìn)行淺盤發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該綠色木霉在3 種原料中都能生長(zhǎng)代謝產(chǎn)6-戊基-2H-吡喃-2-酮，且在丟糟和高粱混合培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)率最高，達(dá)1200 mg/L 以上。該綠色木霉新菌株能有效的利用白酒副產(chǎn)物丟糟為原料代謝生產(chǎn)具有生物活性的風(fēng)味物質(zhì)6-戊基-2H-吡喃-2-酮，提供了一條丟糟循環(huán)利用新途徑，具有很大的經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)保效益。

該木霉丟糟發(fā)酵醅與固態(tài)釀酒發(fā)酵出窖糟醅混蒸試驗(yàn)結(jié)果表明，木霉丟糟發(fā)酵醅的加入，可以適當(dāng)?shù)馗纳普麴s基酒風(fēng)味。木霉發(fā)酵主產(chǎn)物6-戊基-2H-吡喃-2-酮是具有明顯乳酪香、椰香風(fēng)味的安全食品添加劑，該物質(zhì)在高度乙醇體系中風(fēng)味易被掩蓋，在低度乙醇體系中風(fēng)味突出。根據(jù)中國年輕人低度潮飲酒Alco-pop 品類文化白皮書，低度潮飲酒是酒精度15%vol以下、甜味突出的低度酒，是現(xiàn)今年輕人更青睞的具有明顯舒適度的新品類，而新一代年輕人正在成為酒水消費(fèi)的主力軍，由此，將該綠色木霉發(fā)酵產(chǎn)物，通過適當(dāng)?shù)恼麴s方式進(jìn)入基酒，并將此種基酒應(yīng)用于勾調(diào)低度潮飲酒，具有廣闊的探索空間和應(yīng)用前景。