王穎旎，武平，余澤蕓，羅云

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 針灸推拿學(xué)院，成都 610075)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性全身性的自身免疫性疾病，以持續(xù)性關(guān)節(jié)滑膜炎、血管翳形成為典型特征，主要累及小關(guān)節(jié)，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、畸形及功能喪失等，可顯著降低患者的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命[1-2]。RA的確切病因及發(fā)病機(jī)制目前尚不完全清楚，主要認(rèn)為與免疫功能異常、關(guān)節(jié)滑膜增厚、關(guān)節(jié)軟骨和骨破壞等因素有關(guān)，婦女、吸煙者和有該病家族史的人最易受影響[3]。近年來，與RA有關(guān)的骨代謝機(jī)制成為研究的熱點。骨代謝的過程主要由骨形成和骨吸收構(gòu)成，骨代謝動態(tài)平衡是維持骨組織正常功能的重要因素之一，若骨代謝失衡，易造成骨損傷。Wnt信號通路主要分為依賴β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的經(jīng)典信號通路和不依賴β-連環(huán)蛋白的非經(jīng)典信號通路，2種通路相互協(xié)調(diào)，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的動態(tài)平衡，均被認(rèn)為在骨代謝中發(fā)揮重要的作用[4-5]。當(dāng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞平衡被打破時，則易誘發(fā)骨侵蝕和骨破壞，成為RA發(fā)病因素之一。經(jīng)典Wnt信號通路可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞生成，促進(jìn)受損骨關(guān)節(jié)修復(fù)，緩解軟骨損傷和骨侵蝕。在RA骨代謝方面，激活經(jīng)典Wnt信號通路可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化成熟，抑制破骨細(xì)胞活動，從而減少骨質(zhì)破壞[6]。硬化蛋白(sclerostin，SOST)是一種由SOST基因編碼的糖蛋白，主要由礦化基質(zhì)內(nèi)的3種終末分化細(xì)胞(骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞)表達(dá)和分泌[7]。SOST作為Wnt信號通路的內(nèi)源性負(fù)調(diào)節(jié)蛋白日益受到關(guān)注，其可作為調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路的潛在治療靶點。本文將探討Wnt/β-連環(huán)蛋白/SOST在RA發(fā)病機(jī)制中的調(diào)節(jié)作用。

1 Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路

Wnt信號通路由Wnt基因調(diào)控，Wnt基因源于果蠅胚胎中的無翅基因與鼠類乳腺癌病毒的Int-1原癌基因，因兩者具有同源性，故共同命名為Wnt[8-10]。該通路是由10個G蛋白偶聯(lián)受體(G protein coupled receptor，GPCR)同源卷曲蛋白(frizzled，F(xiàn)ZD)受體、3個跨膜酪氨酸激酶(酪氨酸激酶受體、酪氨酸激酶樣孤核受體和酪氨酸激酶7)、肌肉骨骼酪氨酸激酶、共同受體低密度脂蛋白相關(guān)受體蛋白(low density lipoprotein receptor related protein，LRP)5/6和19個糖基蛋白Wnt配體組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)[11]。Wnt信號通路目前包括3種途徑：Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路、Wnt/PCP(JNK)信號通路以及Wnt/Ca2+信號通路[4]。其中，Wnt/PCP(JNK)信號通路和Wnt/Ca2+信號通路為非經(jīng)典通路，分別由Wnt1和Wnt5介導(dǎo)。Wnt/PCP(JNK)信號通路主要參與細(xì)胞骨架組織和上皮細(xì)胞的協(xié)調(diào)極化。Wnt/Ca2+信號通路則參與癌癥、炎癥和神經(jīng)變性，也可促進(jìn)骨形成過程中成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[12]。目前研究最多的是經(jīng)典Wnt信號通路即Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路(圖1)，當(dāng)該通路被激活時，Wnt蛋白與質(zhì)膜上的FZD在胞外區(qū)結(jié)合，再與LRP5/6結(jié)合形成二聚體來啟動Wnt信號通路，激活胞內(nèi)的Dvl，使Axin、APC、CK1、GSK3β的蛋白復(fù)合物聚集，導(dǎo)致β-連環(huán)蛋白去磷酸化，進(jìn)而誘發(fā)其核易位，并激活基因轉(zhuǎn)錄[4]。研究表明，Wnt蛋白能夠與相應(yīng)的細(xì)胞蛋白受體結(jié)合，激活該受體復(fù)合物引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)控癌基因、細(xì)胞周期素D1等靶基因的轉(zhuǎn)錄，影響成骨細(xì)胞的分化與成熟[13-14]。目前，研究證據(jù)顯示，經(jīng)典Wnt信號通路在調(diào)控骨形成過程中發(fā)揮重要作用，激活該通路不僅可以誘導(dǎo)成骨細(xì)胞生成，增加骨量，而且也影響破骨細(xì)胞的生成[15]。

注：Dvl為蓬亂蛋白(dishevelled)；Axin為使軸抑制蛋白(axis inhibitor)；APC為結(jié)腸腺瘤息肉蛋白(adenomatous polyposis coli)；CK1為酪蛋白激酶1(casein kinase 1)；GSK3β為糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β)；TCF為轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor)；LEF為淋巴增強因子(lymphoid enhancer factor)。圖1 Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路示意圖

因此，經(jīng)典Wnt信號通路作為維持關(guān)節(jié)完整性、調(diào)節(jié)骨及軟骨代謝的重要途徑之一，在骨骼和關(guān)節(jié)發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。

2 SOST生物學(xué)特性

SOST是位于人類17q12-q21號染色體上的SOST基因編碼的骨細(xì)胞分泌蛋白，具有190個氨基酸，屬于糖蛋白家族DAN成員。SOST最早是在硬化性骨化病和范布凱綜合征這2種罕見的常染色體隱性遺傳病中被發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)，硬化性骨化病與SOST基因突變相關(guān)，因其過早終止密碼子及剪接位點突變，從而導(dǎo)致SOST水平降低，表現(xiàn)為進(jìn)行性骨過度生長[16]。而所有的范布凱綜合征患者都存在52 kb的非編碼區(qū)域的缺失，該區(qū)域位于SOST基因下游35 kb處，使SOST轉(zhuǎn)錄和蛋白缺失，從而導(dǎo)致硬骨素生成障礙[17-18]。有研究表明，SOST是一種來源于骨細(xì)胞的成骨細(xì)胞抑制因子，在新形成的骨細(xì)胞的初級礦化時或礦化后產(chǎn)生，以限制成骨細(xì)胞的骨形成[19]。因此，SOST作為內(nèi)源性負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，在限制成骨細(xì)胞的骨形成方面起著重要作用。

3 SOST對Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的調(diào)節(jié)機(jī)制

Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路通過調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞活性來控制骨形成，SOST作為該通路的天然抑制因子，對骨形成有重要的調(diào)節(jié)作用[20]。SOST能夠與LRP5/6結(jié)合，阻止Wnt蛋白達(dá)到LRP5/6，從而抑制經(jīng)典Wnt信號通路[21]。此外，SOST也與LRP4結(jié)合，LRP4作為低密度脂蛋白受體家族成員之一，是一種位于神經(jīng)肌肉接點的Agrin受體。與LRP5/6不同的是，SOST與LRP4結(jié)合，能增強其對經(jīng)典Wnt信號通路的抑制作用[22-23]。越來越多的證據(jù)表明，SOST已經(jīng)成為骨骼質(zhì)量的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子。通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，SOST敲除小鼠具有高骨質(zhì)量表型，其特征是骨密度、骨體積、骨形成和骨強度均顯著增加[24]。目前，針對SOST調(diào)節(jié)非經(jīng)典Wnt信號通路的研究甚少，大多是SOST調(diào)節(jié)經(jīng)典Wnt信號通路的研究。因此，把SOST作為治療的靶點，減少SOST的過度表達(dá)，有助于Wnt蛋白與LRP5/6的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控經(jīng)典Wnt信號的傳遞，改善骨骼質(zhì)量。

4 Wnt/SOST對RA的調(diào)控

Wnt/SOST對RA的調(diào)控主要表現(xiàn)在RA骨代謝方面。RA作為一種全身性自身免疫性疾病，其慢性炎癥和骨侵蝕最為常見[25]。在RA關(guān)節(jié)發(fā)炎的微環(huán)境中，成骨細(xì)胞功能受損，破骨細(xì)胞形成導(dǎo)致關(guān)節(jié)骨侵蝕的發(fā)展。炎癥會擾亂骨合成代謝信號的平衡，并對經(jīng)典Wnt信號通路產(chǎn)生影響。在炎癥消退的情況下，會發(fā)生骨形成，導(dǎo)致局灶性關(guān)節(jié)骨丟失的修復(fù)，并伴有經(jīng)典Wnt信號通路的改變[26]。Wnt/β-連環(huán)蛋白通路的下游靶因子——骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)是非常強大的生長因子，可通過刺激成骨細(xì)胞分化和軟骨細(xì)胞分化來誘導(dǎo)骨和軟骨形成。SOST通過結(jié)合BMP，阻斷BMP蛋白與其Ⅰ型和Ⅱ型受體結(jié)合， 從而阻斷BMP信號通路，抑制骨形成。也有研究發(fā)現(xiàn)，SOST通過旁分泌和自分泌途徑拮抗Wnt信號，并選擇性拮抗BMP信號，從而發(fā)揮其強大的骨分解代謝作用[27]。故BMP和經(jīng)典Wnt信號通路是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和功能的重要途徑[28]。但由于SOST與成熟的BMP結(jié)合微弱，所以目前認(rèn)為，SOST可通過直接阻斷經(jīng)典Wnt信號通路介導(dǎo)對骨形成的抑制作用。當(dāng)該通路被激活時，Wnt信號通路負(fù)調(diào)節(jié)蛋白SOST不僅可以抑制該途徑，而且可以調(diào)節(jié)RA的侵蝕過程[26]。

因此，經(jīng)典Wnt信號通路是RA骨質(zhì)代謝環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵通路之一，尤其是在骨形成和骨吸收中發(fā)揮重要作用。

4.1 Wnt/SOST對RA成骨細(xì)胞的調(diào)控在RA中，骨丟失不僅以局部為表現(xiàn)，而且會出現(xiàn)相應(yīng)的全身癥狀。在骨丟失過程中滑膜產(chǎn)生促炎因子，既可促進(jìn)骨吸收，也可刺激經(jīng)典Wnt信號通路產(chǎn)生可溶性負(fù)調(diào)節(jié)蛋白SOST，抑制成骨細(xì)胞增殖、成熟和分化[29]。成骨細(xì)胞被激活后，形成一個由Wnt蛋白與FZD及LRP5/6結(jié)合的復(fù)合物(Wnt-FZD-LRP5/6)，而SOST能夠阻止此復(fù)合物的形成，使其分解成碎片[30]。當(dāng)經(jīng)典Wnt信號通路負(fù)調(diào)節(jié)蛋白SOST的表達(dá)增強時，可與LRP5/6結(jié)合，抑制該通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制成骨細(xì)胞活性，促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡。由此可見，RA中骨代謝的失衡可能是由于SOST與LRP5/6結(jié)合，對Wnt信號通路產(chǎn)生拮抗作用而造成的。

另外，在范布凱綜合征患者中未發(fā)現(xiàn)SOST基因突變，但在SOST下游35 kb處發(fā)現(xiàn)了一個52 kb的缺失，這導(dǎo)致了SOST表達(dá)的缺失[17-18]，進(jìn)一步說明SOST在調(diào)節(jié)骨形成中具有關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠模型中，過度表達(dá)SOST可導(dǎo)致骨密度降低[31]，與人類的SOST失活類似，定向敲除SOST基因的小鼠可以增加整個骨骼的骨密度[32]，降低并指的發(fā)生率。有研究通過Micro CT分析得出，雄性和雌性SOST敲除小鼠的骨小梁體積和股骨遠(yuǎn)端骨小梁厚度均增加了近1倍，SOST敲除小鼠具有高骨質(zhì)量表型，其特征是骨密度、骨體積、骨形成和骨強度均顯著增加[24]。這些來自SOST敲除小鼠的數(shù)據(jù)也證實了SOST作為骨形成抑制劑在骨形成中發(fā)揮了重要作用。

因此，SOST作為Wnt信號通路內(nèi)源性負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，決定了骨形成的正常程度，從而保護(hù)骨骼免受失控生長的不良影響。其表達(dá)增加可促使成骨細(xì)胞凋亡，抑制骨形成，這可能是RA成骨細(xì)胞活性受抑制的主要機(jī)制。

4.2 Wnt/SOST對RA破骨細(xì)胞的調(diào)控破骨細(xì)胞是來自單核細(xì)胞譜系的巨大多核細(xì)胞，是體內(nèi)唯一具有骨吸收活性的細(xì)胞[33]。在RA中，骨細(xì)胞數(shù)量和活性的增加會導(dǎo)致骨侵蝕，從而使關(guān)節(jié)功能喪失并產(chǎn)生疼痛。Stolina等[34]在動物研究和人體試驗中發(fā)現(xiàn)，作為SOST抗體的硬化素單克隆抗體(sclerostin antibody，Scl-Ab)增加了骨形成，減少了骨吸收標(biāo)志物，表明骨獲得是增強骨形成和減少骨吸收共同作用的結(jié)果，這可能與降低SOST的過度表達(dá)有關(guān)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，與幼齡小鼠相比，從老齡小鼠骨髓中提取的破骨細(xì)胞培養(yǎng)物可產(chǎn)生更高水平的SOST，表明破骨細(xì)胞衍生的SOST可能有助于減少隨年齡增長而產(chǎn)生的骨形成[35]。而經(jīng)典Wnt信號通路是通過直接作用于破骨細(xì)胞前體抑制破骨細(xì)胞形成的，隨著細(xì)胞中β-連環(huán)蛋白的減少，破骨細(xì)胞數(shù)量增加和吸收增強，表明SOST可直接作用于破骨細(xì)胞的分化[36]。同時，在骨細(xì)胞中SOST的過表達(dá)加劇了DMP1-8 kb-caPTHR1小鼠的皮質(zhì)內(nèi)重構(gòu)和破骨細(xì)胞的增加[37]，這種增強的骨吸收在雙轉(zhuǎn)基因DMP1-8 kb-caPTHR1/DMP1-SOST小鼠中伴隨著骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)表達(dá)的顯著下降。OPG是一種分泌型細(xì)胞因子，可通過競爭性結(jié)合核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)抑制破骨細(xì)胞的分化、成熟及骨吸收，最終加速骨質(zhì)破壞。Spencer等[38]也發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路可促進(jìn)OPG分泌，抑制成骨細(xì)胞中RANKL的表達(dá)，從而抑制骨吸收。

因此，SOST作為一種關(guān)鍵的內(nèi)源性負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，可直接作用于破骨細(xì)胞的分化、成熟及骨吸收，影響Wnt信號通路。

Wnt/SOST對RA調(diào)控的研究表明，SOST是骨骼內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵因子，是骨骼在機(jī)械載荷作用下合成代謝反應(yīng)的必需物質(zhì)，在成熟的成骨細(xì)胞中，失活的Wnt信號通路會降低OPG，并增加破骨細(xì)胞分化和骨吸收。相反，激活Wnt信號通路會增加OPG的表達(dá)，減少骨吸收[39-40]。SOST主要通過作用于破骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞來解偶聯(lián)骨形成和骨吸收。目前研究表明，Scl-Ab可增加骨密度并降低骨質(zhì)疏松患者的骨折發(fā)生率，增加骨膜和骨內(nèi)膜的面積，逆轉(zhuǎn)系統(tǒng)性和局部的骨質(zhì)丟失，促進(jìn)骨折愈合[41-42]。Chen等[43]在人腫瘤壞死因子轉(zhuǎn)基因(hTNFtg)小鼠中發(fā)現(xiàn)，Scl-Ab雖然不能阻斷關(guān)節(jié)炎進(jìn)展，但可阻斷關(guān)節(jié)炎周圍的骨量丟失，誘導(dǎo)全身骨和軟骨修復(fù)。此外，在hTNFtg小鼠中，Scl-Ab完全阻止了骨侵蝕的進(jìn)展，并且聯(lián)合TNF抑制劑可使皮質(zhì)骨侵蝕顯著消退。由此可以得出，Scl-Ab可以增加骨量和骨修復(fù)，是促進(jìn)炎癥性關(guān)節(jié)炎骨修復(fù)的有力工具。因SOST主要在骨骼中表達(dá)，從而使Scl-Ab這種特殊的藥物制劑具有很高的骨細(xì)胞靶向性，Scl-Ab的應(yīng)用可能會通過降低SOST的過度表達(dá)，調(diào)節(jié)SOST對Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的抑制作用，減少RA患者關(guān)節(jié)的骨質(zhì)破壞，延緩病情進(jìn)展。

綜上所述，在RA病程進(jìn)展中，骨形成和骨吸收需保持相應(yīng)的動態(tài)平衡才能延緩關(guān)節(jié)損傷。而SOST作為Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的內(nèi)源性負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，通過抑制成骨細(xì)胞活性，使骨形成減少，并通過誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化，使骨吸收加強。其表達(dá)的下調(diào)，對延緩骨代謝疾病的發(fā)生、發(fā)展有著積極作用。因此，對內(nèi)源性負(fù)調(diào)節(jié)蛋白SOST的研究有助于為臨床治療RA提供新的思路。