王艷麗，張會敏，李安軍*，孟雅靜，劉國英，王錄，丁峰，周慶伍，梁金輝

（1.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州 236820）（2.安徽省固態(tài)發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，安徽亳州 236820）

濃香型白酒的生產(chǎn)是在窖池中進行的固態(tài)發(fā)酵，酒醅是濃香型白酒發(fā)酵的主體，發(fā)酵過程中微生物代謝形成的水、醇、酸、酯、糖等各種成分互溶形成液態(tài)黃水[1,2]。黃水作為濃香型白酒發(fā)酵過程中唯一的液態(tài)相，其中充滿了各種營養(yǎng)物質(zhì)，其為濃香型白酒發(fā)酵過程中包括酒醅菌群和黃水菌群之外的窖泥菌群生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。窖泥被公認是在濃香型白酒發(fā)酵過程中的厭氧菌群釋放源[3-5]，另一方面，由窖泥菌群產(chǎn)生的代謝物質(zhì)反過來又豐富了酒醅中的風(fēng)味物質(zhì)[4]。實際上，一些窖泥源的菌屬確實被發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵過程中遷移到底層酒醅中，也就是黃水所在的位置[4]。隨著發(fā)酵的進行，窖泥與黃水共有的菌屬豐度呈現(xiàn)遞增趨勢[6]，比如黃水中的Caproiciproducens，Sedimentibacter和古菌被認為隨著窖齡增大而增加[1,2,7]；而實際上，以上3 種菌屬在窖泥中的豐度也隨著窖齡增大而增加[8]?？芍S水菌群與窖泥菌群是相互影響，相互促進的。

由窖泥“退化”所引起的釀酒質(zhì)量下降是釀酒界所關(guān)心的問題。與正常窖泥相比，“退化”窖泥的pH 值偏低，菌群組成以乳酸桿菌為主[5]，而且經(jīng)常出現(xiàn)白色團塊析出[5]，甚至鈣化板結(jié)的現(xiàn)象[9]。王艷麗等[10]也證實“退化”窖泥中鈣元素含量顯著較高。有研究證實窖泥的白色團塊主要為乳酸鈣[11]。張會敏等[12]通過分析分層池底窖泥中的鈣元素證實窖泥中白色團塊析出與窖泥中乳酸與碳酸鈣之間的反應(yīng)有密切關(guān)系。仲幾曉等[13]通過乳酸強化實驗證實乳酸的額外加入導(dǎo)致窖泥中灰白色團塊析出，進一步證實其中乳酸與碳酸鈣的反應(yīng)對窖泥“退化”的影響。濃香型白酒發(fā)酵過程中，乳酸含量高達60.00～80.00 g/L 的黃水對窖泥具有重要影響，其影響分別表現(xiàn)在兩者菌群和理化指標(biāo)的相互影響上[14]。因此，有必要深入分析“退化”窖池中，黃水菌群和黃水理化性質(zhì)的變化規(guī)律，為深入分析“退化”窖泥的變化提供理論依據(jù)。

基于此，本研究選擇新、老窖池黃水為研究對象，分別向其加入適量和過量碳酸鈣粉末，模擬新老窖池黃水中發(fā)生的碳酸鈣與乳酸之間的反應(yīng)，研究靜置培養(yǎng)過程中黃水理化性質(zhì)和菌群組成的變化。為分析窖泥“退化”過程中黃水菌群變化和理化性質(zhì)變化對窖泥的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃水樣本采自安徽知名某濃香型白酒企業(yè)；Omega D5625 土壤DNA 提取試劑盒Omega bio-tek 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 6890 氣相色譜儀（配CP-WAX 57 CB 色譜柱50 m×0.25 mm×0.2 μm），美國Agilent 公司；Acquity UPLC 液相色譜（配PDA 二極管陣列檢測器和 Waters HSS T3 色譜柱100 mm×2.1 mm×1.8 μm），美國 Waters 公司；ICS5000+離子色譜儀（配ICS-5000+-DC 電導(dǎo)檢測器），ThermoFisher 公司；紫外可見分光光度計（TU-1810S），北京普析通用分析儀器有限公司；高速冷凍離心機，德國賽多利斯公司；PCR 儀，美國Thermo 公司；MiSeq-PE-250 高通量測序儀，美國Illumina 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集與試驗方法

選取連續(xù)正常使用、發(fā)酵工藝相同的新窖池（窖齡6 年）和老窖池（窖齡大于50 年）各3 個，于發(fā)酵結(jié)束時分別抽取新鮮黃水。取新鮮新窖池、老窖池黃水分別加入適量（質(zhì)量體積比，1.50 g/100 mL，即加入的碳酸鈣粉末完全溶于黃水）和過量（質(zhì)量體積比，3.00 g/100 mL，即加入的碳酸鈣粉末部分溶于黃水，有沉淀）的碳酸鈣粉末，然后進行封閉靜置培養(yǎng)，并于培養(yǎng)3 天（3 d）、1 周（1 W）、2 周（2 W）、3 周（3 W）、4 周（4 W）、6 周（6 W）和2 個月（2 M），檢測黃水發(fā)酵液理化性質(zhì)，每樣本三個重復(fù)，共84 個樣本。于培養(yǎng)1 W～2 M 時，檢測黃水發(fā)酵液菌群多樣性，每樣本三個重復(fù)，共72 個樣本。

黃水培養(yǎng)過程中樣本的標(biāo)記以黃水窖齡和碳酸鈣粉末量組合標(biāo)記，其中用YHS 和OHS 分別表示新窖池黃水和老窖池黃水，用_MO 和_EX 分別表示加入適量和過量碳酸鈣粉末。如需標(biāo)記發(fā)酵時間，則在黃水發(fā)酵液的編號后面標(biāo)記具體培養(yǎng)時間如：_3 d、_1 W或_2 M 等。編號YHS_MO_1 W 為新窖池黃水加適量碳酸鈣粉末后培養(yǎng)1 周的發(fā)酵液。

1.3.2 理化性質(zhì)分析

pH 值檢測使用pH 計（FE20）直接測量。銨態(tài)氮檢測采用紫外分光光度計法[15]。淀粉和還原糖測定采用反滴定法[14]。乳酸和Ca2+濃度測定，將黃水樣本與去離子水按1:9 體積比混勻，過0.22 μm 濾膜得待測濾液，然后用液相色譜檢測乳酸含量[14]，用離子色譜檢測Ca2+濃度[8]；己酸、丁酸和乙酸測定，將黃水樣本與15%甲醇溶液按照1:9 體積比混勻，過0.22 μm濾膜得待測濾液，然后用氣相色譜檢測[16]。

1.3.3 DNA 提取與Illumina 高通量測序使用Omega 土壤DNA 試劑盒（D5625）提取黃水菌群的DNA。由上海派森諾生物科技股份有限公司進行Illumina MiSeq 高通量測序16S V4 可變區(qū)，擴增引物、擴增體系與擴增程序參考[14]。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后，Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 熒光定量，構(gòu)建克隆文庫（TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit，Illumina），經(jīng)Agilent 2100 Bioanlyzer 檢驗DNA文庫合格后，Illumina MiSeq 雙向測序（MiSeq Reagent Kit V3）。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計學(xué)分析

運用QIIME（v1.8.0）識別疑問序列。要求序列長度≥160 bp，且不允許存在模糊堿基N，并剔除：（1）5’端引物錯配堿基數(shù)>1 的序列；（2）含有連續(xù)相同堿基數(shù)>8 的序列。然后，通過QIIME 軟件（v1.8.0）調(diào)用USEARCH（v5.2.236）檢查并剔除嵌合體序列，利用FLASH（v1.2.7）軟件，對通過質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)重疊堿基進行配對連接。調(diào)用UCLUST，對獲得的優(yōu)質(zhì)序列按97%的序列相似度進行OTU 劃分，并選取OTU 中豐度最高的序列作為代表序列。采用Silva 數(shù)據(jù)庫（Release132）注釋各代表序列，作為代表OTU 的注釋結(jié)果。去除豐度值低于全體樣本測序總量0.001%的OTU，并根據(jù)OTU 豐度矩陣，使用QIIME（v1.8.0）軟件計算Shannon、Chao1 等菌群多樣性參數(shù)。差異顯著性分析通過SPSS（25.0）方差分析（ANOVA）實現(xiàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 理化性質(zhì)

黃水中本身富含豐富的淀粉、還原糖、銨態(tài)氮、有機酸及各種離子等。而在加入適量或過量碳酸鈣粉末后進行靜置培養(yǎng)過程中，伴隨著其中微生物的生長代謝，理化性質(zhì)也發(fā)生變化。

2.1.1 pH 值

pH 值變化規(guī)律如圖1 所示。pH 值呈現(xiàn)增加（3 d～4 W，4.27～4.58→4.94～5.29）后降低（4 W～2 M，4.94～5.29 →4.01～4.59）趨勢。培養(yǎng)3 d～3 W，pH 值無顯著變化（p?0.05）；培養(yǎng)4 W 時，pH 值呈現(xiàn)最高值（4.94、5.00、5.13 和5.29），推測可能到第4 W 時碳酸鈣與乳酸等有機酸的反應(yīng)達到最高點，酸性降到最低值；培養(yǎng)6 W～2 M，加入適量碳酸鈣粉末的兩組樣本pH值顯著降低，2 M 時呈現(xiàn)最低值（4.02、4.03），而加入過量碳酸鈣粉末兩組樣本的pH 值恢復(fù)至前3 W 水平（4.43、4.59），推測可能與碳酸鈣粉末反應(yīng)殆盡，黃水菌群代謝生成更多乳酸有關(guān)。加適量與過量碳酸鈣黃水相比，后者pH 值相對更高，3 d～4 W 時（4.27～4.39→4.94～5.00 vs 4.51～4.58→5.12～5.29）無顯著差異，6 W～2 M（4.16～4.23→4.01～4.03 vs 4.56～4.57→4.43～4.59）呈顯著差異（p<0.05）。此外，新、老窖池黃水相比，pH 值無顯著差異（p?0.05）。表明加適量或加過量碳酸鈣對新老窖池黃水pH 值在短時間（3 d～4 W）內(nèi)有調(diào)節(jié)作用，但經(jīng)過長時間培養(yǎng)后，調(diào)節(jié)能力減弱，pH 值仍會降低，甚至低于培養(yǎng)第3 d 的黃水pH 值（YHS_MO 和OHS_MO）。這與胡曉龍[17]研究發(fā)現(xiàn)與正常窖泥相比，退化后窖泥pH 值（6.18 vs 4.57）顯著降低，結(jié)論一致。而且黃水加碳酸鈣經(jīng)過2 個月培養(yǎng)其pH 值（4.01～4.59）與已知退化窖泥的pH 值（4.10～5.60）基本一致[18]。

圖1 4 組黃水樣本在2 個月培養(yǎng)過程中pH 值變化 Fig.1 The pH values change of 4 groups of HS samples during two-month culturing (means ± standard deviation,n=3)

2.1.2 淀粉與還原糖

淀粉（圖2a）與還原糖（圖2b）變化規(guī)律如圖2所示。淀粉（1.23～1.57 g/100 mL→0.64～0.84 g/100 mL）與還原糖（0.38～0.58%→0.16～0.21%）均呈波動減少趨勢。推測與黃水菌群代謝淀粉和還原糖有關(guān)。已知曲霉屬、毛霉和根霉等絲狀真菌具有分解淀粉生成還原糖的功能[19]，而黃水中富含一定量的曲霉屬[1]。此外黃水中的其他細菌如Lactobacillus、Clostridium和Acinetobacter等以及真菌如Pichia等[20]，具有把還原糖轉(zhuǎn)化為如乳酸[19]、乙酸和酒精等[21]的功能。加適量與加過量碳酸鈣黃水相比，淀粉和還原糖在各時間段的含量基本一致。新、老窖池黃水相比，淀粉與還原糖平均含量均基本相當(dāng)，推測與培養(yǎng)過程中新老窖池黃水中優(yōu)勢菌屬的相對豐度基本相當(dāng)有關(guān)。而培養(yǎng)第3 d 老窖池黃水中淀粉（1.23～1.25 g/100 mL vs 1.46～1.57 g/100 mL）和還原糖（0.38～0.39% vs 0.53～0.58%）顯著更低（p<0.05）。可能與老窖池黃水中固有好氧細菌和真菌（霉菌屬和酵母菌屬）相對豐度更高[1]，且在培養(yǎng)初期，黃水中含一定量的氧，利于好氧細菌和真菌的生長，因此會呈現(xiàn)暫時的淀粉和還原糖消耗更多，含量偏低。張會敏等[14]直接對黃水進行靜置培養(yǎng)5 個月后，其中的淀粉（1.6～1.7%→ 0.88～1.02%）和還原糖（0.59～0.60%→0.27～0.34%）降低，與本結(jié)論一致。表明加碳酸鈣對黃水培養(yǎng)過程中優(yōu)勢菌屬的基本代謝無明顯影響。且與黃水直接培養(yǎng)相比，黃水加碳酸鈣經(jīng)2 個月培養(yǎng)淀粉和還原糖消耗更多。說明黃水加碳酸鈣培養(yǎng)可能在一定時間內(nèi)使菌群生長更旺盛。

圖2 4 組黃水樣本在2 個月培養(yǎng)過程中淀粉與還原糖含量變化 Fig.2 The starch and reducing sugar change of 4 groups of HS samples during two-month culturing

2.1.3 鈣離子

Ca2+濃度的變化規(guī)律如圖3 所示。新老窖池黃水Ca2+濃度均有增加（4.83～6.32 g/L→5.54～8.89 g/L），推測與黃水中有機酸尤其是乳酸與碳酸鈣反應(yīng)生成易溶于水的乳酸鈣，已知乳酸鈣的溶解度超過20 g/L[22]。但加適量碳酸鈣的兩組黃水中Ca2+濃度呈現(xiàn)增加（3 d～1 W，4.83～5.06 g/L→5.31～5.86 g/L），然后基本穩(wěn)定（2 W～2 M，5.75～5.94 g/L→5.53～5.89 g/L）的趨勢；而加過量碳酸鈣的兩組黃水中Ca2+濃度呈穩(wěn)定增加（3 d～2 M，5.20～6.33 g/L→8.73～8.89 g/L）趨勢。推測加適量碳酸鈣的黃水在培養(yǎng)3 W時碳酸鈣可能基本被有機酸反應(yīng)完全，而加過量碳酸鈣的黃水中碳酸鈣與乳酸反應(yīng)仍在繼續(xù)進行有關(guān)。新老窖池黃水相比，Ca2+濃度基本相當(dāng)。表明碳酸鈣對新老窖池黃水中Ca2+濃度增加有促進作用，且加入的碳酸鈣含量越高，Ca2+濃度增加越顯著。王艷麗等[10]研究發(fā)現(xiàn)與正常窖泥相比，退化窖泥的鈣含量（0.82% vs 1.37%）顯著增加，與本研究結(jié)論一致。間接表明退化窖泥鈣離子增加與黃水和鈣鹽的酸解反應(yīng)有關(guān)。

圖3 4 組黃水樣本在2 個月培養(yǎng)過程中Ca2+濃度的變化 Fig.3 The Ca2+ change of 4 groups of HS samples during two-month culturing

2.1.4 銨態(tài)氮

銨態(tài)氮變化規(guī)律如圖4 所示。銨態(tài)氮呈波動增加趨勢（1.28～1.69 g/L→1.53～2.18 g/L），其中新老窖池黃水（1.20～1.35 g/L→1.53～1.57 g/L vs 1.61～1.69 g/L→2.13～2.18 g/L）相比，后者銨態(tài)氮含量顯著更高（p<0.05）。推測與黃水加碳酸鈣培養(yǎng)后pH 值升高至4.02～5.29，更接近產(chǎn)銨態(tài)氮菌屬的最適pH值范圍[23,24]，促進了產(chǎn)銨態(tài)氮菌屬的生長，從而使銨態(tài)氮含量升高。而老窖池黃水菌群組成[2]更豐富，可能更利于銨態(tài)氮的生成。加適量與加過量碳酸鈣黃水相比，銨態(tài)氮含量無顯著差異（p?0.05）。胡曉龍[17]研究發(fā)現(xiàn)與正常窖泥（269.2 mg/kg）相比，退化后窖泥銨態(tài)氮含量（249.88 mg/kg）顯著降低，與本研究結(jié)論相反。可能與兩者菌群代謝有關(guān)，具體結(jié)合菌群組成進一步分析。

圖4 4 組黃水樣本在2 個月培養(yǎng)過程中銨態(tài)氮含量變化 Fig.4 The ammonium nitrogen change of 4 groups of HS samples during two-month culturing

2.1.5 乳酸、丁酸、己酸和乙酸

乳酸（圖5a）、丁酸（圖5b）、己酸（圖5c）和乙酸（圖5d）變化規(guī)律如圖5 所示。乳酸呈現(xiàn)降低（3 d～1 W，62.21～64.57 g/L→54.67～57.74 g/L），再增加（1 W～2 W，54.67～57.74 g/L→64.78～69.86 g/L），再趨于穩(wěn)定（2 W～6 W，64.78～69.86 g/L→66.71～68.10 g/L），然后再增加的趨勢（6 W～2 M，66.71～68.10 g/L→67.93～75.30 g/L）。己酸和丁酸均呈現(xiàn)基本穩(wěn)定（3 d～4 W）、再增加（4 W～6 W），然后再降低（6 W～2 M）的變化趨勢。其中培養(yǎng)2 M 時，己酸恢復(fù)到第3 d水平，丁酸則更低甚至低于第3 d 水平。乙酸（4.74～5.45 g/L→5.74～9.61 g/L）呈持續(xù)增加趨勢。而加適量與加過量碳酸鈣黃水相比，其中乳酸、丁酸、己酸和乙酸差異基本不明顯，但培養(yǎng)6 W 的樣本OHS_Ex 除外。此外，新老窖池黃水相比，乳酸、丁酸和己酸差異基本不顯著，而乙酸在老窖池黃水中顯著更高（p<0.05）。表明加適量和加過量碳酸鈣對新老窖池黃水的乳酸、丁酸、己酸和乙酸含量雖有波動影響，但最終于培養(yǎng)2 個月乳酸、乙酸增加，丁酸降低，己酸恢復(fù)至第3 d 水平。推測與培養(yǎng)前期碳酸鈣與黃水中有機酸發(fā)生中和反應(yīng)[25]，導(dǎo)致有機酸減少，而隨培養(yǎng)過程中黃水菌群代謝的影響，有機酸出現(xiàn)升降變化[26]。說明碳酸鈣不利于新老窖池黃水中己酸和丁酸的生成，反而利于乳酸和乙酸的產(chǎn)生。余有貴等[27]研究發(fā)現(xiàn)退化窖池與常規(guī)窖池所產(chǎn)新酒相比，己酸乙酯和丁酸乙酯極顯著降低，乳酸乙酯和乙酸乙酯極顯著增加，說明退化窖池不利于己酸和丁酸積累，而利于乳酸和乙酸積累，與本研究結(jié)論一致。

圖5 4 組黃水樣本在2 個月培養(yǎng)過程中有機酸含量變化 Fig.5 The organic acids change of 4 groups of HS samples during two-month culturing

綜上，黃水加碳酸鈣經(jīng)過2 個月培養(yǎng)，最終理化性質(zhì)pH 值、淀粉、還原糖、己酸和丁酸降低，銨態(tài)氮、鈣離子、乳酸和乙酸增加。與已知窖泥退化過程中理化性質(zhì)變化規(guī)律基本一致，表明窖泥的“退化”與其中鈣鹽和黃水的作用有關(guān)。

2.2 原核微生物菌群的α-多樣性

原核菌群的多樣性變化規(guī)律如表1～表3 所示：四組黃水中原核菌群的OTUs（125～169→83～90）、Chao1（133.08～174.44→88.08～95.52 ）和 Shannon（1.43～2.24→0.57～0.83）變化趨勢基本一致，整體上呈減少趨勢。而且無論是加適量與過量碳酸鈣黃水相比，還是新老窖池黃水相比，OTUs 和Chao1 指數(shù)均無顯著差異（p?0.05），而Shannon 指數(shù)呈現(xiàn)無規(guī)律差異變化。推測加入碳酸鈣后，黃水中形成過高的Ca2+濃度，不利于細菌的生長[28]，致使黃水原核菌群多樣性降低。其中，培養(yǎng)4 W 的黃水中OTUs 和Chao1 指數(shù)較前一周略高，可能與第4 W 時黃水的pH 值（4.94～5.29）出現(xiàn)短暫升高（圖1），對菌群生長有暫時的促進作用。表明碳酸鈣的加入對新老窖池黃水菌群的生長產(chǎn)生了不利影響，致使菌群豐富度和多樣性均降低了。這與Hu[5]研究與正常窖泥相比，退化窖泥的OTUs、Chao1 和Shannon 指數(shù)顯著降低，結(jié)論一致。說明退化窖泥的菌群多樣性降低與退化過程中黃水的影響有關(guān)。

表1 4 組黃水樣本在2 個月培養(yǎng)過程中原核微生物群落OTUs Table 1 The prokaryotic community OTUs of 4 groups of HS samples during two-month culturing (ˉ,n=3,except sample OHS_Ex_1W,n=1)

表1 4 組黃水樣本在2 個月培養(yǎng)過程中原核微生物群落OTUs Table 1 The prokaryotic community OTUs of 4 groups of HS samples during two-month culturing (ˉ,n=3,except sample OHS_Ex_1W,n=1)

注：同行無連續(xù)肩標(biāo)小寫字母表示差異顯著（p<0.05）；同列無連續(xù)肩標(biāo)大寫字母表示差異顯著（p<0.05）。樣本OHS_Ex 在培養(yǎng)1 W 時只有一組樣本檢測到原核微生物菌群，無法與其他三組參數(shù)進行顯著性差異分析。表2 和表3 同。

表2 4 組黃水樣本在2 個月培養(yǎng)過程中原核微生物群落Chao1 指數(shù) Table 2 The prokaryotic community Chao1 index of 4 groups of HS samples during two-month culturing (ˉ,n=3,except sample OHS_Ex_1W,n=1)

表2 4 組黃水樣本在2 個月培養(yǎng)過程中原核微生物群落Chao1 指數(shù) Table 2 The prokaryotic community Chao1 index of 4 groups of HS samples during two-month culturing (ˉ,n=3,except sample OHS_Ex_1W,n=1)

表3 4 組黃水樣本在2 個月培養(yǎng)過程中原核微生物群落Shannon 指數(shù) Table 3 The prokaryotic community Shannon index of 4 groups of HS samples during two-month culturing (ˉ,n=3,except sample OHS_Ex_1W,n=1)

表3 4 組黃水樣本在2 個月培養(yǎng)過程中原核微生物群落Shannon 指數(shù) Table 3 The prokaryotic community Shannon index of 4 groups of HS samples during two-month culturing (ˉ,n=3,except sample OHS_Ex_1W,n=1)

2.3 原核微生物菌群的β-多樣性

對OTU 注釋，共得到12 個門，其中11 個細菌門，1 個古菌門。將相對豐度超過0.1%的門定義為優(yōu)勢菌門，共得到10 個優(yōu)勢菌門，如圖6 所示。黃水加碳酸鈣培養(yǎng)過程中厚壁菌門（Firmicutes）為絕對優(yōu)勢菌門，相對豐度占94.77%～100%，甚至3 W～2 M，F(xiàn)irmicutes 為唯一優(yōu)勢菌門（99.86%～100%）。而且無論是加適量與加過量碳酸鈣黃水相比，還是新、老窖池黃水相比，其中優(yōu)勢菌門組成均一致，以Firmicutes為絕對優(yōu)勢，其中培養(yǎng)1 W 時的優(yōu)勢菌門組成除外。推測與Firmicutes在極端條件下環(huán)境適應(yīng)性較強有關(guān)，比如其中的Bacillus、Clostridium和Lactobacillus等[29]，在極端條件下均具有較強耐性。此外，除Firmicutes之外的非優(yōu)勢菌門以及未知菌/未可培養(yǎng)菌，只有在第1 W 呈現(xiàn)較大優(yōu)勢，與張會敏等[14]研究新老窖池黃水經(jīng)過5 個月培養(yǎng)，優(yōu)勢菌門數(shù)目增加，非優(yōu)勢菌門轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢菌門，F(xiàn)irmicutes 相對豐度降低，結(jié)論相反。表明加碳酸鈣不利于黃水中除Firmicutes 之外的其他菌門的生長。

圖6 4 組黃水樣本在2 個月培養(yǎng)過程中10 個優(yōu)勢菌門的相對豐度 Fig.6 Relative abundance of the 12 dominant phyla in 4 groups of HS samples during two-month culturing

對OUT 注釋，共得到9 個屬。將相對豐度超過0.1%的屬定義為優(yōu)勢菌屬，共得到4 個優(yōu)勢菌屬，如圖7 所示。其中Lactobacillus為絕對優(yōu)勢菌屬，相對豐度占94.48%～99.99%。培養(yǎng)第1 W，樣本YHS_Mo、YHS_Ex 和OHS_Mo 中優(yōu)勢菌屬除Lactobacillus（99.04%、98.51%和94.48%）外，還有蒼白桿菌屬（Ochrobactrum，0.11%、0.23%和0.24%）、Pelomonas（0.1%、0.14%和0.26%）和不動桿菌屬（Acinetobacter，0.14%、0.19%和0.16%）；樣本OHS_Ex 中Lactobacillus（99.73%）為唯一優(yōu)勢菌屬。培養(yǎng)2 W～2 M，Lactobacillus始終為唯一優(yōu)勢菌屬（99.65%～99.99%）。而且無論是加適量與過量碳酸鈣黃水相比，還是新、老窖池黃水相比，其中優(yōu)勢菌屬組成均一致，以Lactobacillus為絕對優(yōu)勢。這與張會敏等[14]直接對新老窖池黃水進行靜置培養(yǎng)5 個月，Lactobacillus相對豐度降低，而菌屬Acinetobacter、Thermoflavimicrobium、Bacillus、Ochrobactrum、Stenotrophomonas、Caproiciproducens、Aminobacterium、Methanoculleus、Syntrophomonas和Ruminiclostridium等相對豐度增加，結(jié)論相反。進一步表明黃水加碳酸鈣培養(yǎng)，不利于其中包括未知菌屬在內(nèi)的菌屬的生長繁殖。

圖7 4 組黃水樣本在2 個月培養(yǎng)過程中4 個優(yōu)勢屬的相對豐度 Fig.7 Relative abundance of the 4 genera in 4 groups of HS during two-month culturing

黃水在培養(yǎng)過程中，菌群組成與理化性質(zhì)相互適應(yīng)，相互影響。推測黃水加碳酸鈣經(jīng)培養(yǎng)菌群組成變化可能與理化性質(zhì)變化有關(guān)。（1）pH 值升高至4.02～5.29（圖1），與已知Lactobacillus的最適pH 值范圍4.0～5.3[30,31]基本一致。（2）乳酸減少（圖5a），降低了對Lactobacillus的反饋抑制作用[32]。（3）Ca2+濃度增加（圖3），袁亮[28]研究證實Ca2+濃度超過150 mmol/L（即6 g/L）時，細菌幾乎不生長；但閆穎娟等[33]證實在培養(yǎng)基中添加適量碳酸鈣可以促進Lactobacillus的生長；甚至黃翔等[34]發(fā)現(xiàn)復(fù)合乳酸菌利用以碳酸鈣為主要原料的蛋殼制備乳酸鈣，產(chǎn)量高達40 g/L 以上，說明該條件下Ca2+濃度（約7.34 g/L）不影響Lactobacillus的生長。此外，Lactobacillus本身在黃水中的相對豐度較大（?95%）[14]，占據(jù)絕對優(yōu)勢，而且Lactobacillus生長代謝可產(chǎn)生抑菌素能抑制Clostridium、Bacillus等多種菌屬的生長繁殖[35]。因此，黃水中添加碳酸鈣培養(yǎng)，不利于除Lactobacillus外其他菌屬的生長。這與胡曉龍等[5,17]研究發(fā)現(xiàn)“退化”窖泥相比正常窖泥，菌群組成相對更單一，Lactobacillus相對豐度顯著增加，成為絕對優(yōu)勢菌屬（91.46%），結(jié)論基本一致。進一步說明退化窖泥菌群組成的變化與退化過程中黃水影響有關(guān)。

值得討論的一點是，新老窖池黃水加碳酸鈣經(jīng)培養(yǎng)銨態(tài)氮含量增加（圖2），結(jié)合圖7 分析可知，代謝產(chǎn)銨態(tài)氮的相關(guān)菌屬不僅沒有增加，反而未被檢出，而且隨培養(yǎng)時間延長，Lactobacillus很快成為唯一優(yōu)勢菌屬，說明本研究黃水中銨態(tài)氮含量增加與Lactobacillus的生長代謝有關(guān)，有研究證實[36]銨態(tài)氮生成的主要途徑是氨基酸代謝，而Lactobacillus可以合成氨基酸代謝的關(guān)鍵酶-谷氨酰胺合成酶（GS），因此黃水加碳酸鈣培養(yǎng)后，隨Lactobacillus的生長代謝，銨態(tài)氮含量增加，并且乙酸含量增加（圖5），對Lactobacillus胞內(nèi)銨濃度有促進作用。同時Lactobacillus通過氨基酸代謝實現(xiàn)銨離子和氨基酸的相互轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)細胞內(nèi)環(huán)境，增強Lactobacillus耐酸性[37]，說明銨態(tài)氮增加反過來也助于Lactobacillus生長。而退化窖泥中銨態(tài)氮含量則是降低的，推測與窖泥退化后出現(xiàn)板結(jié)，阻礙了窖泥營養(yǎng)源-黃水無法滲入，導(dǎo)致其中氮源供應(yīng)減少，而銨作為微生物利用氮源的關(guān)鍵中間體，轉(zhuǎn)化減弱。因此，黃水加碳酸鈣經(jīng)培養(yǎng)銨態(tài)氮含量增加，而窖泥退化后銨態(tài)氮含量降低。

3 結(jié)論

以新老窖池黃水為研究對象，分析了其在分別加入適量和過量碳酸鈣粉末培養(yǎng)過程中理化性質(zhì)與菌群組成的變化規(guī)律，結(jié)果表明：

（1）黃水加碳酸鈣經(jīng)過2 個月培養(yǎng)，pH 值（4.20～4.60→5.00～5.30→4.00～4.50）、丁酸和己酸先增后降，淀粉和還原糖持續(xù)降低，Ca2+濃度（4.82～6.32 g/L→5.53～8.89 g/L）、銨態(tài)氮（1.28～1.69 g/L→1.53～ 2.18 g/L）和乙酸（4.74～5.44 g/L→5.74～9.61 g/L）呈增加趨勢，乳酸先降后增（62.21～64.57 g/L→54.67～ 57.74 g/L→67.89～75.30 g/L）。且加適量與加過量碳酸鈣黃水相比，后者pH 值和Ca2+濃度相對更高。而新、老窖池黃水相比，銨態(tài)氮和乙酸在老窖池黃水中顯著更高。

（2）黃水加碳酸鈣培養(yǎng)使菌群組成趨于單一。其中菌群多樣性參數(shù)OTUs、Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)顯著降低。并于培養(yǎng)3 W 時Firmicutes（94.77%→ 100.00%）成為唯一優(yōu)勢菌門，于培養(yǎng)2 W 時Lactobacillus（94.48%→99.99%）成為唯一優(yōu)勢菌屬，而其它優(yōu)勢菌屬及未知菌屬趨于消亡（5.52%降至接近于0）。而且不管是加適量或加過量碳酸鈣黃水，還是新老黃水，黃水菌群的多樣性參數(shù)、優(yōu)勢菌門及優(yōu)勢菌屬均無顯著差異。

綜上，黃水加入碳酸鈣培養(yǎng)其理化性質(zhì)更加有利于Lactobacillus占優(yōu)勢，而抑制了其它菌屬的生長。與已知退化窖泥的理化性質(zhì)和菌群組成變化一致，表明退化窖泥的理化性質(zhì)和菌群組成與退化過程中黃水的影響有關(guān)。本研究為窖泥退化過程中Lactobacillus占優(yōu)勢現(xiàn)象提供了部分理論依據(jù)。