曾樹宏，陸為民

（南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

胃癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴重危害著人類健康。隨著社會發(fā)展、醫(yī)學進步以及早癌篩查的推廣，胃癌的發(fā)病率有所下降，但其總體發(fā)病率仍高居全球第三位，病死率居第四位［1-2］。目前胃癌的主要治療手段仍以早期根治性手術(shù)、晚期全身化療為主。有氧糖酵解，即Warburg 效應，是腫瘤細胞的特征性代謝方式，與三羧酸循環(huán)相比，糖酵解步驟少，產(chǎn)生ATP 效率低速率高，可以迅速滿足腫瘤細胞瘋狂增殖的能量需求；通過將大部分碳流由供能轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣缮锎蠓肿?，可以維持腫瘤細胞持續(xù)增殖生長所需的物質(zhì)儲備，這使腫瘤細胞攝取葡萄糖和谷氨酰胺的速率是正常細胞的200 倍以上［3-5］。

木犀草素（Luteolin）是一種天然黃酮類化合物，木犀草素及其衍生物抗腫瘤研究主要聚焦于誘導凋亡、阻滯細胞，周期、抗血管生成等［6］。近期PALOMBO R等研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素衍生物LUT-7-G 對HKⅡ有特異性抑制作用，導致有氧糖酵解作用下調(diào)，顯示木犀草素衍生物在腫瘤能量代謝方面具有治療潛力［7］。本研究擬通過體外實驗研究木犀草素對胃癌AGS 細胞的凋亡誘導作用，通過有氧糖酵解途徑探討其可能作用機制，為木犀草素應用于胃癌治療或協(xié)同增效提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞

胃癌AGS 細胞系為江蘇省中醫(yī)院中心實驗室常規(guī)培養(yǎng)。來源于中國科學院細胞庫（上海），為中分化原位胃腺癌細胞。

1.2 木犀草素

木犀草素（純度＞99%）購自南京道斯夫生物，采用二甲基亞砜（DMSO）作為溶劑，配制為160 mol/L溶液。

1.3 試劑

乳酸（LD）試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；葡萄糖測定試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；CCK-8（APExBio）；二甲基亞砜（APExBio）；Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；β-肌動蛋白（β-actin）；己糖激酶Ⅱ（HKⅡ）；丙酮酸激酶同工酶M2（PKM2）；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1）；半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）；半胱氨酸蛋白酶3 剪切體（Cleaved Caspase-3）；鼠、兔二抗（武漢塞維爾生物科技）。

1.4 儀器

CO2培養(yǎng)箱（HERA cell 1501 型）；生物安全柜（1300A2 型）；倒置相差顯微鏡（CKX51 型）；多功能酶標儀（ELx800 型）；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀（北京六一）；凝膠成像儀（CHEMIDOC XRS+）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

胃癌AGS 細胞復蘇后，使用含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2及完全飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中。當細胞在培養(yǎng)皿中逐漸長至致密單層時，將細胞進行傳代。

2.2 IC50測定

取對數(shù)生長期細胞，細胞計數(shù)調(diào)整濃度為（2～3）×104/mL，輕輕混勻，96 孔板每孔加入180 μL，待測細胞密度約為3 600～5 400/孔（邊緣孔用無菌PBS 填充）；將接種好的細胞培養(yǎng)96 孔板放入CO2細胞培養(yǎng)箱，至細胞單層鋪滿孔底（通常過夜）。將20 μL不同濃度木犀草素培養(yǎng)基溶液加入孔內(nèi)（稀釋倍率以DMSO含量1/1 000 以下為標準）。5%CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)細胞，觀察鏡下藥物作用效果。棄含藥培養(yǎng)基，每孔加入100 μL CCK8 工作液，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h。在酶標儀OD 490 nm 處檢測各孔的吸光值，收集數(shù)據(jù)，進行分析，繪制量效曲線。

2.3 葡萄糖濃度測定

取對數(shù)生長期細胞培養(yǎng)基，1 000 rpm 離心5 min后，取上清待測；加入測定試劑，在酶標儀OD 570 nm處檢測各孔的吸光值，用空白管調(diào)零，測定各管的吸光光度值（標準品理論濃度為5.55 mmol/L）；葡萄糖消耗量及消耗率按照公式計算。

2.4 乳酸濃度測定

配置酶工作液：試劑一（酶稀釋液）和試劑二（酶儲備液）按100∶1 體積比混合，現(xiàn)配現(xiàn)用（2～8 ℃，24 h 內(nèi)有效）。配置顯色劑：試劑四粉末1 支倒入1 瓶試劑三液體中，待粉末全部溶解，移入離心管中充分顛倒混勻，再重新移入瓶中，反復2～3 次，使二者充分混合（2～8 ℃避光保存，2 周有效），按照下面的次序依次配入。

①空白管：雙蒸水20 μL + 酶工作液1 mL + 顯色劑200 μL；②標準管：不同濃度的標準品20 μL（依次稀釋為1、2、3、4、5、6 mmol/L）+酶工作液1 mL+顯色劑200 μL；③測定管：待測樣品20 μL + 酶工作液1 mL+顯色劑200 μL。

混勻，37 ℃水浴精準反應10 min 后，每管加入終止液2 mL。在酶標儀OD 570 nm 處檢測各孔的吸光值，用空白管調(diào)零，測定各管的吸光光度值。計算各管乳酸濃度。

2.5 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測相關蛋白表達

取對數(shù)生長期的胃癌AGS 細胞，調(diào)整細胞密度為1 × 105/mL，接種于6 孔板中，組別設置及加藥情況同上，培養(yǎng)48 h，棄舊培養(yǎng)基，PBS 清洗，每皿加RIPA 裂解液100 μL，充分混勻裂解，吸取總蛋白勻漿，超聲裂解后，4 ℃，12 000 rpm 離心20 min，收集上清，BCA 法測定總蛋白濃度，計算上樣量。將提取的蛋白樣品與5 × SDS 蛋白上樣緩沖液按4∶1 體積比混勻，99 ℃煮蛋白10 min，按計算的上樣量，加入合適濃度的SDS-PAGE 膠中進行電泳分離。電泳完畢后切膠轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜完成后，5%奶粉封閉1 h，分別加 入 相 應 一 抗（β-actin、HK Ⅱ、PKM2、GLUT1、Caspase-3、Cleaved Caspase-3），4 ℃孵 育 過 夜，TBST 洗膜4 次，每次10 min，加入相應種屬來源的二抗中，常溫緩慢搖床60 min。二抗取出后，TBST 洗膜4 次，每次10 min，ECL 特超敏液顯影曝光檢測蛋白表達情況。

2.6 統(tǒng)計學處理

Western Blot 采用Image Lab 軟件分析灰度值，數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 軟件分析；數(shù)據(jù)采用均數(shù)± 標準差（±s）表示，滿足正態(tài)分布和方差齊性的多組之間均數(shù)比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD 法；方差不齊者采用Dunnetts'T3 檢驗。P≤0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 木犀草素對胃癌AGS細胞系的體外抑制作用

觀察木犀草素對胃癌AGS 細胞體外抑制作用并進行檢測分析，計算木犀草素對胃癌AGS 細胞的IC50值為55.64 μmol/L，因此確定后續(xù)實驗木犀草素低、中、高濃度分別為20、40、80 μmol/L。結(jié)果表明，木犀草素對胃癌AGS 細胞的增殖具有明顯抑制效果。見表1和圖1。

表1 木犀草素干預后各濃度胃癌AGS細胞存活率（±s）

表1 木犀草素干預后各濃度胃癌AGS細胞存活率（±s）

濃度（μmol/L）1.25 2.5 5 10 20 40 80 160細胞存活率（%）102.47±2.05 103.47±1.49 101.40±1.59 98.10±0.87 84.64±1.04 67.19±4.03 31.81±1.72 12.90±0.50

圖1 木犀草素干預后胃癌AGS細胞存活率

3.2 木犀草素誘導胃癌AGS細胞凋亡

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，在AGS 細胞系中，20、40 μmol/L 與空白對照組相比，無明顯統(tǒng)計學意義，劑量升至80 μmol/L 時，凋亡率為（49.74±3.09）%，具有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。見表2和圖2。

圖2 木犀草素干預后各組胃癌AGS細胞的流式細胞雙參數(shù)散點圖

表2 木犀草素干預后各組胃癌AGS細胞凋亡率（±s）

表2 木犀草素干預后各組胃癌AGS細胞凋亡率（±s）

注：與0 μmol/L比較，****P ＜0.000 1。

濃度（μmol/L）0 20 40 80凋亡率（%）6.53±1.30 10.39±0.89 11.38±1.06 49.74±3.09****

3.3 木犀草素對胃癌AGS 細胞有氧糖酵解水平的影響

通過對培養(yǎng)基中葡萄糖、乳酸濃度進行測定，計算葡萄糖消耗率及乳酸產(chǎn)量，對木犀草素對胃癌AGS 細胞的有氧糖酵解水平進行評估。結(jié)果顯示，隨著木犀草素濃度增大，葡萄糖消耗率不斷減少，乳酸產(chǎn)量也不斷減少（P＜0.01）。見表3。

表3 木犀草素干預后各組細胞葡萄糖消耗率及乳酸產(chǎn)量（%）

3.4 木犀草素對各組細胞相關蛋白表達量的影響

為進一步揭示木犀草素對胃癌細胞的促凋亡影響，本研究對凋亡相關蛋白Caspase-3，Cleaved Caspase-3進行檢測，結(jié)果表明，隨著木犀草素濃度增大，Caspase-3 表達越來越低，Cleaved Caspase-3 表達越來越高，其促凋亡作用越明顯（P＜0.05）。隨著木犀草素濃度升高，HKⅡ、PKM2、GLUT1 表達越來越低，呈現(xiàn)濃度依賴性（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.000 1）。結(jié)果見圖3和表4。

表4 木犀草素干預后各組細胞相關蛋白相對表達量（±s）

表4 木犀草素干預后各組細胞相關蛋白相對表達量（±s）

注：與0 μmol/L比較，**P ＜0.01，***P ＜0.001，****P ＜0.000 1。

濃度（μmol/L）0 20 40 80 Caspase-3/Cleaved Caspase-3 1.00±0.01 0.73±0.08***0.43±0.04****0.06±0.02****HKⅡ/β-actin 1.00±0.02 0.96±0.03 0.93±0.02 0.78±0.05**PKM2/β-actin 1.00±0.04 0.93±0.05 0.65±0.09***0.34±0.05****GLUT1/β-actin 1.00±0.03 0.82±0.06***0.41±0.07****0.21±0.04****

圖3 木犀草素干預后各組細胞相關蛋白表達量

4 討論

細胞代謝是一切生命體生存的基礎，細胞從環(huán)境獲取營養(yǎng)物質(zhì)，通過一系列的反應，將營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化為支持細胞各種功能的代謝產(chǎn)物。在正常氧條件下，正常細胞主要通過線粒體氧化磷酸化（OXPHOS）的三羧酸循環(huán)（TCA cycle）產(chǎn)生ATP；而腫瘤細胞即使氧氣充足的情況下，也依賴糖酵解產(chǎn)生ATP來提供能量，大部分的碳鏈用于合成生物大分子，以維持腫瘤細胞高速增殖速率［8］。

腫瘤細胞特征性的有氧糖酵解現(xiàn)象，即為“Warburg現(xiàn)象”，由Otto Warburg首次提出［9］。動物細胞在正常情況下，對血液中葡萄糖的攝取受到嚴格的控制。各類生長因子，比如胰島素（Insulin）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和表皮生長因子（EGF），是指導細胞攝取葡萄糖的主要信號；與受生長因子調(diào)控的增殖的正常細胞不同的是，大多數(shù)腫瘤細胞為了補償糖酵解這種低效的產(chǎn)能方式，通過基因的突變激活自主攝取葡萄糖的能力，從而使獲得的葡萄糖比它們自身氧化代謝所需的葡萄糖多得多，因此腫瘤是一種消耗性疾?。?0-12］。本研究中，實驗證實木犀草素可誘導胃癌AGS 細胞凋亡，其凋亡機制可能與木犀草素下調(diào)有氧糖酵解途徑有關。