張立軍，賈建忠，張新玥，張轉(zhuǎn)平*，譚華森，徐桂新，李小安，劉家佳

1陜西省安康市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，安康 725000；2北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 100029；3陜西省食品藥品研究院，西安 710061

隨著大眾保健意識的日益增強(qiáng)，人們對保健品需求與日俱增，特別是標(biāo)注中藥類的保健品。保健品是保健食品的通俗說法，在國外稱為膳食補(bǔ)充劑(dietary supplements)不屬于藥品范疇，具有調(diào)節(jié)人體機(jī)能，用于特定人群食用，但不以治療疾病為目的[1]。面對高額利潤誘惑，不法商販在保健品中超劑量添加價(jià)格低廉、副作用明顯的化學(xué)原料藥增強(qiáng)產(chǎn)品功效，很大程度上擾亂了我國保健品市場，給國民身體健康造成了嚴(yán)重威脅，如2009年發(fā)生在新疆地區(qū)輔助降糖保健品“糖脂寧膠囊”中超劑量添加違禁化藥格列本脲致多人死亡、2014發(fā)生在山西省“纖纖減肥膠囊”因添加違禁化藥西布曲明及西地那非致使多人出現(xiàn)不良反應(yīng)甚至喪命、近些年來在保健品抽檢評價(jià)中發(fā)現(xiàn)不法廠家在性保健品及中藥保健制劑中添加超劑量的西地那非欺騙消費(fèi)者，嚴(yán)重危害了消費(fèi)者的健康[2,3]；類似在性保健、降糖及減肥類保健品中超劑量添加違禁化藥那非類、雙胍類、呋塞米及酚酞等現(xiàn)象層出不窮，添加隱蔽性越來越高[4,5]；在國外此類現(xiàn)象也時(shí)常發(fā)生[6]。這些影響面廣、危害大的違法行為值得藥監(jiān)部門深思，開發(fā)市場快速抽檢檢測方法顯得尤為重要。

目前用于中成藥和保健品中非法添加化藥的檢測方法主要包括薄層色譜(thin layer chromatography，TLC)[7]、高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS)[9]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography mass spectrometry，GC-MS)[10]、離子遷移譜(ion mobility spectrometry，IMS)及拉曼光譜(raman spectrometry，RS)[11]等。在已報(bào)道的各種檢測方法中，LC-MS、GC-MS及IMS等技術(shù)研究相對較多，但由于儀器價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜，不易推廣，在經(jīng)濟(jì)發(fā)展相對落后的城市山區(qū)很難普及。TLC 為傳統(tǒng)藥品四大鑒別之一，具有快速、簡便、分離效果好的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于藥品定性定量鑒別中，但缺點(diǎn)是必須要有相應(yīng)對照品或?qū)φ账幉腫12,13]。近紅外光譜(near infrared spectroscopy，NIRS)是近幾年發(fā)展起來的，是以采集被檢測物質(zhì)在近紅外譜區(qū)C-H、O-H、S-H、N-H、C=C及C=O等基團(tuán)振動、轉(zhuǎn)動吸收信息用于物質(zhì)定性和定量分析，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、石油、化工、煙草及食品中，目前已被逐步應(yīng)用于制藥與藥監(jiān)行業(yè)，在藥品快速定性定量檢測分析方面具有很大的發(fā)展?jié)摿14,15]。因此，本文預(yù)采用現(xiàn)有普及強(qiáng)的儀器與檢驗(yàn)方法創(chuàng)建TLC-NIRS聯(lián)用技術(shù)，以性保健品為例，建立一種通用性強(qiáng)的非法添加違禁性保健類化學(xué)藥物定性定量檢測模型，可以高效、快速、簡便的用于市場保健品中添加違禁化學(xué)藥物篩查與檢測，降低檢測成本。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

傅里葉變換Tensor 37 NIR光譜儀(德國BRUKER公司)，OPUS 5.0分析軟件； LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)，LC Solution色譜工作站；BS224S電子分析天平(德國Sartorius公司)；硅膠GF254薄層板(青島海洋生物化工有限公司)。

1.2 試藥

西地那非(510068-201401，99.9%)、那紅地那非(520039-201902，96.5%)均購于中國食品藥品研究院，結(jié)構(gòu)見圖1。甲醇為色譜純，水為超純水，三氯甲烷、磷酸及氨水均為分析純。保健樣品為市場抽檢樣品。

圖1 性保健類化學(xué)藥物的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of sex-enhancing chemical drugs

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液與樣品溶液制備

對照品溶液制備：分別取西地那非、那紅地那非約25 mg，精密稱定，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解配制成各約5 mg/mL的混合對照品儲備溶液；再分別取西地那非、那紅地那非約5 mg，精密稱定，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解配制成各約1 mg/mL的單個(gè)指認(rèn)對照品溶液。

樣品溶液制備：分別取本品一次服用量，置5 mL量瓶中，加甲醇超聲30 min(100 W，56 kHz)，冷卻，加甲醇定容至刻度，過濾取續(xù)濾液。含量測定時(shí)，分別精密量取各樣品溶液1 mL用流動相溶解定容至25 mL，用0.45 μm濾膜濾過。由于陽性樣品(檢出添加違禁化學(xué)藥物的保健品)中檢出的各組成分質(zhì)量濃度差異較大，可適當(dāng)增加取樣量或者適當(dāng)稀釋樣液，使其最終質(zhì)量濃度在線性范圍內(nèi)。

陽性樣品溶液制備：由于那紅地那非未抽到陽性樣品，故取空白樣品(黃精巴戟天膠囊，洛陽康體生物，檢測結(jié)果為陰性)一次服用劑量，加入適當(dāng)稀釋的那紅地那非對照品溶液，按樣品溶液項(xiàng)下制備方法制備陽性樣品溶液，使陽性樣品溶液中那紅地那非的質(zhì)量濃度分別約為5、7.5、10 mg/mL，每個(gè)質(zhì)量濃度分別平行制備4、3、3份。

2.2 色譜條件與光譜條件

2.2.1 HPLC色譜條件

采用Phenomenex ODS C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；45%甲醇(A)-55%的0.3%磷酸水溶液(B)為流動相洗脫30 min；流速1 mL/min，檢測波長290 nm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 TLC色譜條件

采用硅膠GF254薄層色譜板，以三氯甲烷-甲醇-氨水(10∶1∶0.1)為展開劑展開、揮干，干燥器干燥1 h后，254 nm紫外燈下檢視標(biāo)記(見圖2)。

圖2 性保健品TLC色譜圖Fig.2 The TLC of sex-enhancing products注：1.那紅地那非；2.西地那非；3～12.樣品溶液。Note:1.Noracetildenafil;2.Sildenafil;3-12.Sample solution.

2.2.3 NIRS采集條件

采用BRUKER NIR固體光纖探頭測量，波數(shù)范圍12 000～4 000 cm-1，掃描次數(shù)64次，分辨率為16 cm-1，溫度10～30 ℃，濕度35%±5%，以空白硅膠GF254薄層板作為參比，扣除背景采集光譜圖，每個(gè)化學(xué)成分斑點(diǎn)平行測定5次，保存NIRS信息。

2.3 HPLC含量測定方法建立

2.3.1 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品儲備溶液(西地那非5.25 mg/mL；那紅地那非5.15 mg/mL)2.0 mL加甲醇定容至10 mL，再分別精吸取0.25、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，用流動相溶解分別定容至5 mL，搖勻。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定峰面積，以各成分峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)計(jì)算回歸線方程：西地那非為Y=3×106X-36 606，r=0.998 9，線性范圍0.052 5～1.05 μg；那紅地那非為Y=1×106X-3 184.4，r=0.999 9，線性范圍0.051 5～1.03 μg，結(jié)果表明上述對照品在各自線性范圍內(nèi)具有良好的線性。

2.3.2 精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及回收率試驗(yàn)

分別取“2.3.1”項(xiàng)下混合對照品溶液以及取空白樣品(黃精巴戟天膠囊，洛陽康體生物，檢測結(jié)果為陰性)按“2.1”項(xiàng)下方法平行制備6份含西地那非和那紅地那非的樣品溶液。按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件，精密度取混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次；穩(wěn)定性取其中一份制備樣品溶液分別于0、3、6、9、12、24 h進(jìn)樣；重復(fù)性與回收率取6份平行制備樣品溶液，每份進(jìn)樣一次，分別測定西地那非、那紅地那非的峰面積，計(jì)算回收率及其RSD值。結(jié)果西地那非和那紅地那非的平均回收率分別為100.16%、100.49%；RSD值均小于3%(n=6)，表明儀器的精密度良好、樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定、該法具有較好的回收率及良好重復(fù)性。

2.3.3 含量測定

精密吸取各樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，每批測定3次，記錄峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果顯示，在10批性保健樣品中，9批檢出添加了違禁化學(xué)藥物西地那非，添加劑量差異很大，檢出率90%，結(jié)果見表1和見圖3。

表1 10種性保健品中非法添加化學(xué)藥物的檢測結(jié)果(n=3)Table 1 Determination results of substances illegally added in 10 sex-enhancing products (n=3)

圖3 10種性保健品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC of 10 sex-enhancing products注：A.混合對照品；B.空白(S0)與樣品(S1～S10)。Note:A.Mixed reference substances;B.Blank(S0)and samples (S1-S10).

2.4 性保健類化學(xué)藥物TLC-NIRS定性模型建立

2.4.1 圖譜信息采集

按“2.2.3”項(xiàng)下條件分別采集TLC薄層板上展開后經(jīng)指認(rèn)的對照品斑點(diǎn)NIRS?；旌蠈φ掌啡芤狐c(diǎn)樣體積分別為1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μL，樣品溶液點(diǎn)樣體積分別為2、5、10 μL，混合對照品和樣品不同點(diǎn)樣體積下的每個(gè)對照品斑點(diǎn)分別采集5次，NIRS疊加圖見圖4。實(shí)驗(yàn)中選取混合對照品不同點(diǎn)樣體積下的光譜圖作為校正集，樣品不同點(diǎn)樣體積下光譜圖作為驗(yàn)證集，保證驗(yàn)證集圖譜信息處于校正集圖譜信息范圍之內(nèi)。

圖4 化學(xué)藥物的NIR原始光譜疊加圖Fig.4 Original NIR spectra of chemical drugs注：A.西地那非；B.那紅地那非；C.空白硅膠。Note:A.Sildenafil;B.Noracetildenafil;C.Blank silica gel.

2.4.2 模型建立

研究采用NIR光譜儀自帶的OPUS軟件對每個(gè)對照品光譜進(jìn)行預(yù)處理。由于化學(xué)成分光譜信息受到外界噪聲、基線漂移、光散射、背景信號及溫濕度等影響，因此研究采用多散射校正(multiplication signal correction，MSC)、矢量歸一化法(vector normalization，VN)、最小最大歸一化(minimum maximum normalization，MMN)、消除常數(shù)偏移量(constant offset elimination，COE)、一階導(dǎo)數(shù)(first derivative，F(xiàn)D)、二階導(dǎo)數(shù)(second derivative，SD)及平滑點(diǎn)數(shù)(smoothing points，SP，平滑點(diǎn)數(shù)5、7、9、13、17、21、25)的過濾組合法處理光譜中存在的無用信息，提高模型判別準(zhǔn)確度，以校正集樣品判錯數(shù)為指標(biāo)(見表2)。

表2 光譜預(yù)處理結(jié)果Table 2 Results of spectral pretreatment

在原始光譜預(yù)處理基礎(chǔ)上，使用光標(biāo)交互式選擇差別較大的譜區(qū)范圍；采用標(biāo)準(zhǔn)算法-歐氏距離(standard，STD)與因子化法-因子數(shù)目(factorization，F(xiàn)C)計(jì)算分析方法；設(shè)置閾值(0.25)與置信水平(95%～99.999 9%)，結(jié)合OPUS軟件優(yōu)化及交互式手動優(yōu)化，綜合考慮選擇最佳建模譜區(qū)及計(jì)算方法，以100%識別結(jié)果為考察指標(biāo)，最終保證所有樣品均被唯一被識別“uniquely identified”(見表3)。

表3 優(yōu)選模型數(shù)據(jù)Table 3 Optimization model of data

2.4.3 模型驗(yàn)證

為檢測定性模型的預(yù)測性能，對建立的定性模型進(jìn)行內(nèi)部驗(yàn)證和外部驗(yàn)證，內(nèi)部驗(yàn)證采用校正光譜對所建模型進(jìn)行評價(jià)驗(yàn)證。外部驗(yàn)證采用建模外的10批樣品進(jìn)行外部驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果顯示，西地那非與那紅地那非的內(nèi)部驗(yàn)證及10批樣品外部驗(yàn)證準(zhǔn)確度均為100%，表明所建立的TLC-NIRS定性模型可以用于性保健品中添加上述違禁化學(xué)藥物的快速檢查。

2.5 性保健類化學(xué)藥物TLC-NIRS定量模型建立

2.5.1 精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性試驗(yàn)

取“2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，平行點(diǎn)樣6份，點(diǎn)樣體積5 μL，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件展開、揮干。干燥后，按“2.2.3”項(xiàng)下條件分別采集TLC上西地那非及那紅地那非對照品斑點(diǎn)NIRS，精密度試驗(yàn)分別連續(xù)采集6次；重復(fù)性試驗(yàn)每個(gè)斑點(diǎn)分別采集1次；穩(wěn)定性試驗(yàn)每隔2 h分別采集一次，得各自NIRS，對所得譜圖進(jìn)行相似度比較。結(jié)果其相似度值均大于95.00%，說明儀器精密性的良好、對照品斑點(diǎn)在24 h內(nèi)具有較好的穩(wěn)定性、該法具有良好的重復(fù)性。

2.5.2 最低識別濃度

取“2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液，進(jìn)行系列稀釋。點(diǎn)樣體積5 μL，按“2.2.2”項(xiàng)下色譜條件展開、揮干。干燥后，按“2.2.3”項(xiàng)下條件分別采集TLC上各個(gè)對照品斑點(diǎn)光譜圖，記錄其NIRS圖譜。采用主成分分析法(principal components analysis，PCA)分別對每個(gè)對照品光譜進(jìn)行聚類分析，統(tǒng)計(jì)對照品不同濃度間差異情況，按馬氏距離大于3.0的濃度判定為最低識別濃度。同時(shí)對每個(gè)對照品最低識別濃度NIRS進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示相似度均低于50.00%。分別得到西地那非、那紅地那非對照品的最低識別濃度為0.525、0.515 μg/μL。不同點(diǎn)樣濃度對TLC-NIRS的影響(見圖5)。

圖5 西地那非與那紅地那非濃度對其TLC-NIRS的影響Fig.5 Influence of different concentration of sildenafil and noracetildenafil on the TLC-NIRS注：A.Sildenafil：a.0.525 μg/μL、b.1.050 μg/μL、c.2.625 μg/μL、d.5.250 μg/μL、e.10.50 μg/μL、f.26.25 μg/μL；B.Noracetildenafil：a.0.515 μg/μL、b.1.030 μg/μL、c.2.575 μg/μL、d.5.150 μg/μL、e.25.75 μg/μL。

2.5.3 NIRS的采集與預(yù)處理

NIRS的采集同“2.4”定性模型項(xiàng)下，采用OPUS軟件對上述NIRS進(jìn)行預(yù)處理、光譜波段區(qū)間的選擇與優(yōu)化、主因子數(shù)選擇。通過偏最小二乘法(partial least square，PLS)和交叉檢驗(yàn)法分別建立每個(gè)對照品的定量模型，以決定系數(shù)(correlation coefficient，R2)、驗(yàn)證均方差(root mean square error of cross-validation，RMSECV)和相對分析誤差(RPD)為考察指標(biāo)對建模效果進(jìn)行評價(jià)。一般認(rèn)為R2越接近1，RMSECV 越小，模型的準(zhǔn)確度和預(yù)測效果越好，當(dāng)RPD>2.5，則認(rèn)為所建模型可以滿足分析要求[16,17]。西地那非、那紅地那非光譜預(yù)處理方法及光譜最佳譜區(qū)(見表4)。

表4 不同預(yù)處理方法與光譜區(qū)段對模型的影響Table 4 Effects of different spectra pretreatments and spectral section on the models

2.5.4 定量模型建立

采用上述最佳光譜預(yù)處理方法、譜區(qū)范圍及主因子數(shù)建立性保健類化學(xué)藥物定量分析模型，其中西地那非、那紅地那非預(yù)測的R2分別為0.984、0.982，均大于0.85；其RMSECV分別為0.085、0.098，均為各自模型隨變量變化的最小值，推測上述預(yù)測模型擁有較好的預(yù)測能力。為了檢驗(yàn)所建模型的預(yù)測效果，對驗(yàn)證集樣品相應(yīng)化學(xué)成分進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果顯示預(yù)測值與實(shí)測值之間有良好的線性關(guān)系，結(jié)果見圖6。說明可以通過TLC-NIRS模型對保健品中添加違禁性化學(xué)藥物進(jìn)行快速定量分析，各模型的預(yù)測范圍、R2、RMSECV及RMSEP指標(biāo)(見表5)。

圖6 保健品中化學(xué)藥物的TLC-NIRS定量檢測模型Fig.6 TLC-NIRS quantitative model of chemical drugs in health products

表5 保健品中化學(xué)藥物含量的TLC-NIRS檢測模型Table 5 TLC-NIRS quantitative model of chemical drugs in health products

2.5.5 模型驗(yàn)證與應(yīng)用

利用上述模型分別對10批性保健樣品和10批自制的那紅地那非樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。TLC-NIRS模型預(yù)測結(jié)果與HPLC含量測定結(jié)果相一致，西地那非與那紅地那非的預(yù)測值和實(shí)測值之間的R2分別為0.982、0.996(見圖6)；經(jīng)計(jì)算9批性保健樣品預(yù)測值的平均相對偏差為1.86%，10批自制那紅地那非樣品預(yù)測值的平均相對偏差為1.96%，表明模型預(yù)測結(jié)果準(zhǔn)確可靠(見表6)。

表6 10批性保健品的TLC-NIRS模型預(yù)測值Table 6 TLC-NIRS predicted values of 10 sex-enhancing products

續(xù)表6(Continued Tab.6)

3 結(jié)論

本研究首次創(chuàng)建TLC-NIRS聯(lián)用技術(shù)，是因?yàn)門LC為經(jīng)典的傳統(tǒng)鑒別分析法，具有操作簡便、普及性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[12]。TLC對樣品處理自由空間大，針對可能添加的違禁化學(xué)藥物可選擇不同提取溶劑，很好的避免不同廠家產(chǎn)品因輔料不同對NIRS的影響；TLC可選材料較多，如硅膠、氧化鋁、聚酰胺等，展開劑可選不同極性試劑，以適用不同種類化學(xué)成分分離分析。同時(shí)，還可以采用不同的展開系統(tǒng)進(jìn)行雙向展開，具有較好的分離效果[12,13]，可以很好提高NIRS采集化學(xué)物藥物信息的準(zhǔn)確率。NIRS為近些年發(fā)展起來快速分析儀器，具有操作簡便、分析速度快、無化學(xué)污染等特點(diǎn)[14]。本文結(jié)合了各自優(yōu)點(diǎn)首次創(chuàng)建了TLC-NIRS聯(lián)用技術(shù)，并對此方法進(jìn)行了系統(tǒng)方法學(xué)考察。建立了保健品中添加違禁化學(xué)藥西地那非、那紅地那非快速定性定量分析模型，經(jīng)驗(yàn)證集樣品進(jìn)行模型驗(yàn)證與評價(jià)，定性模型可以較好判斷保健品中是否添加上述違禁化學(xué)藥物，判斷正確率100%；定量模型可以較準(zhǔn)確的預(yù)測出添加西地那非、那紅地那非的含量，含量預(yù)測范圍寬，分別為5.25～262.5、5.15～257.5 μg/μL，在10保健品預(yù)測結(jié)果中平均相對偏差分別為1.86%、1.96%，其預(yù)測結(jié)果均達(dá)到較好的效果，能夠滿足實(shí)際快檢的需要。在實(shí)際工作中應(yīng)用TLC-NIRS聯(lián)用技術(shù)破獲多批添加超劑量違禁化藥西地那非的性保健品。

本研究選用那非類化藥作為研究對象，因在性保健產(chǎn)品中那非類化藥效果確切、價(jià)格低廉且易獲得，是不法廠家首選的添加對象[3]。此外，此類性保健化藥要達(dá)到預(yù)期效果，有效劑量為50～100 mg/次，長期超劑量服用會造成嚴(yán)重的肝腎損傷及永久性性喪失等風(fēng)險(xiǎn)[18]。采用TLC-NIRS模型預(yù)測性保健品中是否添加那非類化藥具有一定的可行性與研究價(jià)值。

本文利用目前實(shí)驗(yàn)平臺上已有的分析技術(shù)及儀器進(jìn)行組合聯(lián)用，應(yīng)用到實(shí)際藥檢中具有很好的效果。開發(fā)的TLC-NIRS聯(lián)用技術(shù)，在面對保健品生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量參差不齊、生產(chǎn)品種繁多、輔料來源難統(tǒng)一、非法添加嚴(yán)重等問題方面具有很好的應(yīng)用前景。此聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用理論與實(shí)踐研究為開發(fā)TLC-NIRS聯(lián)用儀器設(shè)備提供了科學(xué)依據(jù)。