李 曉，鄧佳麗，安玉艷，林澤崑，汪良駒,2*

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095；2青島海德坤生物科學(xué)研究院，青島 266200

無花果(FicuscaricaL.)屬于?？崎艑贉貛淙~果樹，原產(chǎn)于幼發(fā)拉底河和底格里斯河流域，是人類馴化最早的栽培果樹之一，距今已有1萬年以上種植歷史[1]。類黃酮類化合物被證實(shí)是一種潛在的天然抗氧化劑，具有抑菌、抗腫瘤等作用[2,3]。無花果的根、莖、葉、果均可入藥。20世紀(jì)50年代Ullman提出，外用無花果乳汁處理動(dòng)物腸道，能引起大量的毛細(xì)血損傷，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致動(dòng)物死亡；但若經(jīng)口服，則沒有任何毒性[4]。從無花果乳汁中分離出4種活性組分，其中2種組分經(jīng)皮下注射或者靜脈注射，能抑制小鼠移植性肉瘤生長(zhǎng)。后續(xù)證實(shí)，無花果乳汁液能顯著抑制小鼠原發(fā)性乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，導(dǎo)致癌細(xì)胞壞死，延緩移植性腺癌、骨髓性白血病、淋巴肉瘤和肉瘤發(fā)生，并引起肉瘤退化[5]。在中國(guó)，Wang等[6]首先報(bào)道無花果根、莖、葉和果實(shí)(包括幼果和成熟果)提取液對(duì)S180肉瘤、肺癌、肝癌和艾氏腹水癌均具有明顯的抑制活性。他們將無花果水提液供給荷瘤小鼠或癌癥病患，均能提高試驗(yàn)對(duì)象的免疫功能，因而建議，無花果制劑可以作為一種天然、無毒的輔助性藥物，以緩解化療、放療患者病痛，提高生活質(zhì)量。然而，無花果抗癌有效成分卻一直未闡明。Takeuchi等[7]最早提出，苯甲醛是無花果抗癌的主要成分。Yin等[8]認(rèn)為，無花果抗癌是包括香豆素類化合物、苯甲醛和呋喃環(huán)類小分子芳環(huán)化合物共同作用的結(jié)果，苯甲醛只是增效劑或有機(jī)活性分子之一。后來發(fā)現(xiàn)，無花果多糖具有抗癌活性[9]。但是，多糖物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其與抗腫瘤的關(guān)系需要更多探討。另一方面，類黃酮與抗癌的關(guān)系引起大家重視。Sharada等[10]提出，無花果中含有的一種類黃酮物質(zhì)桑色素(morin)可以抑制1，2-二甲基肼(DMH)誘發(fā)的大鼠結(jié)腸癌發(fā)生。有關(guān)這一研究缺乏后續(xù)報(bào)道。介于無花果品種眾多，不同時(shí)期成熟的果實(shí)葉片可能具有不同功能。為此，本研究于2019年7月至11月間，采集3個(gè)無花果品種葉片，分別提取并精制類黃酮，研究不 同月份品種葉片對(duì)人體癌細(xì)胞增殖的抑制活性，探討無花果類黃酮的抑癌機(jī)理，分析類黃酮物質(zhì)與抗癌活性的關(guān)系，以期為無花果類黃酮在抗癌醫(yī)藥上的應(yīng)用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)所用的無花果(FicuscaricaL.)共有三個(gè)品種，即‘布蘭瑞克’(Brunswick)、‘瑪斯義陶芬’(Masui Dauphine)和‘波姬紅’(Bojihong)。其中，前兩品種葉片采摘于常州市圣王果蔬有限公司無花果園，‘波姬紅’葉片采自南京市浦口區(qū)翔辰家庭農(nóng)場(chǎng)無花果園。從2019年7月至11月份，每個(gè)月份采集一次新梢中部成熟葉片。洗凈后，在110 ℃烘箱中殺青10 min，在80 ℃條件下烘干，磨碎后過60目篩以備類黃酮提取之用。人肝癌HepG-2細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫，胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞由中國(guó)藥科大學(xué)倪孟祥教授饋贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)試劑與儀器

1.2.1 試劑

DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute)培養(yǎng)基、PBS(Phosphate Buffer Solution)、0.25%胰蛋白酶為Hyclone公司產(chǎn)品；胎牛血清(Fatal Bovine Serum，F(xiàn)BS)來自Gibco公司。細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)別二甲亞砜(DMSO)、MTT細(xì)胞增殖抑制試劑盒(MTT Cell Proliferation Assay Kit)、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit)、細(xì)胞周期DNA含量檢測(cè)試劑盒(DNA Content Quantitation Assay-Cell Cycle)、線粒體電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)(Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1)全部來自北京索萊寶生物科技有限公司，130種酚類標(biāo)準(zhǔn)品由上海鹿明生物科技有限公司提供。

1.2.2 儀器

冷凍干燥機(jī)；超聲波清洗機(jī)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Electron Corporation，MA，USA)；倒置顯微鏡；流式細(xì)胞儀(BD Accuri C6 Ⅱ)；多功能酶標(biāo)儀(Cytation 3)；高速冷凍離心機(jī)；三重四極桿質(zhì)譜儀(AB Qtrap 6500+)；高效液相色譜儀(AB ExionLC)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 類黃酮提取與精制

取不同品種不同月份的無花果葉片粉末各50 g，按照1∶49物液比加入80%乙醇溶液，在70 ℃條件下以420 W功率超聲波提取40 min，減壓真空抽濾，重復(fù)以上操作兩次，合并濾液。在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用冷凍干燥機(jī)凍干，得粗黃酮。隨后，采用D101型大孔樹脂進(jìn)行靜態(tài)吸附精制。具體方法為：稱取8 g已活化處理的D101型大孔樹脂，以60%乙醇溶液按照1∶40物液比溶解1 g上述粗黃酮。在25 ℃恒溫?fù)u床中以150 rpm轉(zhuǎn)速浸搖吸附12 h，再用去離子水沖洗吸附后的樹脂，去除洗滌水。然后，加入70%乙醇溶液20 mL，再于25 ℃恒溫?fù)u床中以150 rpm轉(zhuǎn)速浸搖解析12 h，減壓抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最后冷凍干燥得到精制類黃酮。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人體肝癌HepG-2細(xì)胞培養(yǎng)在含有80%DMEM和20%胎牛血清培養(yǎng)基上，胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng)在含有90%RPMI和10%胎牛血清培養(yǎng)基上，置于37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱。

1.3.3 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)

1.3.3.1 無花果品種和月份類黃酮樣品抑癌效應(yīng)

利用MTT法檢測(cè)無花果葉片類黃酮對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的抑制效應(yīng)，比較不同品種和月份葉片的抑癌效率。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL。取100 μL加入到96孔板中，吹打成單細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h至貼壁。棄除上清，加入含有1 mg/mL無花果葉片類黃酮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄除培養(yǎng)基，加入90 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，再培養(yǎng)4 h。然后棄除孔內(nèi)溶液，加入110 μL二甲亞砜(DMSO)，水平晃動(dòng)10 min，使晶體充分溶解，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度。抑制癌率=(1 - OD樣品/ OD空白)×100%。該試驗(yàn)重復(fù)10次以上，取平均值。

1.3.3.2 無花果葉片類黃酮對(duì)不同癌細(xì)胞株系的抑制效率

以人體肝癌HepG-2細(xì)胞、胃癌BGC-823和SGC-7901細(xì)胞為材料，利用MTT法檢測(cè)類黃酮對(duì)不同癌細(xì)胞系增殖抑制效率，比較不同癌細(xì)胞增殖對(duì)無花果類黃酮的敏感性。具體方法同“1.3.3.1”。

1.3.3.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

介于‘布蘭瑞克’無花果8月份葉片類黃酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制率最高(見結(jié)果與分析)，本研究用該體系來探討無花果類黃酮抑癌機(jī)理。在細(xì)胞形態(tài)觀察中，將SGC-7901細(xì)胞均勻鋪在兩組6孔板中，用不同濃度類黃酮處理，培養(yǎng)48 h后選擇一組加入MTT染色后，分別在倒置光學(xué)顯微鏡下觀察兩組SGC-7901細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3.3.4 細(xì)胞凋亡測(cè)定

在SGC-7901細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL，取2 mL加入6孔板中，吹打均勻，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h至貼壁。棄除上清液，加入含有不同濃度類黃酮的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞后，用預(yù)冷的PBS洗滌，2 000 rpm離心5 min，棄上清。用1 mL Binding Buffer (1×)懸浮細(xì)胞，2 000 rpm離心10 min，棄上清。用Binding Buffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞密度達(dá)到1×106個(gè)/mL。吸取100 μL重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV-FITC溶液，暗孵育10 min。加入5 μL碘化丙啶(PI)，暗孵育5 min，按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說明書，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3.3.5 線粒體膜電位測(cè)定

參照“1.3.3.4”法收集經(jīng)不同濃度類黃酮處理的SGC-7901細(xì)胞，去除上清，用PBS洗滌2次，再加入1 mL細(xì)胞培養(yǎng)液和1 mL JC-1工作液，充分混勻后，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。4 ℃下600 g離心5 min，去除上清液。用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次，再加入適量JC-1染色緩沖液(1×)重懸細(xì)胞，按照線粒體電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)說明書，在流式細(xì)胞儀上分析無花果葉片類黃酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位的影響。

1.3.3.6 細(xì)胞周期分析

參照“1.3.3.4”法收集經(jīng)不同濃度類黃酮處理的SGC-7901細(xì)胞。經(jīng)PBS沖洗兩次，用70%預(yù)冷乙醇固定過夜；再用PBS洗滌2次，加入500 μL含RNase的碘化丙啶(PI)染色液，在4 ℃下避光孵育30 min，按照細(xì)胞周期DNA含量檢測(cè)試劑盒說明書，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm紅色熒光下細(xì)胞周期情況。

1.3.3.7 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)

參照“1.3.3.4”法收集經(jīng)不同濃度類黃酮處理的SGC-7901細(xì)胞，利用RNA simple Total RNA Kit 試劑盒提取RNA，利用微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA18S和26S條帶完整性。使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以此為模板，用qRT-PCR測(cè)定p53、Bax、Bcl-2以及與周期相關(guān)基因表達(dá)量，以GAPDH為內(nèi)參。引物序列如表1。

表1 用于RT-qPCR分析的引物序列Table 1 Oligonucleotide sequences for primers used in RT-qPCR

1.3.4 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測(cè)定黃酮類物質(zhì)含量

以三種抑癌效率不同的無花果葉片類黃酮為材料，采用UPLC-ESI-MS/MS開展定性定量檢測(cè)，借以探索與抑癌率相關(guān)的無花果黃酮種類。色譜條件：Waters UPLC HSS T3(100 mm× 2.1 mm，1.8 μm)液相色譜柱，流動(dòng)相A(0.1%甲酸-水溶液)，流動(dòng)相B(乙腈)，梯度洗脫，流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。分析前，先將130種黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品分別用甲醇溶解，制備1 mg/mL母液。梯度稀釋后，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并優(yōu)化質(zhì)譜條件。無花果葉片樣品分析時(shí)，用精制后黃酮。根據(jù)出峰時(shí)間、峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線，定性定量分析黃酮類代謝物絕對(duì)含量。每個(gè)樣品生物學(xué)重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為重復(fù)3次以上試驗(yàn)的平均值。經(jīng)單因素或雙因素方差分析和Duncan氏顯著性測(cè)驗(yàn)。當(dāng)P< 0.05時(shí)，認(rèn)為差異顯著；當(dāng)P< 0.01時(shí)，認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 無花果葉片類黃酮對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)

表2為添加1 000 μg/mL無花果類黃酮對(duì)人體胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率。從中可以看出，除了‘布蘭瑞克’8月份葉片的抑癌率達(dá)39.24%外，其他月份以及其他兩個(gè)品種‘瑪斯義陶芬’和‘波姬紅’葉片類黃酮的抑癌率均相當(dāng)?shù)停踔翞樨?fù)值，表明并非所有品種月份無花果葉片類黃酮都有抑癌活性。

表2 不同品種月份無花果葉片類黃酮對(duì)人體胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖抑制效率Table 2 The inhibitory efficiency of flavonoids of fig leaves of different cultivars harvested indifferent months on the proliferation of human gastric cancer SGC-7901 cells

介于8月份采集的‘布蘭瑞克’無花果葉片類黃酮對(duì)人體胃癌SGC-7901細(xì)胞具有明顯的抑癌活性，我們以此為材料，利用MTT法測(cè)定了它對(duì)三種癌細(xì)胞系，包括肝癌細(xì)胞Hepg-2、胃癌細(xì)胞SGC-7901和BGC-823增殖抑制的濃度效應(yīng)，結(jié)果如圖1。從中可以看出，在100～1 600 μg/mL濃度范圍內(nèi)，無花果類黃酮對(duì)3種癌細(xì)胞的抑制率均隨著濃度增加而迅速上升。當(dāng)濃度為1 600 μg/mL時(shí)，無花果葉片類黃酮對(duì)肝癌Hepg-2細(xì)胞抑制率為21.93%，對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞抑制率為86.65%，對(duì)胃癌BGC-823細(xì)胞抑制率為26.31%。顯然，無花果葉類黃酮對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞抑制率最高，而對(duì)其他兩種癌細(xì)胞的抑制率均低于30%。

圖1 8月份采集的‘布蘭瑞克’無花果葉片類黃酮對(duì)不同癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)Fig.1 The inhibitory effect of flavonoids from ‘Brunswick’ fig leaves harvested in August on the proliferation of different lines of cancer cells注：圖中相同小寫字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。Note:The same lowercases in a figure indicate no significant difference at P = 0.05 level.

圖2顯示的是倒置顯微鏡中觀察到的8月份采集的布蘭瑞克無花果葉片類黃酮對(duì)人體胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的抑制情況。從中可以看出，無論是否經(jīng)MTT染色，癌細(xì)胞數(shù)量均隨無花果類黃酮濃度增加而迅速下降，細(xì)胞松散，逐漸萎縮死亡。MTT染色可以提高這一效應(yīng)的可視性，因?yàn)镸TT可以被活細(xì)胞線粒體脫氫酶還原生成深紫色結(jié)晶體，顏色越深，表明活細(xì)胞數(shù)量越多。從圖2可以看出，隨著無花果葉類黃酮濃度的提高，SGC-7901細(xì)胞顏色逐漸變淺，細(xì)胞數(shù)量迅速下降。當(dāng)類黃酮濃度達(dá)1 600 μg/mL時(shí)，幾乎見不到能被染色的活細(xì)胞。表明，無花果葉片類黃酮處理對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖有顯著抑制效應(yīng)。

2.2 無花果葉片類黃酮誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞凋亡效應(yīng)

圖3為不同濃度無花果葉片類黃酮處理誘發(fā)人體胃病SGC-7901細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。其中，A圖由6個(gè)小圖組成，每一個(gè)小圖有4個(gè)象限。Q1為裸核細(xì)胞，Q2為凋亡晚期細(xì)胞或已經(jīng)壞死的細(xì)胞，Q3為處于凋亡早期的可逆性細(xì)胞，Q4為活細(xì)胞。B圖是多次重復(fù)測(cè)試后獲得的不同類型細(xì)胞百分率。從中可以看出，正常培養(yǎng)條件下，92.83%為活細(xì)胞。隨著無花果類黃酮濃度增加，活細(xì)胞數(shù)量直線下降。其回歸方程y= -0.045 7x+ 76.381，相關(guān)系數(shù)r= -0.910 1*。由此計(jì)算出無花果類黃酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞的半致死濃度IC50為577.26 μg/mL。另一方面，正常培養(yǎng)條件下凋亡早期和凋亡晚期的細(xì)胞很少，兩者總共只有5.26%。當(dāng)無花果葉類黃酮濃度為100 μg/mL時(shí)，凋亡細(xì)胞總數(shù)升為13.26%。當(dāng)無花果葉類黃酮濃度達(dá)到1 600 μg/mL時(shí)，凋亡細(xì)胞總數(shù)升為83.6%，其中凋亡早期細(xì)胞為24.1%，凋亡晚期細(xì)胞為59.5%。以上結(jié)果再次證明，無花果葉片類黃酮以劑量依賴方式促進(jìn)人體胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡。

圖3 不同濃度無花果類黃酮處理對(duì)人體胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effects of fig flavonoids in different concentrations on apoptosis of human gastric cancer SGC-7901注：A：流式細(xì)胞儀照片；B：不同凋亡時(shí)期細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。圖中相同字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。Note:A:Photos of flow cytometry.B:Percentage of apoptotic cells at different stages.The same letters in the figure represent no significant difference at P = 0.05 level.

2.3 無花果葉片類黃酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位的影響

JC-1是一種特殊的熒光染料。它在細(xì)胞線粒體外能產(chǎn)生紅色熒光。當(dāng)線粒體膜電位下降時(shí)，它可以進(jìn)入線粒體，熒光則由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色。因而，JC-1可以作為分子探針，特異性地檢測(cè)線粒體膜電位變化。如圖4，未經(jīng)類黃酮處理的人體胃癌SGC-7901細(xì)胞紅色熒光強(qiáng)度為97.9%，100 μg/mL類黃酮處理對(duì)此沒有明顯影響。當(dāng)類黃酮濃度達(dá)200 μg/mL時(shí)，紅色熒光顯著下降(P< 0.05)。以后，隨著類黃酮濃度上升，紅色熒光強(qiáng)度迅速下降。當(dāng)類黃酮濃度為1 600 μg/mL時(shí)，紅色熒光降低到3.9%。與此相反的是，綠色熒光強(qiáng)度隨著類黃酮濃度上升而上升。當(dāng)類黃酮濃度為1 600 μg/mL時(shí)，綠色熒光上升至96.07%。紅色熒光與綠色熒光的比值從對(duì)照的47.68%到下降到0.04%。這些結(jié)果表明，200 μg/mL以上濃度的無花果葉片類黃酮處理顯著降低SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位。

圖4 不同濃度的無花果類黃酮處理對(duì)人體胃癌SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.4 Effects of fig leaf flavonoids at different concentrations on mitochondrial membrane potential of human gastric cells SGC-7901注：A：流式細(xì)胞儀JC-1檢測(cè)結(jié)果；B：紅綠熒光比值。Note:A:Images from flow cytometer.B:Red and green fluorescence and their ratio which present mitochondrial membrane potential.

2.4 無花果葉片類黃酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞周期的影響

圖5展示的是無花果葉類黃酮對(duì)人體胃癌SGC-7901細(xì)胞周期的影響。其中，G1為DNA復(fù)制前期，主要合成與DNA復(fù)制有關(guān)的RNA、結(jié)構(gòu)蛋白以及酶蛋白等；S為DNA復(fù)制期，它不僅復(fù)制DNA，導(dǎo)致DNA加倍，而且合成與DNA組裝構(gòu)成染色質(zhì)等有關(guān)的組蛋白；G2為DNA復(fù)制后期，主要負(fù)責(zé)染色體濃縮以及形成有絲分裂所需的成分。從圖5B可以看出，G1期細(xì)胞比例隨著無花果葉片類黃酮濃度增加逐漸下降。當(dāng)濃度為400 μg/mL時(shí)，G1細(xì)胞僅為對(duì)照的52.56%，差異達(dá)到極顯著水平。與此同時(shí)，S期細(xì)胞比例極顯著增加，處理組比對(duì)照高出47.98%。類似地，G2期細(xì)胞比例也明顯增加。當(dāng)類黃酮濃度達(dá)1 600 μg/mL時(shí)，處理組G2細(xì)胞比例比對(duì)照高出77.58%。以上結(jié)果說明，無花果葉類黃酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞G1期沒有阻滯效應(yīng)，但顯著抑制DNA復(fù)制，導(dǎo)致S期細(xì)胞比例顯著增加。同時(shí)，G2期細(xì)胞比例也有顯著提高。由于細(xì)胞周期受阻于S期和G2期，細(xì)胞增殖停滯，同時(shí)逐漸凋亡。

圖5 不同濃度無花果葉片類黃酮對(duì)人體胃癌SGC-7901細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effects of fig leaf flavonoids in different concentrations on the cell cycle of human gastric cancer SGC-7901注：A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)出的細(xì)胞周期圖；B：細(xì)胞周期不同階段細(xì)胞所占比百分?jǐn)?shù)。圖中相同字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。 Note:A:Images of cell cycles by flow cytometer;B:Cell percentage at different stages of cell cycles.The same letters in the figure represent no significant difference at P = 0.05 level.

2.5 無花果葉片類黃酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

為了在mRNA水平上闡明無花果葉類黃酮抑制SGC-7901細(xì)胞增殖機(jī)理，本試驗(yàn)采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，如圖6A。促凋亡基因Bax在SGC-7901細(xì)胞內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量隨無花果葉類黃酮濃度的升高而上升。當(dāng)類黃酮濃度達(dá)到400 μg/mL后，Bax相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照間達(dá)到顯著差異(P< 0.05)。類似地，抑癌基因p53表達(dá)也表現(xiàn)出上調(diào)趨勢(shì)，但類黃酮濃度低于400 μg/mL時(shí)，其差異未達(dá)到P= 0.05的顯著水平；當(dāng)類黃酮濃度達(dá)800 μg/mL時(shí)，p53相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照高出1.89倍(P< 0.05)；1 600 μg/mL時(shí)，高出4.24倍，說明一定濃度無花果葉類黃酮處理顯著上調(diào)p53表達(dá)。與此相反，抑凋基因Bcl-2相對(duì)表達(dá)量隨著類黃酮濃度的升高而下降。這種效應(yīng)在無花果葉類黃酮濃度為100 μg/mL時(shí)就顯著存在(P< 0.05)；當(dāng)濃度為1 600 μg/mL時(shí)，Bcl-2相對(duì)表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的16%，說明無花果葉類黃酮處理顯著抑制抑凋基因Bcl-2表達(dá)。

圖6 不同濃度無花果葉類黃酮處理對(duì)SGC-7901細(xì)胞基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of fig leaf flavonoids in different concentrations on the gene expressions of SGC-7901 cells注：A：細(xì)胞凋亡相關(guān)基因；B：細(xì)胞周期相關(guān)基因。同一基因相同字母代表在P = 0.05水平上差異不顯著。Note:A:Apoptosis-related genes;B:Cell cycle-related genes.The same letters in a gene represent no significant difference at P = 0.05 level.

CDK1、CDK2和CDK6為細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(Cyclin-dependent kinase，CDKs)編碼基因。從圖6B可以看出，隨類黃酮濃度升高，CDK1、CDK2和CDK6相對(duì)表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。就CDK1、CDK6而言，類黃酮濃度低于400 μg/mL時(shí)，效果不顯著(P> 0.05)；當(dāng)類黃酮濃度上升為800 μg/mL時(shí)，CDK1和CDK6的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為對(duì)照的30%左右，達(dá)到P= 0.05顯著水平。CDK2相對(duì)表達(dá)量對(duì)類黃酮濃度更敏感。當(dāng)類黃酮濃度為200 μg/mL時(shí)，相對(duì)表達(dá)量降至對(duì)照的82.62%(P< 0.05)。此后，隨著類黃酮濃度升高，表達(dá)量進(jìn)一步下降。當(dāng)類黃酮濃度為1 600 μg/mL時(shí)，處理僅為對(duì)照的11.34%。Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白(Cyclins)編碼基因。與CDKs類似，Cyclin D1的表達(dá)量隨無花果葉類黃酮處理濃度的升高而呈降低。當(dāng)類黃酮濃度上升為800 μg/mL時(shí)，差異達(dá)到P= 0.05顯著水平；當(dāng)濃度為1 600 μg/mL時(shí)，處理僅為對(duì)照的8.94%。另一方面，從圖6B可知，無花果葉類黃酮促進(jìn)E2F1基因表達(dá)。這種效應(yīng)在類黃酮濃度為1 600 μg/mL時(shí)顯著存在(P< 0.05)，相對(duì)表達(dá)量約為對(duì)照的2倍。以上結(jié)果說明，無花果葉類黃酮顯著降低SGC-7901細(xì)胞周期相關(guān)基因CDKs和Cyclin D1表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)E2F1表達(dá)。

2.6 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)定性定量測(cè)定黃酮類物質(zhì)種類與含量

為了探討無花果葉片類黃酮抑制SGC-7901細(xì)胞增殖效應(yīng)的活性成分，根據(jù)表2結(jié)果，我們選取抑癌率不同的3組類黃酮，即‘布蘭瑞克’8月、‘瑪斯義陶芬’9月和‘波姬紅’9月，利用LC-MS/MS技術(shù)定性定量測(cè)定類黃酮成分和含量，其中圖7展示的是130種標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖。從中可以看出，每個(gè)標(biāo)樣出峰清晰，3次進(jìn)樣的出峰時(shí)間重疊，說明檢測(cè)條件良好且穩(wěn)定。另外，每個(gè)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.998以上(數(shù)據(jù)未列出)，可以用于定量檢測(cè)。

圖7 標(biāo)品總離子流圖Fig.7 Total ion flow diagram of standards

3組樣品各3次重復(fù)共檢測(cè)出60種類黃酮物質(zhì)(資料未列出)，其總量分別為714.75、636.45和505.69 μg/mL。它們與抑癌率呈正相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)系數(shù)未達(dá)到P= 0.05顯著水平。以單個(gè)物質(zhì)含量與抑癌率做相關(guān)分析，共有11種含量與抑癌率的相關(guān)關(guān)系達(dá)到P= 0.05顯著水平(表3)。其中，2.6-二羥基苯甲酸、香草乙酮為苯丙類，芥子酸、單咖啡酰酒石酸為苯丙素類，其余均為黃酮類物質(zhì)。無花果葉片中特有的桑色素(morin)含量與抗癌率相關(guān)系數(shù)的P= 0.08，雖然未達(dá)到但很接近0.05顯著水平，所以也列入表中。從表3可得，水仙苷含量與無花果類黃酮抑癌率相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999 9以上(P< 0.01)；2.6-二羥基苯甲酸、紫云英苷、香草乙酮、氯化矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、表兒茶素、異葒草苷、煙花苷、芥子酸、單咖啡酰酒石酸和金絲桃苷含量與無花果類黃酮抑癌率均呈顯著相關(guān)關(guān)系(P< 0.05)。這些結(jié)果為后續(xù)抗癌活性物質(zhì)鑒定提供了依據(jù)。

表3 三種無花果葉差異代謝物含量及與抑癌率相關(guān)性Table 3 Correlation between different metabolite content and anti-cancer efficiency of three kinds of fig leaves

3 討論

類黃酮是兩個(gè)苯環(huán)通過三個(gè)碳原子相互連接而成的一系列化合物的總稱，具有C6-C3-C6結(jié)構(gòu)，難溶或不溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑。因此，無花果醇類提取液，甚至無花果酒中都含有一定量的類黃酮，并且具有抑癌活性[11]。在抗腫瘤方面，Bai等[12]利用無花果乙醇提取物腹腔注射荷S180實(shí)體瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)對(duì)肉瘤生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，并增加臟器指數(shù)，增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，暗示著無花果乙醇提物可能通過增強(qiáng)荷瘤小鼠免疫功能起到抗腫瘤效果。這是無花果類黃酮抑制動(dòng)物腫瘤的最早報(bào)道。本試驗(yàn)中，我們觀察到無花果葉片類黃酮對(duì)人體胃癌細(xì)胞SGC-7901細(xì)胞增殖有顯著抑制活性，但是，對(duì)胃癌BGC-823和肝癌Hepg-2細(xì)胞增殖效應(yīng)卻相對(duì)較低(見圖1)。從不同品種月份采集的葉片提取出的類黃酮抑癌效應(yīng)上看，‘布蘭瑞克’8月份葉片對(duì)SGC-7901細(xì)胞抑制率最高，其他品種以及月份葉片類黃酮的抑制率均比較低(見表2)。似乎只有特定品種和特定月份的無花果葉片類黃酮對(duì)特定腫瘤細(xì)胞增殖才有顯著效應(yīng)。有人提出，蟬花蟲草醇提液對(duì)癌細(xì)胞增殖的抑制率也是SGC-7901最高[13]。本試驗(yàn)結(jié)果與此相似。隨著無花果葉片類黃酮濃度增加，胃癌SGC-7901細(xì)胞數(shù)目減少，變短皺縮，逐漸脫離細(xì)胞板，其抑制作用呈劑量效應(yīng)(見圖2)。這為無花果葉片的采收時(shí)機(jī)確定及類黃酮抑癌功效開發(fā)提供了理論依據(jù)。

我們首次利用流式細(xì)胞儀觀察無花果葉片類黃酮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(見圖3)。在類黃酮濃度為200 μg/mL時(shí)，細(xì)胞總凋亡率為39.08%；當(dāng)濃度達(dá)1 600 μg/mL時(shí)，總凋亡率達(dá)83.60%。據(jù)此計(jì)算出無花果類黃酮對(duì)SGC-7901細(xì)胞半致死濃度為577.25 μg/mL。這與Purnamasari等[14]提出的無花果甲醇提取液對(duì)肝癌細(xì)胞Huh7it半抑制濃度為653 μg/mL相似。他們發(fā)現(xiàn)，無花果葉片甲醇提取液能抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞壞死。細(xì)胞凋亡涉及一系列基因的激活、表達(dá)和調(diào)控，主要包括內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體調(diào)節(jié)途徑[15]。細(xì)胞線粒體膜電位下降是線粒體依賴性凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件[16]。García-Zepeda等[17]證明，白藜蘆醇誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞系的線粒體膜電位降低，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡。本試驗(yàn)觀察到，無花果類黃酮降低人體胃癌SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位水平(見圖4)。這表明無花果葉片類黃酮通過誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞線粒體膜電位水平降低，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

我們還觀察了無花果葉片類黃酮對(duì)癌細(xì)胞周期的抑制效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)它將SGC-7901細(xì)胞有絲分裂主要阻滯在S期，也有部分在G2期(見圖5)。曾報(bào)道，辣椒素能將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞阻滯于S期，并引起凋亡率升高[18]。據(jù)研究，辣椒素抑癌機(jī)理在于抑制細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶CDK2、CDK4、CDK6蛋白表達(dá)[19]。人工合成的黃酮類氨基酸衍生物也能使MGC-803胃癌細(xì)胞周期受阻于G2/M期，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá)，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡[20]。本試驗(yàn)在mRNA水平上分析無花果類黃酮抑制SGC-7901細(xì)胞凋亡機(jī)理。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)無花果葉類黃酮處理的SGC-7901細(xì)胞CDK1、CDK2、CDK6和Cyclin D1基因表達(dá)顯著下降，E2F1表達(dá)升高(見圖6B)。在多種腫瘤組織中，CDKs都處于異?；罨癄顟B(tài)[21]，抑制CDKs表達(dá)便能抑制腫瘤無序增殖。此外，無花果葉類黃酮處理還影響到抑癌基因P53和Bax以及促癌基因Bcl-2的表達(dá)(見圖6A)。這三個(gè)基因中，Bax與Bcl-2屬于同一基因家族，其中，Bcl-2促進(jìn)細(xì)胞周期，而Bax與Bcl-2形成蛋白二聚體，拮抗后者活性，抑制細(xì)胞周期，引起細(xì)胞凋亡[22]。據(jù)報(bào)道，天山雪蓮類黃酮可導(dǎo)致人食管癌細(xì)胞CaEs-17 Bax表達(dá)量上調(diào)，Bcl-2表達(dá)量下調(diào)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。我們觀察到的無花果葉類黃酮促進(jìn)抑癌基因P53和Bax表達(dá)，抑制促癌基因Bcl-2表達(dá)。這說明，無花果葉類黃酮對(duì)胃癌細(xì)胞SGC-7901的凋亡誘導(dǎo)作用可能是通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bax、P53和Bcl-2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

為挖掘無花果葉類黃酮抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖效應(yīng)的具體活性成分，根據(jù)不同品種不同月份無花果葉片類黃酮對(duì)人體胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖抑制效率不同，我們選取三個(gè)(‘布蘭瑞克’8月、‘瑪斯義陶芬’9月、‘波姬紅’9月)樣品進(jìn)行LC-MS/MS定性定量分析。經(jīng)篩選，獲得12種與抑癌率高度相關(guān)的差異代謝物(見表3)。其中，水仙苷與無花果類黃酮抑癌率呈極顯著正相關(guān)。曾報(bào)道，水仙苷具有抗病毒活性，還對(duì)阿爾茨海默癥、Ⅱ型糖尿病、帕金森癥等蛋白構(gòu)象病的防治具有重要意義[24]。最近有人提出，水仙苷可以用于防治新冠病毒[25]。但是，它是否具有抑癌效應(yīng)還有待研究。表3結(jié)果還表明，異葒草苷與無花果類黃酮抑癌率呈顯著相關(guān)關(guān)系。有人報(bào)道，異葒草苷能夠顯著抑制膠質(zhì)瘤組織miR-23a表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞增殖[26]。因而，無花果葉片異葒草苷與抗腫瘤的關(guān)系值得深入研究。第三，桑色素能夠抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[10]，且發(fā)生在細(xì)胞周期的S期[27]。但也有人認(rèn)為，阻滯發(fā)生在G2/M期[28]。本研究也檢測(cè)出桑色素的存在，而且其含量與抗癌率的相關(guān)系數(shù)r= 0.9923，P= 0.08。雖然未達(dá)到0.05水平，但非常接近。而且，我們觀察到無花果葉片類黃酮抑制SGC-7901細(xì)胞周期效應(yīng)在S期。這與前人[27]結(jié)果類似。由于無花果屬于桑科榕屬，這種黃酮物質(zhì)是否與無花果抗癌活性有關(guān)，值得深入研究。此外，我們還觀察到2.6-二羥基苯甲酸、香草乙酮、氯化矢車菊素-3-O-蕓香糖苷、煙花苷、表兒茶素、芥子酸等含量與無花果類黃酮抑癌率呈顯著相關(guān)關(guān)系(表3)。曾報(bào)道，兒茶素對(duì)人體肝癌有抑制效應(yīng)[29]。但是，本試驗(yàn)中，我們觀察到無花果葉片類黃酮對(duì)肝癌HepG-2的抑制效應(yīng)比較低(見圖1)，因而推測(cè)，它對(duì)SGC-7901的抑制效應(yīng)可能與表兒茶素?zé)o關(guān)。其他幾種代謝物與抑癌效應(yīng)的關(guān)系目前很少見報(bào)道。

綜上所述，本文首先分析了‘布蘭瑞克’、‘瑪斯義陶芬’和‘波姬紅’等3個(gè)品種葉片在7月到11月份間的類黃酮對(duì)不同癌細(xì)胞株增殖的抑制效率，發(fā)現(xiàn)‘布蘭瑞克’無花果品種8月份葉片類黃酮對(duì)SGC-7901胃癌的抑制率最高。隨著類黃酮濃度上升，癌細(xì)胞密度和粘附性下降，活細(xì)胞減少，死亡細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞比例上升。抑癌機(jī)理研究表明，無花果葉類黃酮將細(xì)胞周期阻滯在S期以及少量的G2期，細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降，促細(xì)胞凋亡基因Bax和p53、細(xì)胞周期調(diào)控基因E1F2表達(dá)量顯著上升，抗凋亡基因Bcl-2以及細(xì)胞周期相關(guān)基因Cyclin D1和CDKs表達(dá)量顯著下降。這些都是無花果葉類黃酮促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。此外，借助于LC-MS/MS技術(shù)和相關(guān)分析，我們篩選得到水仙苷、異葒草苷、桑色素等幾種與抑癌率高度相關(guān)的差異代謝物。這為后續(xù)無花果葉片抗癌藥物開發(fā)開辟了新視野。