王洪玉，任紅娟，陳霞

（1.南陽市社旗縣婦幼保健院婦產科，河南 南陽 473300；2.南陽市中心醫(yī)院婦產科，河南 南陽 473000）

宮頸癌是最常見的女性生殖器官惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和致死率。手術切除、放療、化療是宮頸癌主要的治療方法,然而這些治療方法副反應較大，嚴重影響患者的生活質量。近年來，天然植物或其主要成分的抗腫瘤作用受到日益關注。褐藻多糖硫酸酯（Fucoidan）是從褐藻中提取的一種硫酸化多糖，主要由巖藻糖和硫酸基組成，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種生物活性[1]。研究顯示，褐藻多糖硫酸酯可能通過下調HDAC1表達誘導胃癌細胞凋亡[2]；褐藻多糖硫酸酯通過調控p38 MAPK/ERK和PI3K/Akt 信號通路誘導肝細胞癌細胞凋亡并抑制細胞增殖[3]。目前,褐藻多糖硫酸酯對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制還未知。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一類長度超過200 個核苷酸的小分子非編碼RNA，其參與調控細胞的增殖、凋亡、遷移等多種生命過程,與人類疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[4,5]。增殖細胞核抗原的反義RNA1(proliferating cell nuclear antigen antisense RNA1，PCNAAS1)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，在結直腸癌、胃癌、肝細胞癌等腫瘤中表達升高，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-8]。目前，還未見PCNA-AS1 影響宮頸癌發(fā)生發(fā)展的相關報道。本研究以宮頸癌Hela細胞為研究對象,主要觀察了褐藻多糖硫酸酯對Hela細胞增殖和凋亡的影響及其能否調控PCNA-AS1表達發(fā)揮抗宮頸癌作用,以期為其用于宮頸癌的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞和實驗試劑 褐藻多糖硫酸酯，純度>99.0%,貨號140193，上海西寶生物科技股份有限公司；宮頸癌Hela細胞株，貨號TCHu187，中國科學院上海細胞庫；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），貨號11011-8611，浙江天杭生物科技有限公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基，貨號31800，北京索萊寶科技有限公司；PCNA-AS1的小干擾RNA（si-PCNAAS1）及亂序無意義陰性序列（si-NC）、PCNA-AS1過表達載體（pcDNA-PCNA-AS1）、空載體（pcDNA），廣州銳博生物科技有限公司；LipofectamineTM 2000 試劑盒（貨號11668-027）和Trizol試劑（貨號15596-026）美國Invitrogen 公司；逆轉錄試劑盒（貨號K1622），美國Fermentas 公司；PCR試劑盒，貨號QP-01013，成都福際生物技術有限公司；PCR 引物，上海生工生物工程有限公司設計并合成；二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白檢測試劑盒，貨號P0009，上海碧云天生物技術有限公司；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）細胞凋亡試劑盒，貨號KGA1014，江蘇凱基生物技術股份有限公司；細胞周期蛋白D1（CyclinD1）（貨號sc-8396）、P21（貨號sc-6246）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde -3 -phosphate dehydrogenase，GAPDH）（貨號sc-47724）抗體，美國Santa Cruz 公司；B 淋巴細胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（貨號ab32124）和B 淋巴細胞瘤-2 相關蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）（貨號ab32503）抗體，美國Abcam 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)和轉染 復蘇Hela細胞，加入含10% FBS的RPMI 1640 培養(yǎng)基（常規(guī)培養(yǎng)基），置于37℃、CO2體積分數(shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細胞生長狀況，及時更換培養(yǎng)基。待細胞生長密度達80 %時，0.25%胰蛋白酶消化，進行傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的Hela細胞，以每孔1×105個接種于6 孔板中。待細胞生長密度達60%時，更換不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，分別將PCNAAS1 小干擾RNA（si-PCNA-AS1）、亂序無意義陰性序列（si-NC）、PCNA-AS1 過表達載體（pcDNAPCNA-AS1）、空載體（pcDNA）轉染至Hela細胞，具體轉染步驟參照LipofectamineTM 2000 試劑盒說明書。轉染6h 后，更換為常規(guī)培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至48h，收集細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細胞分組 Hela細胞分為對照組（Con 組）、低劑量褐藻多糖硫酸酯組（Fucoidan-L 組）、中劑量褐藻多糖硫酸酯組（Fucoidan-M 組）和高劑量褐藻多糖硫酸酯組(Fucoidan-H 組)。Con 組細胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；Fucoidan-L 組、Fucoidan-M 組和Fucoidan-H 組細胞分別用含0.2、0.4、0.8 mg/ml[9]褐藻多糖硫酸酯的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。轉染si-PCNAAS1、si-NC的細胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，分別記為si-PCNA-AS1 組和si-NC 組。轉染pcDNA-PCNAAS1、pcDNA的細胞用含0.8mg/ml 褐藻多糖硫酸酯的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，分別記為Fucoidan+pcDNAPCNA-AS1 組和Fucoidan+pcDNA 組。

1.2.3 細胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測細胞增殖Hela細胞及轉然后的細胞，以每孔5×103個接種于96 孔板中。按照1.2.2 分組處理，每組設置3 個復孔。培養(yǎng)24h 后,每孔加入10μl CCK-8 試劑，繼續(xù)孵育4h,酶標儀450nm 處測定吸光度值（absorbance，A），并計算細胞抑制率。細胞抑制率（%）=（A對照組-A 實驗組）/A對照組×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 Hela細胞及轉然后的細胞，以每孔2.5×104個接種于24 孔板中。按照1.2.2 分組處理，每組設置3 個復孔。培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化，收集細胞。取1.0×106個細胞，適量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次，1500r/min 離心5min，吸棄PBS。加入500μl 結合緩沖液，移液器輕輕吹打，混懸細胞后加入10μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10min。再加入5μl PI，混勻，室溫避光孵育10 min 后，上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 Western Blot 法檢測細胞中CyclinD1、p21、Bax和Bcl-2蛋白表達 Hela細胞及轉然后的細胞，以每孔2.5×104個接種于24 孔板中。按照1.2.2分組處理，每組設置3 個復孔。培養(yǎng)24h 后，吸棄培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化，收集細胞。RIPA細胞裂解液提取細胞中總蛋白，BCA 法測定蛋白含量后進行定量。取適量蛋白溶液,100℃煮沸5min。取30μg蛋白進行上樣，行10 %十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。蛋白分離后，電轉移至聚偏乙烯二氟（PVDF）膜，于5 %脫脂牛奶中封閉2h。分別加入CyclinD1（稀釋比1:1000）、p21（稀釋比1:1000）、Bax（稀釋比1:8000）、Bcl-2（稀釋比1:8000）和GAPDH（稀釋比1:1000）抗體，4℃孵育過夜。TBST 洗膜3 次，每次5min。加入辣根過氧化酶標記的二抗（稀釋比1:3000），37℃孵育1h。TBST洗膜3 次，每次5min。加入ELC 顯影液，避光顯影。凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照后，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH 為內參，計算目的蛋白的相對表達水平。

1.2.6 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測PCNAAS1基因表達 Trizol 試劑提取細胞中總RNA，微量核算儀檢測RNA的純度和濃度。參照逆轉錄試劑盒，將RNA 合成為cDNA。以cDNA 為模板，進行PCR 擴增。擴增程序：95℃預變性5min，95℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s,共進行35 個循環(huán)。PCNA-AS1 正向引物5'-GT AGGTGTCGAAGCCCTCAG-3'，反向引物5'-GAAGCCGAAA CCAGCTAGAC-3'；GAPDH 正向引 物5'-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3'，反向引物5'-AGATCCACAACGGA TACATT-3'。以GAPDH 為內參，2－△△Ct法計算PCNA-AS1基因的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析 利用SPSS.22.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示。兩組間比較采用獨立樣本t 檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 褐藻多糖硫酸酯對宮頸癌Hela細胞增殖的影響與Con 組比較，不同劑量Fucoidan 組細胞抑制率顯著升高（P<0.05），CyclinD1蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),p21蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),且不同劑量Fucoidan 組間兩兩比較各檢測指標差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖1和表1。

圖1 Western Blot 檢測褐藻多糖硫酸酯作用Hela細胞后CyclinD1和p21蛋白表達

表1 褐藻多糖硫酸酯對Hela細胞增殖及CyclinD1和p21蛋白表達的影響（，n=9）

表1 褐藻多糖硫酸酯對Hela細胞增殖及CyclinD1和p21蛋白表達的影響（，n=9）

注：與Con 組比較，*P<0.05；與Fucoidan-L 組比較，#P<0.05；與Fucoidan-M 組比較，&P<0.05。

2.2 褐藻多糖硫酸酯對宮頸癌Hela細胞凋亡的影響與Con 組比較，不同劑量Fucoidan 組細胞凋亡率顯著升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），Bax蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），且不同劑量Fucoidan 組間兩兩比較各檢測指標差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2和表2。

表2 褐藻多糖硫酸酯對Hela細胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達的影響（，n=9）

表2 褐藻多糖硫酸酯對Hela細胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達的影響（，n=9）

注：與Con 組比較，*P<0.05；與Fucoidan-L 組比較，#P<0.05；與Fucoidan-M 組比較，&P<0.05。

圖2 褐藻多糖硫酸酯對Hela細胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

2.3 褐藻多糖硫酸酯對宮頸癌Hela細胞中PCNA-AS1表達的影響與Con 組比較,不同劑量Fucoidan 組細胞中PCNA-AS1表達水平顯著降低（P<0.05）,且不同劑量Fucoidan 組間兩兩比較PCNA-AS1 差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 褐藻多糖硫酸酯對Hela細胞中PCNA-AS1表達的影響（，n=9）

表3 褐藻多糖硫酸酯對Hela細胞中PCNA-AS1表達的影響（，n=9）

注：與Con 組比較，*P<0.05；與Fucoidan-L 組比較，#P<0.05；與Fucoidan-M 組比較，&P<0.05。

2.4 干擾PCNA-AS1表達對宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡的影響 si-PCNA-AS1 組Hela細胞中PCNA-AS1表達水平顯著低于si-NC 組（P<0.05），表明PCNA-AS1 小干擾RNA 轉染成功，細胞中PCNA-AS1表達受到干擾。與si-NC 組比較，si-PCNA-AS1 組Hela細胞抑制率、凋亡率顯著升高（P<0.05），CyclinD1和Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），p21和Bax蛋白表達水平顯著升高（P<0.05）。見圖3和表4。

表4 干擾PCNA-AS1表達對Hela細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響（，n=9）

表4 干擾PCNA-AS1表達對Hela細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響（，n=9）

注：與si-NC 組比較，*P<0.05。

圖3 干擾PCNA-AS1表達對Hela細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響

2.5 PCNA-AS1 過表達逆轉褐藻多糖硫酸酯對宮頸癌Hela細胞增殖和凋亡的作用與Fucoidan+pcDNA 組比較，F(xiàn)ucoidan+pcDNA-PCNA-AS1 組Hela細胞抑制率、凋亡率顯著降低（P<0.05），CyclinD1和Bcl-2蛋白表達水平顯著升高（P<0.05），p21和Bax蛋白表達水平顯著降低（P<0.05）。見圖4和表5。

表5 PCNA-AS1 過表達逆轉褐藻多糖硫酸酯對Hela細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響（，n=9）

表5 PCNA-AS1 過表達逆轉褐藻多糖硫酸酯對Hela細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響（，n=9）

注：與Con 組比較，*P<0.05；與Fucoidan+pcDNA 組比較，#P<0.05。

圖4 PCNA-AS1 過表達逆轉褐藻多糖硫酸酯對Hela細胞增殖、凋亡及相關蛋白表達的影響

3 討論

褐藻多糖硫酸酯又被稱為褐藻糖膠或巖藻聚糖，是一種水溶性雜多糖。研究顯示，褐藻多糖硫酸酯可在體外抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并促進腫瘤細胞凋亡，這與其上調細胞中circFLNA表達有關[10]。褐藻多糖硫酸酯可抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲能力，其可能通過抑制上皮-間質轉化（EMT）過程發(fā)揮作用，可能是人類乳腺癌的潛在治療藥物[11]。本研究顯示不同濃度的褐藻多糖硫酸酯可顯著抑制Hela細胞增殖，并誘導細胞凋亡，提示褐藻多糖硫酸酯具有抗宮頸癌的作用。CyclinD1 是細胞周期相關蛋白，其表達升高促進細胞周期進程[12]。p21是腫瘤抑制因子，可與細胞周期相關蛋白形成復合物阻滯細胞周期進程[13]。本研究顯示，褐藻多糖硫酸酯可降低Hela細胞中CyclinD1蛋白表達，促進p21蛋白表達，提示褐藻多糖硫酸酯可能通過調控細胞周期相關蛋白的表達抑制細胞增殖。Bax為促凋亡蛋白，Bcl-2 為抗凋亡蛋白,二者參與細胞凋亡[14]。本研究顯示,褐藻多糖硫酸酯可降低Hela細胞中Bcl-2蛋白表達，促進Bax蛋白表達，提示褐藻多糖硫酸酯誘導Hela細胞凋亡與調控Bax和Bcl-2蛋白表達有關。

本研究還顯示，褐藻多糖硫酸酯作用Hela細胞后，細胞中PCNA-AS1表達水平顯著降低，提示PCNA-AS1 可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程。PCNA-AS1 是近年來新發(fā)的一種lncRNA，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。研究顯示，結直腸癌組織中PCNA-AS1表達升高，其高表達與腫瘤侵襲和TNM 分期密切相關，可能是診斷結直腸癌的潛在腫瘤生物標志物[15]；PCNA-AS1在非小細胞肺癌（NSCLC）組織和細胞系中表達上調，過表達PCNA-AS1 可促進NSCLC細胞增殖和細胞周期進程，干擾PCNA-AS1表達則抑制NSCLC細胞增殖和細胞周期進程，其可以作為NSCLC的治療靶標[16,17]。目前，PCNA-AS1對宮頸癌細胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究通過轉染PCNA-AS1 小干擾RNA 干擾Hela細胞中PCNA-AS1表達后，細胞增殖能力降低，凋亡家居，說明干擾PCNA-AS1表達可抑制Hela細胞增殖并誘導細胞凋亡，提示PCNA-AS1 可能也是潛在治療宮頸癌的分子靶點。為了進一步探討褐藻多糖硫酸酯發(fā)揮抗宮頸癌作用的分子機制，本研究使用褐藻多糖硫酸酯作用PCNA-AS1 過表達的Hela細胞，結果顯示，與只使用褐藻多糖硫酸酯干預的細胞比較，Hela細胞活性顯著升高，凋亡率顯著降低，說明過表達PCNAAS1 降低了褐藻多糖硫酸酯對Hela細胞增殖的抑制作用及凋亡促進作用，提示褐藻多糖硫酸酯通過下調PCNA-AS1表達發(fā)揮抗宮頸癌作用。

綜上所述,褐藻多糖硫酸酯可抑制宮頸癌細胞增殖，并促進細胞凋亡，發(fā)揮抗宮頸癌作用，其作用機制可能與下調細胞中PCNA-AS1表達有關。