郭駿騏，張 淼，曹文正，于 澎，高紅梅

（長春中醫(yī)藥大學藥學院，長春 130117）

中藥飲片系指在中醫(yī)藥理論指導下，根據(jù)辨證施治及調(diào)劑、制劑的需要，將中藥材加工炮制成具有一定形狀、規(guī)格的制成品[1]。作為直接原料藥，飲片的質(zhì)量至關重要[2]。多組分含量測定[3]、指紋圖譜一致性評價[4]、化學計量學[5]等多種模式被廣泛應用于中藥原料及其相關產(chǎn)品的質(zhì)量評價中。關于飲片等級劃分的依據(jù)，多以外觀性狀結(jié)合化學成分含量為主。此外，基于成分-生物活性的評價指標也在飲片分級研究中得到應用[6-8]。防風為傘形科植物防風Szposhnikvia divaricata(Turcz.) Schischk.未抽花莖的干燥根，具有祛風解表、勝濕止痛、止痙之功效[9]。目前關于藥材的等級標準只在《七十六種藥材商品規(guī)格標準》中有收載，指標比較單一[10]。研究[11-13]依照不同的分類依據(jù)和分級方法，建立了對于防風的不同質(zhì)量評價標準。本研究選取不同批次的防風飲片為研究對象，對飲片外觀性狀及內(nèi)在質(zhì)量中的多個指標進行考察，并進行統(tǒng)計學分析，對防風飲片的質(zhì)量進行全面評價，篩選表征內(nèi)在質(zhì)量的外觀性狀指標，采用聚類分析對所選飲片進行等級劃分，以期為防風飲片的質(zhì)量和等級研究提供合理依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑 儀器：LC-2030型高相液相色譜儀，日本島津公司；Hypersil ODS2 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），大連依利特分析儀器有限公司；FA1204B型萬分之一電子天平，上海精密科學儀器有限公司；AB135-S型十萬分之一分析天平，瑞士梅特勒－托利多公司；3NH-TS6010 臺式分光測色儀，深圳市三恩時科技有限公司；標康SL01-22 數(shù)顯游標卡尺（杭州標康科技有限公司）。試劑：升麻素苷對照品，上海源葉生物科技有限公司，批號Y24S6H3805，純度98%；5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品，上海源葉生物科技有限公司，批號P05M8F35478，純度98%。甲醇為色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號 185366；乙腈為色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號 186341；水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

1.2 樣品 本研究收集的30 批防風飲片，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學蔡廣知副教授鑒定均為傘形科植物防風Szposhnikvia divaricata（Turcz.）Schischk.的干燥根的炮制加工品。其中，來自安國市一方藥業(yè)有限公司的產(chǎn)于河北的藥材批號是18120203、CP17051901、18110606；安國市聚藥堂藥業(yè)有限公司的產(chǎn)于內(nèi)蒙的藥材批號是1805006、1803001、1809002；安國市譽林藥業(yè)有限公司的產(chǎn)于吉林的藥材批號是180301、180902、180503；安國祁安藥業(yè)有限公司的產(chǎn)于河北的藥材批號是180403、181102、181201；安徽省金芙蓉中藥飲片有限公司的產(chǎn)于內(nèi)蒙的藥材批號是03-19010101、180101、02-19010101；河北仁心藥業(yè)有限公司的產(chǎn)于內(nèi)蒙的藥材批號是13017024、13018003、13017029；安國市同義中藥飲片有限公司的產(chǎn)于河北的藥材批號是18040047、19010002、18110154；河北安國振宇藥業(yè)有限公司的產(chǎn)于河北的藥材批號是190101、171201、181202；河北祁新中藥顆粒飲片有限公司的產(chǎn)于內(nèi)蒙的藥材批號是20170902、20181201、20180501；安國市祁澳中藥飲片有限公司產(chǎn)于內(nèi)蒙的藥材批號是1711541111、1803541113、1805541132。共30 批，編號是1-30。

2 方法及結(jié)果

2.1 防風飲片外觀性狀參數(shù)測定

2.1.1 形態(tài)學測定 防風飲片為圓形或橢圓形的厚片，每批樣品隨機選取3組，每組100個飲片作為測量對象，以飲片外周最寬處兩端的距離作為直徑，測量并記錄，并計算每批樣品的平均直徑。結(jié)果見表1。

2.1.2 顏色測定 1）測色模式，反射光；2）測色空間，采用L*、a*、b*色空間，其中L*代表亮度，a*代表紅-綠色，b*代表藍-黃色，E*ab 代表總色差，公式為E*ab=（L*2+a*2+b*2）1/2；3）測定徑，4 mm；4）觀察視野，10°；5）觀察光源，D65 光（代表自然日光，色溫度6504 k），光源為CIE（國際照明委員會）認可。取防風飲片細粉適量，在D65 光、A 光（代表白熾燈光，2856 k）光源下分別測定顏色，其他參數(shù)設定同上，每份樣品平行測定3 次，取平均值。結(jié)果見表1。

表1 防風飲片外觀性狀測定結(jié)果

2.2 浸出物測定 照醇溶性浸出物測定法《中國藥典》2020 版四部通則2201 項下的熱浸法測定[15]，用乙醇作溶劑。結(jié)果見表2。

2.3 指標性成分含量測定 按《中國藥典》2020 版一部防風項下含量測定方法進行測定，測定結(jié)果見表2，對照品及供試品圖譜見圖1。

表2 浸出物及指標性成分含量測定結(jié)果 %

圖1 混合對照品（A）和供試品（B）HPLC 圖

2.4 相關性分析 采用SPSS 22.0 軟件對防風飲片直徑、顏色（L*、a*、b*、E*ab）、浸出物含量及升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量進行相關性分析。結(jié)果見表3。

表3 相關性分析結(jié)果

2.5 主成分分析（PCA）以防風飲片的直徑、顏色（L*、a*、b*、E*ab）、浸出物含量及升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量為變量，進行主成分分析。計算特征值及方差貢獻率，以特征值＞1為標準，提取到2 個主成分，累計方差貢獻率達到80.765%，可以代表樣品的大部分信息，結(jié)果表明不同產(chǎn)地的樣品之間有較大差異。詳細結(jié)果見表4、表5。

表4 主成分分析特征值及方差貢獻率 %

表5 主成分分析因子載荷矩陣

圖2 防風飲片PCA 得分圖

2.6 正交偏最小二乘法判別分析（OLPS-DA）以防風飲片的直徑、顏色（L*、a*、b*、E*ab）、浸出物含量及升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量為變量，導入SIMCA 14.1 軟件進行正交偏最小二乘法判別分析。在構(gòu)建的OLPS-DA 模型中，累計解釋能力參數(shù)RX2cum 和RY2cum 分別為0.724 和0.878，預測能力參數(shù)Q2cum 為0.785，表明模型的穩(wěn)定性和預測能力較好，可用于樣品差異的分析。由OLPS-DA得分圖可知，與主成分分析結(jié)果相似，30 批樣品能夠被明顯地區(qū)分開，見圖3。繪制變量重要性投影圖（variable importance in projection，VIP），以VIP 值>1為度，篩選關鍵變量。在所測定的所有指標中，浸出物（VIP=1.80）、L*（VIP=1.62）及E*ab（VIP=1.45）均大于1，可以認為在2 組樣品差異產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。見圖4。

圖3 防風飲片OLPS-DA 得分圖

圖4 防風飲片各指標的VIP 值

2.7 防風飲片等級劃分 初步選擇直徑、L*及E*ab3個指標參與防風飲片的等級劃分，采用SPSS 22.0 軟件，采用組間聯(lián)接法，以歐式平方距離為測度，對30批樣品進行進行系統(tǒng)聚類分析和K-均值聚類分析。由圖5 可知，當聚類距離為15 時，所有樣品被分為2 類，與PCA 分析及OLPS-DA 分析結(jié)果相似。其中FF-4～FF-6、FF-16～FF-18、FF-25～FF-30 等12 個樣品被聚為一類，其余18 個樣品被聚為另一類。見圖5。根據(jù)K-均值聚類分析結(jié)果，可初步將30 批防風飲片劃分為2 個等級。其中，一等防風飲片：直徑≤8.4cm，L*≤45.49，E*ab ≤60.27。二等防風飲片：直徑為8.4～10.6 cm，L*為45.49～54.19，E*ab 為60.27～67.03，見表6。按照最低定級原則，在所研究的30 批防風飲片中，無一等品；二等品有14 批（FF-4～FF-6，F(xiàn)F-9，F(xiàn)F-16～FF-9、FF-25～FF-30），其中僅FF-9 的藥材產(chǎn)地為吉林，F(xiàn)F-9 的藥材產(chǎn)地為河北，其余二等防風飲片的藥材產(chǎn)地均為內(nèi)蒙古。剩余的16批飲片均為統(tǒng)貨。分級結(jié)果經(jīng)過獨立樣本t檢驗，所劃分等級樣品質(zhì)量有顯著性差異（P＜0.01），表明分級依據(jù)合理、可靠。

圖5 防風飲片聚類分析圖

表6 防風飲片最終聚類中心

3 討論

本研究結(jié)果表明，防風飲片的直徑與其內(nèi)在含量有顯著的負相關關系。有學者發(fā)現(xiàn)，防風中4 種色原酮含量與根的直徑呈明顯的負相關[14]。本研究旨在尋找防風飲片中能夠表征內(nèi)在質(zhì)量的外觀性狀，將其作為指標參與等級劃分。結(jié)果表明，直徑以及顏色中的L*、E*ab 與內(nèi)在質(zhì)量相關性較大，可作為防風飲片分級研究的重要參考依據(jù)。

本研究對不同批次防風飲片的外觀性狀指標和內(nèi)在質(zhì)量指標進行檢測，并結(jié)合化學計量學方法，對所測內(nèi)、外指標進行分析。結(jié)果表明飲片間的差異主要是因為飲片來源藥材的產(chǎn)地不同。因此，對不同批次防風飲片的分析，揭示了飲片質(zhì)量與其來源藥材的產(chǎn)地具有一定的相關性，可為防風飲片質(zhì)量評價以及防風藥材種植基地選擇提供依據(jù)。