高 銘，王 晴，雷 蕾，柳 嘉，丁方莉，曹續(xù)東，苑 鵬，段盛林*

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.功能主食創(chuàng)制與慢病營養(yǎng)干預北京市重點實驗室，北京 100015；3.寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江寧波 315012）

紅曲是以固體營養(yǎng)物（通常為米）為底物，利用紅曲霉（Monascus ruber）發(fā)酵得到的固體發(fā)酵產(chǎn)物。研究表明，紅曲含有豐富的莫納可林K（Monacolin K）、紅曲色素、麥角甾醇等活性物質(zhì)[1]，具有抗氧化、抑制膽固醇合成等功效，可有效預防心腦血管疾病[2]。其中，紅曲米是最常見的紅曲產(chǎn)物，是中國傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，被廣泛應用于釀酒、食品著色和發(fā)酵等方面[3]。近年來出現(xiàn)了以山藥、蕎麥、燕麥、玉米等淀粉含量較多的物質(zhì)作為新的固態(tài)基質(zhì)進行紅曲發(fā)酵的探索[4]。可見，采用具有一定功效的原料進行發(fā)酵已成為紅曲發(fā)酵的新趨勢。

與常見食品形態(tài)相比，紅曲產(chǎn)品中膠囊、片劑產(chǎn)品數(shù)量更多，主要原因在于紅曲發(fā)酵后的顏色、氣味和味道發(fā)生了改變，發(fā)酵導致的苦味、澀味以及不愉快的氣味等影響了紅曲發(fā)酵產(chǎn)品直接食用的范圍。因此，針對紅曲發(fā)酵對紅曲產(chǎn)物感官影響的研究十分重要。傳統(tǒng)感官評定需要至少十位經(jīng)過培訓的感官評定員對隨機編號的樣品進行感官質(zhì)量評定，并依據(jù)評分表對各樣品每個方面打分[5-6]。這種方法對感官評定員的依賴性較大，并且評價結(jié)果因評分表內(nèi)容、色香味相互影響、樣品狀態(tài)等因素的變化而出現(xiàn)較大差異[7]。因而與傳統(tǒng)感官評定相比，電子感官檢測技術(shù)具有重復性好、結(jié)果客觀且感官不疲勞等優(yōu)點[8]。

電子感官技術(shù)一般包括電子舌、電子鼻和色差儀等[8]。電子舌可以分析揮發(fā)性較低的可溶性化合物，通過數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，把食物、藥品等樣品的味道轉(zhuǎn)化成數(shù)值的形式[9]。胡榮鎖等[10]用電子舌判別了三種不同干燥方式獲得的咖啡的風味，并剖析了各加工方式對咖啡品質(zhì)的影響。電子鼻根據(jù)仿生原理，模仿哺乳動物嗅覺系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和機理，分析、識別和檢測復雜嗅味和揮發(fā)性成分[11]。許春華等[12]采用電子鼻和電子舌檢測4 種酒樣，并結(jié)合主成分分析（principal component analysis，PCA）和判別因子分析兩種識別方法評價果酒的風味，其分析結(jié)果與人工感官評價結(jié)果一致。色差儀可以自動檢測樣品與標準樣間的顏色差異，直接輸出CIELAB 模式（是國際照明委員會于1976 年公布的一種色彩模式）的L*、a*、b*三組數(shù)據(jù)[13]。周蓉等[14]通過測定番茄的L*、a*、b*值與番茄紅素含量，建立了一種用色差儀分析番茄中番茄紅素含量的方法。而現(xiàn)有的紅曲發(fā)酵感官研究多為傳統(tǒng)感官評定，未見以電子感官評價為手段的研究報道。

本實驗分別以5 種可作為紅曲霉發(fā)酵底物的常見食物（大米、紫薯、土豆、牛蒡和蘋果）進行紅曲發(fā)酵，得到了紅曲發(fā)酵產(chǎn)物。5 種食物使用色差儀、電子舌和電子鼻對發(fā)酵前后底物的感官變化進行測定，并對電子感官測定數(shù)據(jù)進行PCA 分析以及雙樣本t 檢驗，得到紅曲發(fā)酵感官變化特點，以期為紅曲發(fā)酵底物品種的開發(fā)提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

大米、紫薯、蘋果、馬鈴薯、牛蒡，市售；紅色紅曲菌CICC 41183，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；麥芽浸粉肉湯、麥芽浸粉瓊脂、細菌瓊脂粉，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

TS-5000Z 電子舌，日本Insent 公司；Fox 4000 電子鼻，法國Alpha M.O.S 公司；SE-6000 分光色差計，日本電色公司；Spectra Max i3 酶標儀，美國Molecular Devices 公司；Gen Pure xCAD Plus 超純水系統(tǒng)，美國Thermofisher Scientific（賽默飛世爾）公司；MJ-250I 霉菌培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；DL-CJ-2ND I 潔凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紅曲種子液制備

紅色紅曲菌（CICC 41183）菌株經(jīng)麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)基活化培養(yǎng)5 d 后，接入液體搖瓶培養(yǎng)基進行液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，制備紅曲種子液。

1.2.2 紅曲固態(tài)發(fā)酵

大米淘凈后加入適量的蒸餾水；紫薯、土豆、蘋果、牛蒡洗凈，將原料蒸熟后放入潔凈工作臺中冷卻至30 ℃左右，分別去皮切成1 cm3的立方體。在超凈臺中以10%（v/w）接種量分別向裝有各原料的500 mL 錐形瓶中接入紅曲種子液（約106個/mL 孢子）。將錐形瓶置于培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)10 d，分別于50 ℃烘干后得到5 種紅曲發(fā)酵產(chǎn)物。

1.2.3 測試樣品前處理

同批次紫薯、土豆、蘋果、牛蒡洗凈后切塊，與大米分別于50 ℃烘干，粉碎后過60 目篩得到發(fā)酵前待測樣品，于實驗室陰涼處（20 ℃）儲存；紅曲發(fā)酵產(chǎn)物分別粉碎后過60 目篩，于陰涼處（20 ℃）儲存。

1.2.4 紅曲發(fā)酵產(chǎn)物顏色測定

分別稱取5 g 待測樣品于樣品池內(nèi)并用色差儀測定紅曲發(fā)酵前后樣品的顏色變化。用L*、a*、b*這3 個參數(shù)進行評價。

1.2.5 紅曲發(fā)酵產(chǎn)物風味測定

分別稱取1.5 g 各待測樣品于20 mL 頂空瓶內(nèi)，采用頂空取樣進行風味測定，電子鼻主機參數(shù)設置為取樣時間120 s，樣品延遲1 080 s，潔凈空氣流速150 mL/min，取樣體積4 mL，注射速度500 μL/s；自動進樣器參數(shù)設置為孵化時間600 s，孵化溫度40 ℃。

1.2.6 紅曲發(fā)酵產(chǎn)物口味測定

采用蒸煮水提的方法制備各紅曲發(fā)酵產(chǎn)物的水溶液。分別取紅曲發(fā)酵產(chǎn)物25 g 于500 mL 三角瓶中，用100 mL 蒸餾水浸泡蒸煮30 min，6 500 r/min 離心10 min，取上清液100 mL 分裝于2 個樣品杯中。在室溫（25 ℃）下用電子舌測定各樣品的口味，方法為電極清洗90 s→緩沖液清洗120 s→緩沖液清洗120 s→穩(wěn)定化30 s→測試樣品30 s→緩沖液清洗3 s→緩沖液清洗3 s→回味測定30 s。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 Teste sensing system TS-5000Z Analysis Application Ver170 對電子舌傳感器的分辨能力進行分析，采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用PCA 進行降維分析，采用雙樣本t 檢驗進行發(fā)酵前后對比分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵前后樣品顏色變化

在CIELAB 中，L*是亮度，a*（-a～+a，從綠色到紅色）和b*（-b～+b，從藍色到黃色）是色度坐標。

表1 為紅曲發(fā)酵前后樣品的顏色變化情況。由表知大米顏色變化最明顯，大米的L*值由92.65 降到34.15，說明發(fā)酵使大米的亮度降低；a*值由-1.1 提升到24.35，大米從略帶綠色的原米經(jīng)發(fā)酵變成了帶紅色的紅曲米；b*值由6.6 提升到14.33，可知大米發(fā)酵后黃色更深。整體分析5 個底物，由表可知，樣品發(fā)酵后L*值普遍降低，大多數(shù)底物的a*值和b*值均有不同程度上升，其中紫薯a*值略降低（從14.29 降低到13.15），可能因為紫薯本身紅色較深，影響了對紅曲色素的觀察。綜合以上分析，說明紅曲發(fā)酵后底物亮度降低，顏色普遍向紅色、黃色方向變化，可能是因為紅曲菌代謝產(chǎn)生了紅曲紅色素和紅曲黃色素[15]。

表1 紅曲發(fā)酵前后樣品顏色變化Table 1 The color of samples before and after red yeast fermentation

2.2 發(fā)酵前后樣品風味分析

2.2.1 原始數(shù)據(jù)分析

圖1 中不同曲線代表電子鼻不同傳感器的響應值隨時間的變化情況。通過分析各傳感器響應值的變化可以看出，部分傳感器在檢測初期即快速產(chǎn)生響應（上升或下降），40 s 后逐漸趨于平穩(wěn)而達到一個穩(wěn)定的狀態(tài)。

根據(jù)電子鼻儀器說明，傳感器原始信號大于1 說明信號過載，且要求T、P 型傳感器響應值在0.3 以上時，定性分析中樣品的差異信息可以更明顯地表現(xiàn)出來。根據(jù)圖1 可知，所有傳感器強度小于1，且大部分T、P 型傳感器的響應值在0.3 以上，可以較好地區(qū)分樣品間差異；圖中基線附近的響應曲線均來自LY2 型傳感器，說明LY2型傳感器對測試樣品幾乎不響應。

圖1 紅曲蘋果電子鼻傳感器響應圖Fig.1 The electronic nose sensor response diagram of red yeast apple

2.2.2 整體風味分析

Fox 4000 電子鼻傳感器可與氧化物、有機物（聚合物及衍生物）及其他氣味分子反應，產(chǎn)生信號[16]。傳感器共分為三類，LY2 類：LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/gCT、LY2/gCTL；P 類：PA/2、P30/1、P40/2、P30/2、P10/1、P10/2、P40/1；T 類：T30/1、T40/2、T40/1、TA/2、T70/2，具體如表2所示。

表2 FOX4000 電子鼻傳感器性能表Table 2 Electronic nose sensors performance of FOX4000

由圖2 可見，所有的發(fā)酵前樣品在LY2 類傳感器上響應值最強，且大多數(shù)紅曲發(fā)酵樣品與發(fā)酵前對比（如大米與紅曲米相比），LY2 類傳感器響應值區(qū)別不明顯，只有蘋果在被紅曲發(fā)酵后響應值出現(xiàn)了明顯降低，說明在LY2 類傳感器所涉及的氣味類型中，紅曲發(fā)酵過程對蘋果的影響程度最大；在T 類、P 類傳感器上，紅曲發(fā)酵后樣品與發(fā)酵前樣品相比，整體響應值均有不同程度上升，其中蘋果的氣味改變最大，紅曲蘋果的響應值明顯高于發(fā)酵前的蘋果，且氣味更均衡。綜合而言，紅曲發(fā)酵作用對于大米、紫薯、土豆、牛蒡和蘋果這5 種底物的氣味有明顯改變，整體上氣味增強，其中，發(fā)酵作用對蘋果風味的影響最大，且蘋果的風味變化最為獨特。

圖2 5 種樣品發(fā)酵前后氣味比較Fig.2 The odour comparison of the 5 samples before and after fermentation

2.3 發(fā)酵前后樣品口味分析

2.3.1 傳感器分辨能力分析

電子舌測定結(jié)果的誤差率分為兩種：一是傳感器誤差率（m1），表征同種樣品不同質(zhì)量濃度對測定結(jié)果的影響，m1/%=誤差平均值/各味道平均值；二是區(qū)別能力誤差率（m2），表征不同樣品對測定結(jié)果的影響，反映傳感器的區(qū)分能力（值越低樣品的區(qū)分性越好），m2/%=誤差平均值/樣品標準差。當m2≤50%時，傳感器能夠有效區(qū)分樣品中的味覺指標，否則判定測試數(shù)據(jù)無效。由表3 可知，每個味覺指標的m2均小于50%，說明傳感器對樣品進行了有效地區(qū)分。

表3 傳感器分辨能力分析Table 3 The resolution capability analysis of sensor

2.3.2 PCA 分析

利用PCA 分析，將紅曲發(fā)酵前后氣味、口味的多個指標轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個綜合指標。對電子鼻數(shù)據(jù)進行PCA 分析，提取出2 個主成分，通過成分系數(shù)矩陣可知，成分1 中較為重要的傳感器為T40/1，成分2 中較為重要的傳感器為PA/2 和P30/1，說明紅曲發(fā)酵可明顯增加底物的揮發(fā)性物質(zhì)，有獨特的紅曲發(fā)酵風味。對電子舌數(shù)據(jù)進行PCA分析，提取出3 個主成分，通過成分系數(shù)矩陣可知，成分1、2、3 中較為重要的味覺指標分別為澀回味、鮮味和澀味，說明各樣品之間的差異主要體現(xiàn)在澀回味和鮮味上。

2.3.3 口味變化分析

由圖3 可知，所有底物的味道都在經(jīng)過紅曲發(fā)酵后產(chǎn)生了明顯的變化。為了分析味覺變化程度，對實驗所得數(shù)據(jù)進行離差標準化，使得結(jié)果映射到[0,1]區(qū)間。其中大米的味道變化最大，甜味和澀味明顯減弱，苦味和苦回味明顯增強；紫薯、土豆、牛蒡也出現(xiàn)了較大的味覺變化，紫薯的澀回味、苦回味在發(fā)酵后明顯增強；土豆的酸味、鮮回味明顯增強，鮮味明顯降低；牛蒡酸味明顯增強，鮮味顯著降低。

圖3 5 個樣品發(fā)酵前后口味比較Fig.3 The flavor comparison of the 5 samples before and after fermentation

相較于其他底物，蘋果的各項味覺變化相對較為均衡。除蘋果外，其余4 種底物經(jīng)過紅曲發(fā)酵后其酸味均有所上升，推測為紅曲發(fā)酵過程中微生物作用使結(jié)合態(tài)的酚酸類物質(zhì)游離所致，這與實驗室前期得到的紅曲發(fā)酵后底物中多酚含量上升的結(jié)果相符。而蘋果在發(fā)酵前含有檸檬酸、蘋果酸和酒石酸等有機酸，在發(fā)酵過程中，有機酸結(jié)構(gòu)被破壞，故酸味降低[17]。

紅曲發(fā)酵后，底物中的蛋白質(zhì)被分解成的游離氨基酸呈現(xiàn)苦味，紅曲菌產(chǎn)生的次級代謝物也具有一定的苦味，因此5 種底物的苦味與苦回味有不同程度上升[2]，其中蘋果、土豆的苦味變化相對較小。

2.4 雙樣本t 檢驗

選取電子鼻、電子舌PCA分析中得分較高的6 個指標（PA/2、P30/1、T40/1、澀味、澀回味、鮮味）與味覺分析中有普遍提升的苦味、苦回味，對5 個底物發(fā)酵前后的數(shù)據(jù)分別做t 檢驗分析，結(jié)果見表4。由表4 可知，整體而言，發(fā)酵過程使得所有底物的氣味和味道都發(fā)生了明顯的變化；少數(shù)底物的具體類型氣味及味覺變化不明顯。例如，蘋果發(fā)酵后苦味、澀回味增加不明顯，是所有底物中唯一苦味變化不明顯的發(fā)酵底物，因此，可以考慮以蘋果為底物進行紅曲發(fā)酵，得到紅曲發(fā)酵產(chǎn)品；大米發(fā)酵前后，氣味有明顯變化；苦味、苦回味、澀味變化顯著，澀回味、鮮味變化不明顯。

表4 雙樣本t 檢驗分析結(jié)果Table 4 The results of two sample test

3 結(jié)論

可食用植物資源種類繁多，其營養(yǎng)組成與組織結(jié)構(gòu)各不相同，紅曲發(fā)酵常選擇淀粉含量較多或含糖量較高的植物材料為發(fā)酵底物。與傳統(tǒng)感官評定相比，電子感官結(jié)果可用于對紅曲發(fā)酵顏色、風味、味道等細節(jié)方面的調(diào)整。

本試驗對所選的大米、紫薯、土豆、蘋果和牛蒡5 種植物材料紅曲發(fā)酵前后的色香味進行了比較分析。結(jié)果表明，紅曲發(fā)酵后，大部分底物亮度降低，整體顏色向紅、黃偏移；整體風味有所提升；苦味及苦回味均有所增加。其中，大米的顏色變化最大，常用于紅曲色素生產(chǎn)；蘋果的風味變化更好，苦味增加最不明顯，可用作食用紅曲發(fā)酵底物。