張晶晶 努爾艾合麥提江·牙力昆 杜 鵬

新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，新疆烏魯木齊 830063

與體細(xì)胞代謝比較，腫瘤細(xì)胞多采用有氧糖酵解的形式進(jìn)行代謝，這種代謝表型稱為瓦博格效應(yīng)[1-2]。在多種腫瘤中觀察到酵解酶[包括葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同工型1（glucose transporter 1，GLUT1）、己糖激酶2（human hexokinase-2，HK2）和乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase，LDHA）]的表達(dá)活性升高[2]。缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF1α）是一種細(xì)胞適應(yīng)氧應(yīng)激的關(guān)鍵介質(zhì)[3]。HIF1α 通過(guò)在其啟動(dòng)子區(qū)域與HIF1α 反應(yīng)元件（hypoxia response element，HRE）結(jié)合來(lái)增強(qiáng)糖酵解基因的表達(dá)[3]。HIF1α 的表達(dá)受到包括泛素化途徑在內(nèi)的多種方式影響[4]。UBE4B作為一種重要的泛素化E3 連接酶已被證明可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的代謝重編程并促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[5]。微小RNA（microRNA，miRNA）通過(guò)與信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3’-非翻譯區(qū)（3’untranslated region，3’-UTR）結(jié)合從而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)[6]。miR-9-5p 已顯示在包括乳腺癌、肺癌和胃癌的發(fā)展中起關(guān)鍵作用[7-9]。因此，本研究旨在探索miR-9-5p 在腫瘤發(fā)生中的作用，并深入探討UBE4B/HIF1α 在miR-9-5p 調(diào)控膠質(zhì)瘤及瓦博格效應(yīng)中的作用機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的治療思路提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本、細(xì)胞及動(dòng)物

2018 年5 月至2020 年10 月收集30 例來(lái)自新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）確診患者的神經(jīng)膠質(zhì)瘤及癌旁組織。研究設(shè)計(jì)得到我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞（U251 細(xì)胞）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心（中國(guó)上海）。將細(xì)胞置于含血清及雙抗的DMEM 培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco，生產(chǎn)批號(hào)：0030034DJ）及5%的CO2和37°C 中培養(yǎng)。22 只5 周齡的雄性BALB/c 裸鼠購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[許可證：SCXK（滬）2017-0006；質(zhì)量合格證號(hào)：60304257]。

1.2 RNA 提取和實(shí)時(shí)定量PCR

根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用miRcute miRNA 試劑盒（中國(guó)天根，貨號(hào)：DP501）從組織或細(xì)胞中提取miRNA。使用miScript SYBR Green PCR Kit（天根，生產(chǎn)批號(hào)：FP411-02）測(cè)定miR-9-5p 的表達(dá)水平。使用Applied Biosystems 7300 實(shí)時(shí)PCR 系統(tǒng)進(jìn)行定量實(shí)時(shí)PCR，內(nèi)參基因分別為GAPDH 和U6。

1.3 蛋白質(zhì)印跡

使用蛋白提取試劑盒提取蛋白質(zhì)，然后使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒（中國(guó)碧云天，貨號(hào)：P0012S）對(duì)樣品的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。封閉后，用抗UBE4B 抗體（美國(guó)Abcam，生產(chǎn)批號(hào)：ab126759），HIF1α（美國(guó)Abcam，生產(chǎn)批號(hào)：ab270520）和β-actin（美國(guó)Abcam，生產(chǎn)批號(hào)：ab6276），然后是辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗（美國(guó)Abcam，生產(chǎn)批號(hào)：ab151752）。通過(guò)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 葡萄糖攝取分析

將U251 細(xì)胞用磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate buffered saline，PBS）洗滌，然后在含有葡萄糖的DMEM 中孵育3 h。用冰冷的PBS 洗滌細(xì)胞，并溶解在1%的SDS中。使用閃爍計(jì)數(shù)器（美國(guó)Beckman LS 6500，CA）確定每個(gè)等分試樣的放射性。重復(fù)6 次。

1.5 乳酸產(chǎn)量測(cè)量

按照制造商的說(shuō)明方法，使用乳酸檢測(cè)試劑盒（中國(guó)碧云天，生產(chǎn)批號(hào)：P0012S）對(duì)U251 細(xì)胞乳酸的產(chǎn)生進(jìn)行定量。使用CellTiter-Glo?發(fā)光細(xì)胞活力測(cè)定試劑盒（中國(guó)澤浩生物，貨號(hào)：G7570）測(cè)量ATP水平。重復(fù)6 次。

1.6 細(xì)胞活力和增殖分析

通過(guò)MTT 法來(lái)確定細(xì)胞活力。同時(shí)使用細(xì)胞增殖酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（BrdU 試劑盒）（中國(guó)艾美杰，貨號(hào)：K306-200）來(lái)分析DNA 合成過(guò)程中生成的BrdU來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。重復(fù)6 次。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將穩(wěn)定表達(dá)miR-9-5p 模擬物和對(duì)照組的5.0×106U251 細(xì)胞皮下注射到裸鼠前腿下方的皮膚上。在16 d 內(nèi)觀察小鼠的腫瘤形成。然后處死小鼠，并確定每個(gè)腫瘤的濕重和體積。并按照“1.3”中方法對(duì)UBE4B、HIF1α 蛋白以及Glut1、HK2 和LDHA mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用t 檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-9-5p 對(duì)HIF1α 及糖酵解的影響

miR-9-5p 過(guò)表達(dá)組HIF1α 蛋白，Glut1、HK2、LDHA 和VEGF mRNA 表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；而HIF1α mRNA 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表1。miR-9-5p 抑制劑組HIF1α 蛋白，Glut1、HK2、LDHA 和VEGF 表達(dá)顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；而HIF1α mRNA 水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）。見(jiàn)表2。

表1 miR-9-5p 過(guò)表達(dá)對(duì)HIF1α 和糖酵解酶的表達(dá)的影響（）

表1 miR-9-5p 過(guò)表達(dá)對(duì)HIF1α 和糖酵解酶的表達(dá)的影響（）

注：HIF1α：缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1α；Glut1：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同工型1；HK2：己糖激酶2；LDHA：乳酸脫氫酶A；VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

表2 抑制miR-9-5p 對(duì)HIF1α 和糖酵解酶的表達(dá)的影響（）

表2 抑制miR-9-5p 對(duì)HIF1α 和糖酵解酶的表達(dá)的影響（）

注：HIF1α：缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子1α；Glut1：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同工型1；HK2：己糖激酶2；LDHA：乳酸脫氫酶A；VEGF：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

2.2 miR-9-5p 調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的葡萄糖代謝

與對(duì)照組比較，miR-9-5p 過(guò)表達(dá)組顯著增強(qiáng)了代謝及轉(zhuǎn)移（P ＜0.05），而miR-9-5p 抑制劑組顯著降低了U251 細(xì)胞中的葡萄糖攝取和乳酸生成（P <0.05）。見(jiàn)圖1A～D。

圖1 miR-9-5p 調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的葡萄糖代謝（n=6）

2.3 miR-9-5p 在體外促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖

增殖檢測(cè)顯示，miR-9-5p 過(guò)表達(dá)組在處理24 h和48 h 后的細(xì)胞活力顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）；而miR-9-5p 抑制劑組與對(duì)照組比較，細(xì)胞活力在24 h 和48 h 出現(xiàn)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖2A～D。

圖2 miR-9-5p 促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖（n=6）

2.4 miR-9-5p 促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，miR-9-5p 過(guò)表達(dá)組的腫瘤體積和濕重顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖3A～B。進(jìn)一步分 析，miR-9-5p 過(guò)表達(dá)組 的UBE4B 的蛋白質(zhì)水平低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見(jiàn)圖3C。而HIF1α 及糖酵解相關(guān)基因（Glut1、HK2 和LDHA）的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.05）。見(jiàn)圖3D～E。

圖3 miR-9-5p 促進(jìn)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)

2.5 膠質(zhì)瘤組織中miR-9-5p 與糖酵解因子相關(guān)性

相關(guān)性分析顯示，miR-9-5p 的表達(dá)與Glut1（R2=0.4734，P=0.032）、HK2（R2=0.5837，P=0.004）和LDHA（R2=0.6217，P=0.016）水平呈正相關(guān)。

3 討論

膠質(zhì)瘤是腦中常見(jiàn)的腫瘤之一，占惡性腦腫瘤的80%[10]?；颊呓?jīng)常會(huì)出現(xiàn)嘔吐、頭痛、感覺(jué)障礙和反復(fù)發(fā)作，從而導(dǎo)致生活質(zhì)量下降。盡管已經(jīng)采用了影像學(xué)、手術(shù)、放射療法等新興方法進(jìn)行治療，但仍無(wú)法治愈[11-14]。因此，深入了解膠質(zhì)瘤的機(jī)制對(duì)其預(yù)防、診斷和治療具有重要意義。

已有研究顯示，miRNA 的失調(diào)可以改變包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞中關(guān)鍵糖酵解酶的表達(dá)和活性[15-19]。例如，miR-495 通過(guò)直接抑制Glut1 介導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的新陳代謝[20]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p能夠影響瓦博格效應(yīng)[21]，進(jìn)一步探討發(fā)現(xiàn)其與HIF1α的表達(dá)存在同向性且對(duì)其mRNA 的表達(dá)影響較弱，提示轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能是miR-9-5p 的主要調(diào)控途徑。通過(guò)對(duì)miR-9-5p 靶基因的預(yù)測(cè)與HIF1α 互作蛋白的分析，篩選出UBE4B 調(diào)控的HIF1α 泛素化可能是其中的重要作用途徑，這些觀點(diǎn)在本研究中得到了有效證明。目前已有多項(xiàng)報(bào)道證實(shí)泛素化調(diào)控在瓦博格效應(yīng)中的作用[22-25]，本研究創(chuàng)新性地對(duì)miR-9-5p在其上游的影響進(jìn)行了驗(yàn)證，這對(duì)未來(lái)的靶向治療提供了重要的參考依據(jù)。

綜上所述，miR-9-5p 可以通過(guò)UBE4B/HIF1α調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的瓦博格效應(yīng)，這些結(jié)果可能為癌癥治療提供新的靶向研究方向。