李 娜,高雙玉

(杭州中美華東制藥江東有限公司,浙江 杭州 310000)

阿卡波糖是Frommer等于上世紀(jì)70年代初從游動(dòng)放線菌(Actinoplanessp.SE50)的發(fā)酵液中提取而來,自1990年上市后在許多國家被用于Ⅱ型糖尿病的治療[1]。作為臨床治療Ⅱ型糖尿病類藥物,阿卡波糖具有作用機(jī)制新穎、臨床療效好和毒副作用小等特點(diǎn),市場前景廣闊[2]。

阿卡波糖作為企業(yè)一個(gè)重要的發(fā)酵產(chǎn)品,其菌種生產(chǎn)能力的保持及提高至關(guān)重要。由于阿卡波糖產(chǎn)生菌的繁殖方式為菌絲斷裂,不產(chǎn)生孢子,菌絲體為多核細(xì)胞,給菌株的純化帶來很大困難,導(dǎo)致產(chǎn)品生產(chǎn)過程中,難以篩選到高純度高產(chǎn)量的生產(chǎn)菌株。原生質(zhì)體是除去細(xì)胞壁的原生質(zhì),是單一的細(xì)胞,并且其由于沒有細(xì)胞壁的阻礙,誘變更加完全[3-5],因此筆者希望通過研究阿卡波糖產(chǎn)生菌原生質(zhì)體制備條件,為生產(chǎn)高產(chǎn)菌株的篩選和純化奠定基礎(chǔ)[6]。

1 材料與方法

1.1 菌 種

實(shí)驗(yàn)所用的菌種為猶他游動(dòng)放線菌(Actinoplanessp.),由公司提供。

1.2 培 養(yǎng) 基

無渣種子培養(yǎng)基(SM2)配方:可溶性淀粉1 g,葡萄糖1.5 g,酵母提取物1 g,麥芽提取物1 g,天冬氨酸0.05 g,甘油1 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,K2HPO40.1 g,CaCO30.2 g,用純化水定容至100 mL;pH調(diào)節(jié)至6.8;121 ℃滅菌30 min。用途:原生質(zhì)體制備一級、二級菌絲體的培養(yǎng)。

再生培養(yǎng)基配方:黃豆餅粉0.5 g,葡萄糖0.4 g,蔗糖4 g,甘油0.4 g,胰蛋白胨0.1 g,L-賴氨酸0.1 g,L-谷氨酸0.1 g,DL-丙氨酸0.1 g,麥芽提取物0.1 g,酵母提取物0.1 g,CaCl20.2 g,MgSO4·7H2O 0.8 g,K2HPO40.1 g,KCl 0.04 g,FeSO40.04 g,微量元素溶液0.7 mL,瓊脂1.5 g,用純化水定容至100 mL;pH調(diào)節(jié)至7.0,蒸餾水配置;121 ℃滅菌30 min。

平皿培養(yǎng)基配方:蔗糖3 g,蛋白胨0.5 g,KCl 0.15 g,K2HPO40.1 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,瓊脂1.5 g,用純化水定容至100 mL;pH調(diào)節(jié)至7.0,121 ℃滅菌30 min。

搖瓶種子培養(yǎng)基:玉米淀粉2.0 g,黃豆餅粉4.0 g,甘油2.0 g,碳酸鈣0.2 g,用飲用水定容至100 mL;pH調(diào)節(jié)至7.0,121 ℃滅菌30 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方:麥芽糖4 g,葡萄糖3 g,黃豆餅粉3 g,三氯化鐵0.15 g,磷酸氫二鉀0.2 g,碳酸鈣0.5 g,味精0.2 g,用飲用水定容至100 mL;pH調(diào)節(jié)至7.0,121 ℃滅菌30 min。

種子罐培養(yǎng)基配方:玉米淀粉2 kg,黃豆餅粉4 kg,甘油2 kg,碳酸鈣0.2 kg,泡敵100 mL,用飲用水定容至100 L;pH調(diào)節(jié)至7.0,121 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方:麥芽糖4 kg,葡萄糖3 kg,黃豆餅粉3 kg,三氯化鐵0.15 kg,磷酸氫二鉀0.2 kg,碳酸鈣0.5 kg,味精0.2 kg,泡敵100 mL,用飲用水定容至100 L;pH調(diào)節(jié)至7.0,121 ℃滅菌30 min。

補(bǔ)料培養(yǎng)基配方:葡萄糖7 kg,麥芽糖10 kg,味精0.3 kg,碳酸鈣0.5 kg,泡敵50 mL,用飲用水定容至100 L;121 ℃滅菌30 min。

1.3 試劑的配制

P穩(wěn)定液:蔗糖10.3 g,K2SO40.025 g,MgCl2·6H2O 0.2 g,微量元素溶液0.2 mL,用純化水定容至80 mL;121 ℃滅菌后加入3種單獨(dú)滅菌的成分:0.5%的K2HPO41 mL,3.68%的CaCl2·2H2O 10 mL,濃度0.25 mol/L Tris-HCl溶液(pH 7.2)10 mL。

濃度0.25 mol/L Tris-HCl溶液:稱量三羥甲基氨基甲烷3.03 g,用蒸餾水70 mL溶解后,用濃鹽酸調(diào)pH至7.2,然后定容至100 mL。

微量元素溶液:ZnCl20.04 g,FeCl30.2 g,CuCl2·2H2O 0.01 g,MnCl2·4H2O 0.01 g,Na2B4O7·10H2O 0.01 g,鉬酸銨0.01 g,加純化水100 mL。

溶菌酶溶液:稱取一定量溶菌酶,溶于10 mL P穩(wěn)定液中,然后過濾除菌,備用。

1.4 培養(yǎng)條件

搖瓶種子培養(yǎng):搖瓶種子培養(yǎng)基裝量為50 mL∶500 mL,用接種鏟從培養(yǎng)好的斜面培養(yǎng)基上取1 cm×1 cm的菌體至種子培養(yǎng)基中,然后置于28 ℃搖床恒溫培養(yǎng),搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng):搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的裝量為50 mL∶500 mL,30 ℃搖床恒溫培養(yǎng)168 h,搖床轉(zhuǎn)速為220 r/min,48～144 h間歇補(bǔ)料。

種子罐培養(yǎng):將培養(yǎng)好的搖瓶種子按0.2%的接種量接種至1 m3種子罐,裝液量為500 L,培養(yǎng)溫度28 ℃,溶氧不低于30%,培養(yǎng)44～48 h。

發(fā)酵罐培養(yǎng):將培養(yǎng)好的罐種子以10%的接種量接種至10 m3發(fā)酵罐,裝液量為5 m3,培養(yǎng)溫度30 ℃,溶氧不低于30%,發(fā)酵周期為168 h,48～144 h間歇補(bǔ)料。

1.5 器 材

SW-CJ-2F超凈工作臺(tái),購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;ZWYR-D2402恒溫?fù)u床,購自上海智城分析儀器制造有限公司;HH-2恒溫水浴鍋,購自常州市凱航儀器有限公司;CBIO-UV4B紫外誘變箱,購自北京賽百奧科技有限公司;SC-3616低速離心機(jī),購自安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;CX21顯微鏡,購自奧林巴斯;10 m3發(fā)酵罐,購自杭州賽富特設(shè)備有限公司,規(guī)格3.6 m×1.8 m。

1.6 實(shí)驗(yàn)和檢測方法

1.6.1 原生質(zhì)體制備的基本流程

將甘油管菌種接種于無渣種子培養(yǎng)基(SM2)中,培養(yǎng)結(jié)束后,吸取2 mL菌液轉(zhuǎn)入含有適量甘氨酸的無渣種子培養(yǎng)基(SM2)中,培養(yǎng)一定時(shí)間后取該培養(yǎng)液10 mL于25 mL離心管中,3 000 r/min離心10 min,棄上清,沉淀用P穩(wěn)定液洗3次,加入終質(zhì)量濃度為3 mg/mL的溶菌酶溶液2 mL,37 ℃水浴中保溫,每隔約10 min輕輕振蕩試管1次;鏡檢觀察原生質(zhì)體生成情況,當(dāng)大多數(shù)菌體脫去細(xì)胞壁,呈現(xiàn)單一的原生質(zhì)體球時(shí),停止酶解反應(yīng)。將濾液轉(zhuǎn)入另一離心管中,3 000 r/min離心8 min,用P穩(wěn)定液懸浮沉淀,即為原生質(zhì)體懸液。

1.6.2 紫外誘變方法

實(shí)驗(yàn)采用的物理誘變方式為紫外線照射[7-11]。取制備好的原生質(zhì)體懸液8 mL于直徑9 cm的帶無菌攪拌子的平皿中,蓋上皿蓋,在事先預(yù)熱好的15 W紫外燈下30 cm處照射10 min,進(jìn)行培養(yǎng)皿的表面消毒;之后開啟磁力攪拌器,打開皿蓋,邊攪拌邊照射,照射一定時(shí)間后蓋上平皿蓋取出。在紅外燈下稀釋涂平皿,將涂好的平皿用黑布包好,置于恒溫培養(yǎng)箱中,28 ℃培養(yǎng),至長出成熟菌落,計(jì)菌落數(shù)同時(shí)統(tǒng)計(jì)不同紫外照射時(shí)間的致死率。

1.6.3 菌體體積分?jǐn)?shù)的測定

將菌液搖勻,用移液管準(zhǔn)確吸取10 mL置于離心管中3 500 r/min,離心15 min,取上清液轉(zhuǎn)移至量筒中測量體積。計(jì)算公式為

1.6.4 阿卡波糖發(fā)酵單位的測定

采用高效液相色譜法測定阿卡波糖的發(fā)酵單位[12],HPLC色譜條件如下:色譜柱為氨基柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為V(0.01 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.0))∶V(乙腈)=30∶70,流速為1.5 mL/min,檢測波長為210 nm,柱溫為35 ℃,進(jìn)樣量為10 μL。

2 原生質(zhì)體制備條件

在原生質(zhì)體制備的過程中,菌體一級培養(yǎng)時(shí)間、二級培養(yǎng)時(shí)間、甘氨酸的質(zhì)量濃度、溶菌酶的質(zhì)量濃度和酶解時(shí)間等要素是最終原生質(zhì)體制備量的關(guān)鍵影響因素[13-15]。因此,針對阿卡波糖產(chǎn)生菌株猶他游動(dòng)放線菌(Actinoplanessp.),對以上幾個(gè)因素依次進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。

2.1 一級培養(yǎng)時(shí)間

實(shí)驗(yàn)制備原生質(zhì)體時(shí)先采用無渣種子培養(yǎng)基(SM2)進(jìn)行一級培養(yǎng),再用無渣種子培養(yǎng)基(SM2)進(jìn)行菌絲體的二級培養(yǎng),一級培養(yǎng)的菌絲進(jìn)入穩(wěn)定生長期時(shí)轉(zhuǎn)接二級培養(yǎng),二級培養(yǎng)至穩(wěn)定生長期時(shí)的菌絲體用于制備原生質(zhì)體。

實(shí)驗(yàn)將冷凍甘油管保存的菌液倒入一級培養(yǎng)基中,并在一級培養(yǎng)過程中,每間隔4 h取樣并測定菌體濃度,具體結(jié)果如圖1所示。

圖1 一級培養(yǎng)時(shí)間Fig.1 The primary culture time

由圖1可以看出:在一級種子培養(yǎng)過程中,種子培養(yǎng)前期0～24 h菌體生長較緩慢,24 h之后菌體開始快速生長,培養(yǎng)至44～48 h時(shí)菌體體積分?jǐn)?shù)達(dá)到最高值,之后菌體體積分?jǐn)?shù)穩(wěn)定一定時(shí)間,培養(yǎng)52 h之后菌體體積分?jǐn)?shù)開始下降,說明此時(shí)菌體開始逐漸衰老,因此一級培養(yǎng)時(shí)間確定為44～48 h,此時(shí)菌體數(shù)量多且活力較強(qiáng)。

2.2 二級培養(yǎng)甘氨酸添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)

二級培養(yǎng)是制備原生質(zhì)體最關(guān)鍵的一步,培養(yǎng)過程中需加入適量的甘氨酸,這是因?yàn)楦拾彼峥梢源姹彼釁⑴c細(xì)胞壁合成初期短肽的合成,干擾細(xì)胞壁肽聚糖的相互交聯(lián),便于形成原生質(zhì)體[16-19]。培養(yǎng)基中若添加甘氨酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過小,菌絲體對溶菌酶不敏感,形成的原生質(zhì)體數(shù)量很少,但加入甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)過大時(shí),會(huì)對細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞,導(dǎo)致原生質(zhì)體數(shù)量會(huì)下降。因此,本實(shí)驗(yàn)研究了二級培養(yǎng)時(shí)添加不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甘氨酸對菌絲體生長的影響以及二級培養(yǎng)的時(shí)間。

將一級培養(yǎng)結(jié)束的菌懸液轉(zhuǎn)入二級培養(yǎng)基中,在二級培養(yǎng)用的無渣種子培養(yǎng)基(SM2)中分別加入甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0%,0.1%,0.2%,0.3%,0.4%,0.5%,二級培養(yǎng)44 h后,分別測定菌體體積分?jǐn)?shù),具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)甘氨酸對菌體生長的影響Fig.2 The influence of different glycine concentration on bacteria growth

由圖2可以看出:隨著甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加,菌體的生長受到明顯的抑制;一般制備原生質(zhì)體甘氨酸加入的質(zhì)量分?jǐn)?shù)通?？刂圃谀軌蛎黠@抑制菌絲生長,并可以獲得適量菌絲體為宜。根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果,確定采用甘氨酸的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 二級培養(yǎng)時(shí)間

在二級培養(yǎng)中加入甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%,在培養(yǎng)過程中,每間隔4 h取樣并測定菌體體積分?jǐn)?shù),目的是確定最佳的二級培養(yǎng)時(shí)間,具體結(jié)果如圖3所示。

圖3 二級培養(yǎng)時(shí)間Fig.3 The secondary culture time

由圖3可以看出:在該培養(yǎng)條件下,培養(yǎng)至40～44 h時(shí),菌絲體處于對數(shù)生長期與穩(wěn)定期的轉(zhuǎn)換期,該時(shí)期的菌絲體對溶菌酶的作用最敏感,因此確定二級菌絲體最佳的培養(yǎng)時(shí)間為40～44 h。

2.4 溶解酶的質(zhì)量濃度和作用時(shí)間對原生質(zhì)體形成的影響

阿卡波糖產(chǎn)生菌為放線菌,實(shí)驗(yàn)使用溶菌酶作為工具酶,可水解放線菌細(xì)胞壁的主要成分肽聚糖[20-21]。通過將不同的溶菌酶質(zhì)量濃度和不同酶解時(shí)間進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn),已確定最佳的溶菌酶質(zhì)量濃度和酶解時(shí)間。實(shí)驗(yàn)添加的溶菌酶質(zhì)量濃度分別為2,3,4 mg/mL,酶解作用時(shí)間分別為1,2,3 h,酶解作用之后將原生質(zhì)體懸液用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下計(jì)數(shù),可統(tǒng)計(jì)得到該條件下原生質(zhì)體的制備量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 不同溶菌酶質(zhì)量濃度和酶解時(shí)間對原生質(zhì)體形成數(shù)量的影響

由表1可以看出:溶菌酶質(zhì)量濃度為3 mg/mL、酶解時(shí)間為2 h時(shí)原生質(zhì)體的釋放量最大,因此確定溶菌酶質(zhì)量濃度為3 mg/mL時(shí)酶解時(shí)間2 h為宜。在酶解過程中不斷取樣在顯微鏡下觀察,溶菌酶質(zhì)量濃度較低、酶作用時(shí)間較短時(shí),大部分菌體仍呈菌絲狀;隨著酶質(zhì)量濃度的加大,菌絲周圍球形的顆粒出現(xiàn)的越早,說明此時(shí)原生質(zhì)體開始逐漸形成;在最佳酶解質(zhì)量濃度和時(shí)間可觀察到大多數(shù)菌絲體已形成原生質(zhì)體,并且很少觀察到絲狀形態(tài);酶質(zhì)量濃度過大、酶解時(shí)間加長,細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生變化,說明此時(shí)細(xì)胞質(zhì)膜已經(jīng)受到了損傷。

3 原生質(zhì)體制備技術(shù)在阿卡波糖生產(chǎn)中的應(yīng)用

3.1 利用原生質(zhì)體復(fù)合誘變技術(shù)篩選阿卡波糖高產(chǎn)菌株

3.1.1 原生質(zhì)體最佳物理誘變時(shí)間的摸索

按照1.6.2中敘述的紫外誘變方法,實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)了紫外照射時(shí)間分別為1,3,6,9 min時(shí)的致死率,具體結(jié)果如表2所示。

表2 不同紫外照射時(shí)間的致死率

由表2可以看出:當(dāng)紫外照射1 min時(shí),菌體沒有受到任何損傷;紫外照射3 min時(shí),致死率太低不利于篩選;而紫外照射9 min時(shí),致死率高達(dá)99.8%,只有極少數(shù)細(xì)胞能夠存活,同樣也難以進(jìn)行后續(xù)的菌株篩選;照射6 min時(shí),致死率為94%,既能保證較高的致死率,又有足夠數(shù)量的菌體可以用于后續(xù)的篩選,因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用原生質(zhì)體在紫外下照射6 min的誘變方式開展選育工作。

3.1.2 阿卡波糖高產(chǎn)菌株的篩選

利用搖瓶發(fā)酵的方式對原生質(zhì)體誘變后的再生菌株進(jìn)行大量的篩選[22-27],具體篩選方法:取紫外誘變處理的原生質(zhì)體懸液,涂布于再生培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng);從再生培養(yǎng)基平皿上隨機(jī)挑取100株生長出的單菌落至斜面培養(yǎng)基上,再從斜面培養(yǎng)基挖塊至種子培養(yǎng)基中,種子培養(yǎng)后,接種至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng),搖瓶發(fā)酵結(jié)束后,用HPLC測定每株菌的發(fā)酵單位。

以出發(fā)菌株的發(fā)酵單位為100%,分別統(tǒng)計(jì)了100株菌株中,搖瓶相對發(fā)酵單位為70%～80%,80%～90%,90%～100%,100%～110%,110%～120%,大于120%這6個(gè)階段的菌株數(shù)量,具體結(jié)果如圖4所示。

圖4 篩選菌株的產(chǎn)量分布圖Fig.4 The production distribution of the screened strains

由圖4可以看出:利用原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變,其誘變效果較為顯著,負(fù)向突變率為28%,正向突變率可以達(dá)到15%,其中正變率大于120%的高產(chǎn)菌株有3株。

3.1.3 阿卡波糖高產(chǎn)菌株搖瓶發(fā)酵水平的確認(rèn)

將原生質(zhì)體誘變篩選出的3株高產(chǎn)菌株,重復(fù)進(jìn)行了3批搖瓶發(fā)酵,確認(rèn)了3株高產(chǎn)菌株發(fā)酵水平的穩(wěn)定性,具體實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果如表3所示。

表3 3株高產(chǎn)菌株的發(fā)酵水平

由表3可以看出:3株高產(chǎn)菌株重復(fù)進(jìn)行了3批搖瓶發(fā)酵且發(fā)酵水平均較穩(wěn)定,相對于出發(fā)菌株,平均發(fā)酵目的產(chǎn)物的質(zhì)量濃度分別提高了19.3%,24.6%,25.4%。

3.1.4 篩選出的高產(chǎn)菌株在中試的應(yīng)用

利用篩選出來的阿卡波糖高產(chǎn)菌株進(jìn)行中試實(shí)驗(yàn),以此考察高產(chǎn)菌株的生產(chǎn)效力。將篩選出的高產(chǎn)菌株接至種子培養(yǎng)基中,種子經(jīng)過48 h的培養(yǎng)后,接種至1 m3的種子罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),再移種至10 m3發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。取其發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定,3株高產(chǎn)菌株的中試發(fā)酵水平如圖5所示。

圖5 3株高產(chǎn)菌株的中試發(fā)酵水平Fig.5 The pilot-scale fermentation level of the three high-yield strains

由圖5可以看出:10 m3罐發(fā)酵培養(yǎng)168 h后,3株高產(chǎn)的發(fā)酵目的產(chǎn)物的質(zhì)量濃度分別為6 951,7 133,7 286 μg/mL,比出發(fā)菌株分別提高了19%,22.2%,24.8%。通過中試放大實(shí)驗(yàn)說明原生質(zhì)體誘變篩選獲得的3株高產(chǎn)菌株,在10 m3的發(fā)酵罐規(guī)模下仍能夠保持較高的產(chǎn)物合成能力。

3.2 原生質(zhì)體技術(shù)在菌種庫制備過程中的應(yīng)用

阿卡波糖原料藥發(fā)酵使用的工業(yè)菌種是從原始菌株不斷復(fù)壯純化而來的,由于阿卡波糖產(chǎn)生菌的分篩和保藏都是以菌絲體的形式,多核細(xì)胞導(dǎo)致保存和使用的菌種庫的純化程度不高,因此在阿卡波糖菌種的實(shí)際使用過程中發(fā)現(xiàn)分離篩選后的單菌落間存在明顯差異的現(xiàn)象,差異主要體現(xiàn)在種子生長速度及發(fā)酵過程中的代謝特征,從而引起生產(chǎn)水平的波動(dòng)和下降。該問題的出現(xiàn)可以說明:若菌種庫的純化程度不高,則會(huì)造成菌株表型延遲和嚴(yán)重的遺傳分離現(xiàn)象,菌種的生產(chǎn)性能會(huì)逐漸衰退,這是目前菌種庫制備面臨的一個(gè)重要問題。

實(shí)驗(yàn)在菌種庫制備的過程中使用原生質(zhì)體技術(shù),明顯提高了菌種庫的純化程度。制備菌種庫的具體流程如下:制備原生質(zhì)體—原生質(zhì)體再生—從再生培養(yǎng)基中挑取單菌落—接種至搖瓶種子培養(yǎng)基—菌液中加入20%滅菌后的甘油并充分混勻—分裝于甘油管中冷凍保存。

實(shí)驗(yàn)將自然篩選與原生質(zhì)體兩種方式制備的菌種庫,其單菌落之間的差異大小進(jìn)行了比對。首先將兩個(gè)不同菌種庫的菌液涂布于平皿培養(yǎng)基上,然后從每組平皿上分別挑取10顆單菌落,接種于搖瓶種子培養(yǎng)基中,種子培養(yǎng)結(jié)束后再轉(zhuǎn)接至搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中,并測定剩余種液的菌體體積分?jǐn)?shù),發(fā)酵培養(yǎng)168 h后,取發(fā)酵液經(jīng)HPLC測定發(fā)酵水平,具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果表4所示。

表4 對比不同菌種庫單菌落之間的發(fā)酵水平差異

由表4可以看出:兩組實(shí)驗(yàn)菌體質(zhì)量分?jǐn)?shù)的平均值均為31%,說明不同方式制備的菌種庫種子生長速度相當(dāng),但是兩組實(shí)驗(yàn)菌體質(zhì)量分?jǐn)?shù)的標(biāo)準(zhǔn)差分別為3.26和1.73,說明通過原生質(zhì)體制備的菌種庫不同單菌落之間的種子生長速率差異更小;通過原生質(zhì)體制備的菌種庫其10顆單菌落對應(yīng)的搖瓶發(fā)酵單位平均值高于自然篩選制備的菌種庫,說明通過原生質(zhì)體是一種優(yōu)于自然選育的優(yōu)勝劣汰的篩選過程;通過原生質(zhì)體篩選獲得的菌株不僅發(fā)酵水平高,而且不同單菌落個(gè)體之間的差異較小,發(fā)酵水平更加穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

通過實(shí)驗(yàn)確定了阿卡波糖產(chǎn)生菌原生質(zhì)體制備的最適條件為:二級菌絲培養(yǎng)采用優(yōu)化后的SM2培養(yǎng)基,一級培養(yǎng)時(shí)間為44～48 h,二級培養(yǎng)添加甘氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%,培養(yǎng)時(shí)間為40～44 h;溶菌酶質(zhì)量濃度為3 mg/mL,作用時(shí)間為2 h,該條件下原生質(zhì)體制備量可達(dá)1.2×105個(gè)/mL,并且通過對原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變,獲得了3株高產(chǎn)菌株。對于不產(chǎn)孢子的放線菌而言,原生質(zhì)體制備技術(shù)是解決該類放線菌純化的一種有效方法。目前,該技術(shù)在育種工作中已經(jīng)運(yùn)用原生質(zhì)體誘變的方法來篩選高產(chǎn)菌株,用UV照射去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體能夠更加迅速地與細(xì)胞核作用,基因突變率會(huì)大大增加,而且誘變后易于形成單菌落,便于后續(xù)的分離篩選,因此可以說對于像阿卡波糖產(chǎn)生菌一樣的不產(chǎn)孢子的絲狀微生物而言,原生質(zhì)體是最適的誘變材料。另外,在菌種庫制備過程中應(yīng)用原生質(zhì)體技術(shù)與原來的自然篩選相比較,該流程較繁瑣,操作難度較大。該技術(shù)雖然從短期的運(yùn)用效果來看還未體現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢,但從長期的工業(yè)化大生產(chǎn)來看,對確保生產(chǎn)菌種優(yōu)良性能的穩(wěn)定具有深遠(yuǎn)的意義。