高 鑫，王安琪，何正有，畢建軍，蔣 用，李 佳，湯秀強

（四川省藥物制劑及裝備工程技術研究中心，四川抗菌素工業(yè)研究所，成都大學藥學院，四川 成都 610106）

穿山龍為薯蕷科植物穿龍薯蕷Dioscorea nipponicaMakino 的干燥根莖，具有祛風除濕、舒筋活血等功效［1］，主要含有甾體皂苷成分，如薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、原薯蕷皂苷、原纖細薯蕷皂苷等［2］，具有抗腫瘤、抗炎、增強免疫、心血管活性等藥理活性［3?4］。但這些甾體皂苷分子一般含有較長的糖鏈，具有極性較大、生物利用率低、藥理活性弱等缺點［5］，往往經(jīng)體內(nèi)微生物或酶分解成短糖鏈皂苷或苷元再被胃腸道吸收而進入血液循環(huán)系統(tǒng)，從而發(fā)揮藥理活性［6］。然而，不同個體或同一個體在不同時間，其體內(nèi)的微生物群或酶系都有顯著性差異，對皂苷類物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化和入血吸收能力也因人因時而異，在臨床上就體現(xiàn)出中藥療效的個體差異或時間差異，這也是造成中藥療效不穩(wěn)定的主要原因［7?8］。為了進一步研究穿山龍皂苷的構(gòu)效關系、藥理活性及其體內(nèi)過程，有必要規(guī)?；刂苽涑鲆幌盗卸烫擎湹拇┥烬堅碥栈蜍赵?。目前，制備短糖鏈皂苷或苷元的方法主要有物理法、化學法和生物法，其中物理法和化學法具有反應速度快的優(yōu)點，但存在水解產(chǎn)物化學結(jié)構(gòu)不可控和產(chǎn)量低等缺陷［9］；生物轉(zhuǎn)化法具有結(jié)構(gòu)專一性強、反應速度可控、產(chǎn)量高等優(yōu)點［10］。因此，本實驗將研究穿山龍皂苷的生物轉(zhuǎn)化途徑及其相關產(chǎn)物，以期制備出不同糖鏈的皂苷成分，為深入研究其構(gòu)效關系、藥理活性和體內(nèi)過程提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種庫 紅曲霉（Monascus purpureusWent CGCC 3.570）、毛霉菌（Mucor sp.CGMCC 3.25）、黑曲霉（Asperillus nigerCICC 2462）、醋桿菌（AcetobacterCICC 7000）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentumCGMCC 1.2133）、干酪乳桿菌（Lactobacillus caseiCICC 6007），均為實驗室保存菌種。

1.1.2 菌種液體培養(yǎng)基 紅曲霉、毛霉菌、黑曲霉培養(yǎng)基為每1 000 mL 培養(yǎng)液中含馬鈴薯200 g（用純化水煮沸0.5 h 過濾）、硫酸鎂1.5 g、磷酸二氫鉀3 g、VB24 片（含有VB 240 mg）。發(fā)酵乳桿菌、干酪乳桿菌培養(yǎng)基為每1 000 mL 培養(yǎng)液中含有蛋白胨10 g、牛肉浸取物10 g、酵母提取液5 g、葡萄糖5 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸二胺2 g、磷酸氫二鉀2 g、七水硫酸鎂0.2 g、七水硫酸錳0.05 g、吐溫80 0.1 g。

1.1.3 底物 穿山龍皂苷提取物（實驗室自制，總皂苷含量為41.25%）。

1.2 儀器 GF25 型4 硅膠板（青島海洋化工廠分廠）；LDZM?80KCS?Ⅲ立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；ZWY?2102 恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智誠分析儀器有限公司）；Agilent 1260 Series高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。Ultimate C18鍵合硅膠柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、反相硅膠層析填 料 C18（Dima）、Sephadex LH?20（GE Healthcare）。正丁醇、甲醇、乙醇等試劑均為分析純（成都市科隆化學品有限公司）；乙腈（國藥集團化學試劑有限公司）。對照品薯蕷皂苷薯蕷皂苷元（純度≥98%，成都市卓譜儀器有限公司）。

2 方法

2.1 微生物轉(zhuǎn)化菌種的篩選 菌種篩選實驗分為轉(zhuǎn)化實驗組和無底物空白組，在150 mL 的搖瓶中加入50 mL 相應的菌種液體培養(yǎng)基，向轉(zhuǎn)化實驗組中加入穿山龍皂苷提取物，使每50 mL 培養(yǎng)基中含有92 mg 穿山龍皂苷提取物，無底物空白組不做處理。所有培養(yǎng)基于121 ℃下高壓滅菌30 min，然后向轉(zhuǎn)化實驗組和無底物空白組接種各個菌種，接種量為16%，28 ℃、220 r／min 下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d，取樣檢測。使用TLC 法檢測轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，篩選出具有轉(zhuǎn)化能力的菌種。

2.1.1 對照品溶液制備 制備質(zhì)量濃度約1 mg／mL的薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元對照品溶液。

2.1.2 樣品溶液制備 分別收集轉(zhuǎn)化液，濾過，減壓濃縮，蒸發(fā)皿水浴干燥，稱量后甲醇溶解制備成一定濃度。取薄層硅膠板，置于105 ℃恒溫烘箱中活化30 min，取出，放于干燥器中冷卻至室溫，點樣，使用二氯甲烷?甲醇（20 ∶1）展開劑展開，溶劑揮發(fā)完后噴10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃烘箱中顯色至斑點清晰，在365 nm 紫外線下觀察。

2.2 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物擴大培養(yǎng) 設轉(zhuǎn)化組與底物對照組，向2 組中加入穿山龍皂苷提取物，每500 mL 液體培養(yǎng)基中含有920 mg 穿山龍皂苷提取物，共配制3 000 mL，分裝于750 mL 搖瓶中，每瓶150 mL，于121 ℃下高壓滅菌30 min，放冷。底物對照組不加入菌種，轉(zhuǎn)化組接入篩選出的菌種，接種量為16%，培養(yǎng)溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為220 r／min，2 組在相同條件下培養(yǎng)5 d，收集轉(zhuǎn)化液。

2.3 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的提取和分離純化 將收集的轉(zhuǎn)化液進行抽濾，收集濾液，低溫濃縮濾液至小體積，用等體積的水飽和正丁醇萃取3 次，合并所有水飽和正丁醇層，將水飽和正丁醇層于40 ℃進行濃縮，減壓真空干燥轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。將得到的干燥轉(zhuǎn)化產(chǎn)物用反相硅膠柱層析分離，用乙腈?水（65 ∶35、70 ∶30、65 ∶25）依次進行洗脫，收集洗脫液，經(jīng)凝膠柱層析純化，二氯甲烷?甲醇?水（36 ∶6 ∶0.1）進行洗脫，收集洗脫液，干燥得化合物A（44 mg）。

2.4 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物分析

2.4.1 色譜條件 Ultimate C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm）；流動相水（A）?乙腈（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長203 nm；進樣量20 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.4.2 對照品溶液制備 精密稱取薯蕷皂苷、薯蕷皂苷元對照品適量，甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為0.310、0.396 mg／mL 的溶液。

2.4.3 樣品溶液制備 將轉(zhuǎn)化組與底物對照組的轉(zhuǎn)化液抽濾，濃縮至小體積，水飽和正丁醇?轉(zhuǎn)化液（1 ∶1）萃取3 次，合并正丁醇層，蒸干，取適量至10 mL 量瓶中，甲醇定容?；衔顰 轉(zhuǎn)化率＝

3 結(jié)果

3.1 菌種篩選 TLC 檢測結(jié)果見圖1、表2，可知只有黑曲霉對穿山龍皂苷具有轉(zhuǎn)化作用；圖1 黑曲霉轉(zhuǎn)化液中的薯蕷皂苷的斑點幾乎消失，同時出現(xiàn)了新的化合物斑點，其形狀較大并呈淡藍色，Rf值位于薯蕷皂苷和薯蕷皂苷元之間。

圖1 穿山龍經(jīng)不同菌種轉(zhuǎn)化后TLC 圖譜Fig.1 TLC chromatogram for D.nipponicae after different strains?mediated transformation

表2 不同菌種對薯蕷皂苷轉(zhuǎn)化TLC 檢測結(jié)果Tab.2 TLC detection results of dioscin transformation by different strains

3.2 結(jié)果分析 圖2 顯示，與底物對照組比較，轉(zhuǎn)化組出現(xiàn)了1 個原本不存在的色譜峰，出峰時間為83.3 min，位于薯蕷皂苷與薯蕷皂苷元之間，表明其極性也處于兩者之間，推測可能為低取代糖鏈的甾體皂苷，與TLC 結(jié)果相似。根據(jù)峰面積計算，化合物A 含量占轉(zhuǎn)化液的24.35%，總皂苷轉(zhuǎn)化率達到59%。

圖2 各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

3.3 結(jié)構(gòu)鑒定 通過1H?NMR、13C?NMR 數(shù)據(jù)和相關文獻進行解析。化合物A：白色粉末，共44 mg，純度95.3%，分子式C39H62O12。ESI?MSm／z：745［M＋Na］＋。1H?NMR（600 MHz，Pyridine?d5）δ：4.91（1H，d，H?1′），3.94（1H，t，H?2′），4.42（1H，t，H?4′），5.86（1H，s，H?1″），4.65（1H，d，H?2″），4.32（1H，t，H?4″）；13C?NMR（600 MHz，Pyridine?d5）δ：140.6（C?5），121.6（C?6），109.1（C?22），102.5（C?1′），102.2（C?1″），80.9（C?16），78.0（C?3），77.0（C?5′），76.5（C?3′），75.4（C?2′），73.8（C?4″），72.6（C?2″），72.5（C?3″），70.2（C?5″），66.6（C?26），62.6（C?），61.3（C?6′），56.4（C?14），50.0（C?9），41.8（C?20），40.2（C?13），39.6（C?12），39.1（C?4），37.2（C?1），36.8（C?10），32.0（C?2），32.0（C?7），31.6（C?8），31.4（C?15），30.4（C?25），30.0（C?23），29.0（C?24），20.9（C?24），19.2（C?19），18.4（C?6″），17.1（C?27），16.2（C?18），14.9（C?21）。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］ 基本一致，故鑒定為prosapogenin B。

4 討論

目前，關于穿山龍皂苷微生物轉(zhuǎn)化的研究大多集中于薯蕷皂苷元的獲得［12］，很少尋找新的先導化合物。趙桂云等［13］從黃山藥根部土壤中篩選出了一株能夠轉(zhuǎn)化穿山龍干粉的菌種，能將穿山龍干粉直接轉(zhuǎn)化為薯蕷皂苷元，轉(zhuǎn)化率為7.37%；Liu等［14］通過米曲霉中提取的酶對穿山龍皂苷進行轉(zhuǎn)化，獲得了重樓皂苷E，產(chǎn)率較高；Zhang 等［15］從穿山龍根莖中篩選出了一株米曲霉，對穿山龍進行微生物轉(zhuǎn)化，得到新化合物薯蕷皂苷E 和薯蕷皂苷F；本研究篩選出一株黑曲霉，它能有效轉(zhuǎn)化穿山龍皂苷，得到了原穿山龍皂苷中不含有的prosapogenin B，總皂苷轉(zhuǎn)化率可達59%。

prosapogenin B 是雙糖甾體皂苷，能抑制許多人癌細胞增殖，誘導白血病K562 細胞以及大腸癌HCT?15 細胞的凋亡［16］。穿山龍皂苷含有薯蕷皂苷，但轉(zhuǎn)化后其含量有所減少，即生成了新化合物，可能的轉(zhuǎn)化途徑見圖3。薯蕷皂苷的糖基部分含有1 個葡萄糖和2 個鼠李糖。β?D葡萄糖的2，4位分別連有1 個鼠李糖，其中以1，2 糖苷鍵連接的鼠李糖被水解，留下了以1，4 糖苷鍵連接的鼠李糖，產(chǎn)生了1 個β?D葡萄糖1，4 連接α?L鼠李糖的薯蕷皂苷衍生物。由此推測，黑曲霉能夠特異性識別薯蕷皂苷的L?鼠李糖?（1→2）?β?D葡萄糖位點，并同時產(chǎn)生了能夠水解該位點的特異性水解酶，對該位點進行專一性水解，高效獲得產(chǎn)物。因此，可以通過黑曲霉快速有效的獲得2 個糖取代的低取代薯蕷皂苷的次生皂苷。

圖3 黑曲霉對穿山龍皂苷可能的轉(zhuǎn)化途徑Fig.3 Possible pathway for Aspergillus niger?mediated transformation of D.nipponica saponins

綜上所述，本實驗采用黑曲霉對穿山龍皂苷進行轉(zhuǎn)化，獲得了低取代糖的皂苷prosapogenin B，并且轉(zhuǎn)化率較高，為低糖鏈皂苷的制備提供了研究思路，即可采用微生物轉(zhuǎn)化的方法或從具有轉(zhuǎn)化能力的菌種中篩選特異性轉(zhuǎn)化酶，制備低糖基取代的皂苷，從而為相關藥理活性與構(gòu)效關系的研究提供基礎。