孔凡明,王海雷,吳 濤

(通遼梅花生物科技有限公司,內(nèi)蒙古 通遼 028024)

5′-肌苷酸(Inosine-5′-monophosphate,簡稱IMP)因具有獨(dú)特鮮味,通常與5′-鳥苷酸(Guanosine-5′-monophosphate,簡稱GMP)協(xié)同作為各種食品添加劑中的風(fēng)味增強(qiáng)劑,其以質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～12%加入谷氨酸中呈味效果比單用谷氨酸鈉高約8倍,有“強(qiáng)力味精”之稱[1-2]。核苷酸的呈味機(jī)理和其獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系,研究表明:只有5′-碳原子上連接磷酸基團(tuán)才表現(xiàn)出鮮味,而2′-和3′-碳原子磷酸酯化無鮮味,且5′-碳原子的磷酸基團(tuán)上的兩個(gè)羥基解離才能產(chǎn)生鮮味,因此5′-肌苷酸鮮味劑通常以鈉(或鉀、鈣)鹽的形式存在[3-5]。

肌苷酸生產(chǎn)方法分為酶解法和發(fā)酵法,其中酶解法包括酶解核糖核酸法和酵母菌體自溶法,發(fā)酵法包括肌苷酸直接發(fā)酵法和肌苷發(fā)酵-轉(zhuǎn)化法[6]。酶解核糖核酸法和酵母菌體自溶法原料來源豐富,成本低廉且一次可得到4種核苷酸的混合物,但提取高純度產(chǎn)品難度大,提取工藝繁瑣,導(dǎo)致生產(chǎn)周期長。直接發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷酸不僅要考慮解除產(chǎn)物合成代謝過程反饋抑制,而且還要考慮改變細(xì)胞通透性使肌苷酸合成后能正常轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外,由此帶來發(fā)酵工藝復(fù)雜、發(fā)酵周期長、成本高和指標(biāo)難以有效提升等一系列問題[7]。利用發(fā)酵法生產(chǎn)肌苷不存在直接發(fā)酵法存在的弊端,因此可通過發(fā)酵出肌苷后進(jìn)一步磷酸化生產(chǎn)肌苷酸[8]。目前,較多生產(chǎn)廠家均采用化學(xué)磷酸化方法生產(chǎn)肌苷酸,其雖然有專一性強(qiáng)、副產(chǎn)物少和磷酸化產(chǎn)率高的優(yōu)勢(shì),但過程所用到的原料成本較高,且對(duì)人體及環(huán)境有較大危害。近幾年,隨著環(huán)保觀念的普及和人們綠色發(fā)展理念的不斷提升,酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)核苷酸日益受到科技工作者的廣泛關(guān)注[9]。

1 磷酸化過程酶的選擇

酶轉(zhuǎn)化法具有反應(yīng)條件溫和、不需要保護(hù)基團(tuán)和專一性強(qiáng)等特點(diǎn),因此具有化學(xué)轉(zhuǎn)化法無法比擬的優(yōu)越性。目前,通過核苷磷酸化生產(chǎn)核苷酸的酶主要有核苷激酶(Nucleoside kinase)和酸性磷酸酶[10],核苷激酶是能將三磷酸腺苷(ATP)的高能磷酸基團(tuán)特異性地轉(zhuǎn)移到核苷上的一類酶,其反應(yīng)過程為

ATP+核苷→5′-核苷酸+ADP

激酶可用于催化合成多種核苷酸,Hove-jensen等[11-13]就嘗試著利用肌苷/鳥苷激酶生產(chǎn)肌苷酸/鳥苷酸。此方法不足之處在于催化過程需要一直消耗ATP,所以必須同時(shí)培養(yǎng)能再生反應(yīng)中消耗ATP的微生物,使核苷激酶在核苷酸生產(chǎn)應(yīng)用中受到極大的限制[14]。

5′-肌苷酸二鈉分子結(jié)構(gòu)式為

酸性磷酸酶(Acid phosphatase/phosphpotransferases,簡稱AP/PTases,EC3.1.3.2)廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中。其在酸性條件下能以焦磷酸鹽或聚磷酸鹽等富能量物質(zhì)為底物,特異性地催化核苷合成相應(yīng)的核苷酸[15]。根據(jù)催化底物的不同,可將酸性磷酸酶分為非特異性酸性磷酸酶(NSAPs)和特異性酸性磷酸酶[16-17]。非特異性酸性磷酸酶不表現(xiàn)出明顯的底物特異性,通常能夠水解廣泛的有機(jī)磷酸酯,比如核苷酸、葡萄糖-6-磷酸和磷酸二羥基丙酮等[16]。非特性性酸性磷酸酶的分類如表1所示。根據(jù)氨基酸序列同源性的不同,NSAPs可分為A,B,C 3個(gè)大類,進(jìn)一步又可以將A類細(xì)分為A1～A33個(gè)亞類,其中研究較多的非特異性酸性磷酸酶為摩根氏菌屬(PhoC-Mm)、鼠傷寒沙門氏菌(PhoN-St)和福氏志賀氏菌(Apy-Sf)[18-19]。由于酸性磷酸酶對(duì)多種磷酸化合物均具有脫磷酸活性且過程不需消耗ATP,因此為酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)肌苷酸提供一條新思路[20-21]。

表1 非特性性酸性磷酸酶的分類

酸性磷酸酶不僅具有特異的磷酸轉(zhuǎn)移酶特性,而且還具有5′-核苷酸酶活性,5′-核苷酸酶會(huì)將生成的肌苷酸進(jìn)行水解,在轉(zhuǎn)化過程中會(huì)有逆反應(yīng)發(fā)生,因此通過構(gòu)建重組菌株提高過程轉(zhuǎn)化率顯得尤為重要。酸性磷酸酶以焦磷酸鹽和肌苷為底物進(jìn)行磷酸化和去磷酸化的反應(yīng),其反應(yīng)過程如下:

1) 磷酸轉(zhuǎn)移酶活性,肌苷磷酸化反應(yīng)過程為

Pi inosine

2) 5′-核苷酸酶活性,肌苷酸去磷酸化反應(yīng)過程為

inosine H2O

式中:E為酸性磷酸酶;PPi為焦磷酸鹽;Pi為磷酸鹽。

2 酸性磷酸酶重組菌株的構(gòu)建

最早開展核苷生物法磷酸化研究的為日本學(xué)者Asano等[22],他發(fā)現(xiàn)摩氏摩根菌(M.morganii)中的磷酸化酶對(duì)肌苷和鳥苷具有催化作用,可生成相應(yīng)的肌苷酸和鳥苷酸,且催化反應(yīng)效率基本相同。之后Mihara等[23]發(fā)現(xiàn)菌株M.morganiiNCIMB10466發(fā)酵可產(chǎn)生具有選擇性磷酸轉(zhuǎn)移活性的酸性磷酸酶,經(jīng)過提取相關(guān)磷酸轉(zhuǎn)移酶基因并引入一系列突變后將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌中,成功獲得一株高磷酸轉(zhuǎn)移酶活性突變株。使用該突變株進(jìn)行肌苷酶轉(zhuǎn)化,肌苷酸的收率可達(dá)85%。為了進(jìn)一步提高酶活,Mihara等[24]利用點(diǎn)飽和突變技術(shù)對(duì)蟑螂埃希氏菌(E.blattae)的酸性磷酸酶基因上活性位點(diǎn)進(jìn)行一系列突變獲得突變菌,該突變菌株酸性磷酸酶的活性得到明顯提高。

國內(nèi)學(xué)者在重組酸性磷酸酶菌株的構(gòu)建方面成果豐碩。梁勝華[25]以產(chǎn)氣腸桿菌為出發(fā)菌和以pBV220為表達(dá)載體構(gòu)建高效表達(dá)溫度誘導(dǎo)型的酸性磷酸酶基因工程菌。將溫度提高到42 ℃誘導(dǎo)4 h即可誘導(dǎo)外源蛋白的大量表達(dá)。趙洪新等[26]以產(chǎn)氣腸桿菌為出發(fā)菌,獲得酸性磷酸酶基因序列PhoC,將其與不同的載體連接,分別克隆進(jìn)大腸桿菌構(gòu)建酸性磷酸酶基因工程菌。與野生型相比,工程菌合成肌苷酸活力提高,而水解肌苷酸的活力明顯下降。Liu等[27]通過基因工程技術(shù)合成來源于E.blattaeJCM 1650的酸性磷酸酶基因,并將酸性磷酸酶基因定向克隆并構(gòu)建成表達(dá)載體轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中,成功構(gòu)建重組大腸桿菌重組菌,經(jīng)工藝優(yōu)化和IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后,生物量達(dá)3.2 g/L,酶活達(dá)145.6 U/L,比優(yōu)化前分別提高1.5倍和2.1倍。沈愛萍等[28]對(duì)重組E.coliBL21(DE3)/pET28b-AP/PT開展發(fā)酵工藝優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確定最佳誘導(dǎo)劑為乳糖,誘導(dǎo)劑乳糖質(zhì)量濃度為10 g/L,最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為OD600在7.0左右,最高酶活可達(dá)221.4 U/L。何菊華[15]以大腸桿菌重組菌為出發(fā)菌株,確定獲得高酶活的細(xì)胞發(fā)酵工藝。其中誘導(dǎo)劑最適添加時(shí)機(jī)為對(duì)數(shù)前期,誘導(dǎo)OD600為2.0～2.5,持續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h,最高酶活可達(dá)1 980.07 U/L。

3 酸性磷酸酶在轉(zhuǎn)化肌苷生產(chǎn)肌苷酸中的研究

酸性磷酸酶在轉(zhuǎn)化生產(chǎn)肌苷酸中的研究報(bào)道主要集中在轉(zhuǎn)化過程菌株選擇與酶處理方式、酶轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化和底物濃度優(yōu)化等方面。

3.1 菌株選擇與酶處理方式

不同微生物種屬酸性磷酸酶活力相差較大,為了提高酶轉(zhuǎn)化效率對(duì)于菌株選擇顯得尤為必要。Mihara等[29]將來自M.morganii,P.stuarrtii,E.aerogenes,E.blattae,K.planticola的AP/PTase基因分別克隆進(jìn)E.coli,然后用于催化肌苷合成5′-IMP,并對(duì)它們催化效率進(jìn)行比較。與其他菌株相比,發(fā)現(xiàn)M.morganii更適合用來催化肌苷磷酸化。

酶液狀態(tài)對(duì)酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)過程影響較大,酸性磷酸酶屬于胞內(nèi)酶,對(duì)于胞內(nèi)酶一般需要經(jīng)過細(xì)胞破碎將酶釋放到胞外才能發(fā)揮更高的酶活性。Asano等[22]利用M.morganii游離細(xì)胞以焦磷酸鈉和肌苷為底物催化合成肌苷酸,底物肌苷濃度37.3 mmol/L,反應(yīng)9 h,得到肌苷酸濃度11.4 mmol/L,產(chǎn)率30.6%。Asano等[30]進(jìn)一步利用從M.morganii中純化出的酸性磷酸酶粗酶液催化肌苷磷酸化合成肌苷酸,肌苷濃度80 mmol/L,反應(yīng)6 h,最終得到肌苷酸濃度32.6 mmol/L,收率41%,對(duì)比利用游離細(xì)胞指標(biāo)有進(jìn)一步提升。趙洪新等[31]以產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)AM 1183研究酶液狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化過程的影響,發(fā)現(xiàn)破碎細(xì)胞液在轉(zhuǎn)化肌苷合成肌苷酸方面優(yōu)于靜息細(xì)胞。

3.2 酶轉(zhuǎn)化工藝優(yōu)化

在酶轉(zhuǎn)化過程,轉(zhuǎn)化溫度和pH對(duì)酶轉(zhuǎn)化過程影響較大。在適宜的轉(zhuǎn)化條件下,酶轉(zhuǎn)化效率能得到大幅提升[32]。綜合前人研究酸性磷酸酶一般最佳轉(zhuǎn)化溫度為35 ℃,最佳轉(zhuǎn)化pH為4.5。張玲[33]對(duì)構(gòu)建重組大腸桿菌進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)研究,確定該酶的最適pH為5.0,最適反應(yīng)溫度為30 ℃。進(jìn)一步考察靜息細(xì)胞特異性磷酸化過程的影響,得到靜息細(xì)胞最適反應(yīng)溫度為35 ℃。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?7 mmol/L時(shí),5′-肌苷酸的收率達(dá)到83.3%。永井秀忠等[34]利用三聚磷酸鈉為底物制備呈味核苷酸二鈉,在酶轉(zhuǎn)化優(yōu)化過程中確定最佳pH為4.5,最佳溫度為35 ℃,并指出pH是影響酶解轉(zhuǎn)化過程的關(guān)鍵因素。孫麗慧等[35]對(duì)游離細(xì)胞和固定化細(xì)胞反應(yīng)條件對(duì)比發(fā)現(xiàn),經(jīng)過固定化后的酸性磷酸酶最適轉(zhuǎn)化溫度為35 ℃,稍高于游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化溫度。二者最適反應(yīng)pH均為5.0,但固定化后的酸性磷酸酶作用pH較游離細(xì)胞更寬泛。酸性磷酸酶經(jīng)過固定化后操作穩(wěn)定性較好,重復(fù)使用12批后相對(duì)酶活力仍在54.5%。

3.3 底物濃度優(yōu)化

酸性磷酸酶在轉(zhuǎn)化肌苷過程的磷酸供體主要為多聚磷酸及其鹽,如焦磷酸、焦磷酸鹽和三聚磷酸鹽等。通過對(duì)肌苷和磷酸鹽質(zhì)量濃度的優(yōu)化,在發(fā)酵成本控制、酶轉(zhuǎn)化效率提升和成品提取精制等方面均有重要作用[36]。梁勝華[25]以產(chǎn)氣腸桿菌(E.aerogenes)為出發(fā)菌株構(gòu)建的溫度誘導(dǎo)性酸性磷酸酶基因工程菌進(jìn)行肌苷酶轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為50 g/L肌苷+300 g/L焦磷酸鈉時(shí),反應(yīng)2 h可得到肌苷酸質(zhì)量濃度為90.6 g/L,收率為92%。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度提高到100 g/L肌苷+300 g/L焦磷酸鈉時(shí),反應(yīng)7 h可得到肌苷酸質(zhì)量濃度為153.7 g/L,收率為78%。李文峰等[37]使用磷酸轉(zhuǎn)移酶工程菌菌體細(xì)胞催化肌苷5′-位磷酸化的工藝條件,研究結(jié)果表明:在整細(xì)胞PhoC酶活45 U,肌苷濃度100 mmol/L,焦磷酸濃度120 mmol/L時(shí),反應(yīng)6 h,肌苷轉(zhuǎn)化率達(dá)到63.36%。在添加0.3%表面活性劑Trion-x-100時(shí),肌苷轉(zhuǎn)化率可提高到74.59%。Yuan等[38]用M.morganii酸性磷酸化酶突變株全細(xì)胞進(jìn)行生物催化生產(chǎn)肌苷酸的研究,底物濃度為肌苷120 mmol/L和焦磷酸鈉200 mmol/L時(shí),反應(yīng)7 h,肌苷酸產(chǎn)率為99.65%,此為目前報(bào)道最高指標(biāo)。

4 總結(jié)與展望

酸性磷酸酶催化肌苷/鳥苷制備呈味核苷酸反應(yīng)條件溫和,不需要保護(hù)基團(tuán)和提供ATP,而且磷酸酶具有專一性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。日本味之素公司最早采用酸性磷酸酶轉(zhuǎn)化工藝工業(yè)化生產(chǎn)呈味核苷酸,產(chǎn)量占日本呈味核苷酸總產(chǎn)量39%以上。酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)核苷酸尚未在國內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。限制因素主要為生產(chǎn)成本高、酶活力不穩(wěn)定、成品分離提純難度大和收率低等諸多問題。針對(duì)上述瓶頸,近年來在酶法轉(zhuǎn)化核苷酸過程中,不斷有新工藝得到報(bào)道與應(yīng)用,研究方向主要集中在酶的高效轉(zhuǎn)化、磷酸鹽的回收利用和鳥苷酶法磷酸化等工藝過程,工藝指標(biāo)穩(wěn)定提升的同時(shí),一系列存在的生產(chǎn)難題也在不斷得以解決和實(shí)現(xiàn)突破,相信在技術(shù)成熟后酸性磷酸酶轉(zhuǎn)化法必將為核苷酸生產(chǎn)帶來巨大變革。