方 明，袁 立，黃 龍

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科，南昌 330006)

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤。其中，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌的85%[1]，而肺腺癌是NSCLC最常見(jiàn)的病理亞型，約占50%[2]。盡管傳統(tǒng)治療及靶向治療已取得一定成功，但肺癌的五年總生存率仍只有10%～15%[3]。近年免疫相關(guān)的靶向治療如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4、程序性死亡受體1(PD-1)和程序性死亡受體-配體1(PD-L1)的抗體靶向治療已在許多惡性腫瘤中顯示出較好的療效，在晚期NSCLC的治療中亦發(fā)揮一定的作用[4-5]，提示免疫相關(guān)的靶向治療可能在肺癌治療中具有潛在作用。

LncRNA是長(zhǎng)度≥200核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，無(wú)或低翻譯潛力[6]，能在表觀(guān)遺傳、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，廣泛參與機(jī)體的病理生理過(guò)程[7-9]。例如，lncRNA可充當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子或RNA聚合酶Ⅱ的靶點(diǎn)，破壞它們與靶基因啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的結(jié)合，從而促進(jìn)或抑制基因表達(dá)[8]，而這些靶基因中包含免疫相關(guān)的基因。目前，免疫相關(guān)的lncRNA在肺腺癌中研究報(bào)道較少。本文通過(guò)生物信息學(xué)分析肺腺癌中免疫相關(guān)的lncRNA及其與肺腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，可望為肺腺癌預(yù)后判斷及治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

自美國(guó)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://cancergenome.nih.gov/)篩選肺腺癌患者的數(shù)據(jù)資料。入選標(biāo)準(zhǔn)：1)患者資料含轉(zhuǎn)錄譜；2)患者臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)無(wú)生存時(shí)間資料的患者；2)生存時(shí)間≤30 d的患者。本研究共獲得477個(gè)肺腺癌的樣本資料。

1.2 研究方法

1.2.1 肺腺癌中免疫相關(guān)lncRNA的挖掘

1)參照文獻(xiàn)[10]的挖掘方法確定lncRNA圖譜；2)根據(jù)基因的ID將其分為蛋白質(zhì)編碼基因和非編碼基因，且僅保留NetAffx注釋文件中的長(zhǎng)非編碼基因；3)從Molecular Signatures Database v7.0中提取免疫基因[11](immune system process M13664，Immune response M19817)；4)使用美國(guó)Cytoscape軟件3.5.0[12]構(gòu)建免疫-lncRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)獲得免疫相關(guān)的lncRNA(P<0.001)。參照文獻(xiàn)[13-15]確定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分?；颊叩娘L(fēng)險(xiǎn)評(píng)分參照以下公式計(jì)算：風(fēng)險(xiǎn)值=基因1值×lncRNA1值+基因2值×lncRNA2值+…+基因n值×lncRNAn值。采用單變量Cox回歸分析分配風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，篩選預(yù)后相關(guān)lncRNA基因并依據(jù)其P值進(jìn)行升序排列。以P=0.001作為臨界值。以中位風(fēng)險(xiǎn)值為界值，將入選的肺腺癌分為低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組。

1.2.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R3.6.1軟件和SPSS26.0軟件對(duì)各患者的基線(xiàn)資料(年齡、性別、TNM分期、T分期、N分期、M分期及風(fēng)險(xiǎn)值)分別進(jìn)行單變量、多變量Cox回歸分析。單變量Cox回歸分析用于預(yù)測(cè)患者生存的預(yù)后因素；多變量Cox回歸分析用于預(yù)測(cè)患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。使用R3.6.1軟件和limma包進(jìn)行主成分分析，研究基于免疫基因、免疫相關(guān)lncRNA、風(fēng)險(xiǎn)值和全基因表達(dá)譜的低、高危人群之間的三維可視化。使用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析?；蚪M富集分析(http://www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)分析2組之間的功能注釋。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA的篩選

數(shù)據(jù)庫(kù)挖掘獲得14 142個(gè)lncRNA和331個(gè)免疫相關(guān)基因，關(guān)聯(lián)分析獲得1133個(gè)免疫相關(guān)的lncRNA。單因素COX回歸分析獲得15個(gè)免疫相關(guān)的lncRNA(圖1)。多因素COX回歸分析獲得6個(gè)免疫相關(guān)的lncRNA，分別為AL161431.1、AC079949.2、LINC00707、AC010980.2、AC068338.3、AC123595.1。

圖1 與肺腺癌預(yù)后相關(guān)的免疫相關(guān)lncRNA的風(fēng)險(xiǎn)值(單因素Cox回歸分析)

2.2 6個(gè)免疫相關(guān)lncRNA的表達(dá)及其與生存的關(guān)系

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分結(jié)果顯示，低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組分別有239例和238例。AL161431.1、AC079949.2、LINC00707和AC010980.2在高風(fēng)險(xiǎn)組表達(dá)量高，而AC068338.3、AC123595.1在低風(fēng)險(xiǎn)組表達(dá)量高(圖2)。隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分遞增，死亡人數(shù)遞增；低風(fēng)險(xiǎn)組總體生存期(OS)較高風(fēng)險(xiǎn)組更長(zhǎng)(P<0.000 1)，其中5年生存率分別為53.4%和18.2%(圖3)。

圖2 6個(gè)lncRNA在高、低風(fēng)險(xiǎn)組中的表達(dá)

圖3 6個(gè)lncRNA的表達(dá)與患者生存的關(guān)系

2.3 Cox回歸分析情況

單因素Cox回歸分析顯示，T分期、TNM分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是肺腺癌患者的預(yù)后因素；多因素Cox回歸分析顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和TNM分期是與肺腺癌患者OS相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后因素。見(jiàn)圖4。在6個(gè)免疫相關(guān)的lncRNA中AC068338.3隨著T分期和N分期的升高，其表達(dá)量減少；AC010980.2和AC079949.2表達(dá)量與性別相關(guān)(P<0.01)；6個(gè)lncRNA表達(dá)量與年齡無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)圖5。

A—F:lncRNA表達(dá)依次與T分期、N分期、M分期、TNM分期、年齡和性別的關(guān)系。

圖5(續(xù))

2.4 主成分分析情況

主成分分析顯示，2組風(fēng)險(xiǎn)值有顯著差別，而免疫基因、免疫相關(guān)lncRNA和全基因表達(dá)譜相互混合。見(jiàn)圖6。

圖6 主成分分析

2.5 基因富集分析情況

基因富集分析結(jié)果顯示，基因功能注釋[11,16]表現(xiàn)為高、低風(fēng)險(xiǎn)組在免疫系統(tǒng)過(guò)程和免疫應(yīng)答通路中均有富集。見(jiàn)圖7。

圖7 基因富集分析

3 討論

有研究[17]顯示PD-L1作為預(yù)測(cè)腫瘤免疫治療療效的標(biāo)志物，其特異性并不高。故尋找更為敏感及特異的預(yù)后標(biāo)志物在腫瘤治療中具有重要意義。lncRNA作為一類(lèi)癌癥預(yù)后標(biāo)志物，對(duì)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)也具有重要作用。例如，lncRNA NRON通過(guò)隔離細(xì)胞質(zhì)中磷酸化的去磷酸化活化T細(xì)胞核因子(NFAT)來(lái)維持T細(xì)胞的靜止?fàn)顟B(tài)[18]。本研究發(fā)現(xiàn)6個(gè)免疫相關(guān)的lncRNA即AL161431.1、AC079949.2、LINC00707、AC010980.2、AC068338.3、AC123595.1。其中，有研究[19-22]發(fā)現(xiàn)LINC00707作為癌基因，能促進(jìn)多種癌細(xì)胞包括肺腺癌、大腸癌、乳腺癌及腎癌等的增殖；AL161431.1也被證實(shí)能促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖和遷移[23]；AC123595.1被認(rèn)為用于評(píng)估乳腺癌的預(yù)后[24]。本研究依據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將肺腺癌分為高、低風(fēng)險(xiǎn)組，多因素Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是與肺腺癌患者OS相關(guān)的獨(dú)立預(yù)后因素。

lncRNA與免疫相關(guān)的腫瘤微環(huán)境的關(guān)系密切。免疫相關(guān)的lncRNAs在免疫細(xì)胞中呈較高的表達(dá)，并與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)顯著相關(guān)。而有研究[25-26]顯示腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞增多和CD4+/CD8+T細(xì)胞比例升高均與非小細(xì)胞肺癌的良好預(yù)后和生存有關(guān)。此外，lncRNAs不僅影響骨髓細(xì)胞的分化、發(fā)育及免疫細(xì)胞中炎癥基因的表達(dá)[27]，也參與免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)回路。LINC00301通過(guò)靶向TGF-β增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)降低CD8+T細(xì)胞數(shù)量[28]。本研究獲得的6個(gè)免疫相關(guān)lncRNA中AC079949.2、AC010980.2、AC068338.3和AC123595.1在肺癌領(lǐng)域尚未被研究，LINC00707和AL161431.1作為免疫相關(guān)的癌基因，是否參與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的激活仍有待進(jìn)一步研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)AC068338.3隨著肺腺癌的T和N分期的升高而表達(dá)下降，提示其可能是潛在的抑癌基因。與本研究相似，LI等[29]發(fā)現(xiàn)2個(gè)免疫相關(guān)lncRNA簇，其中簇1代表更高的突變頻率，特別是突變基因，也能預(yù)測(cè)肺腺癌預(yù)后。PAGS等[30]采用免疫評(píng)分作為結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)免疫評(píng)分高的患者5年復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)最低。提示本研究中的6個(gè)免疫相關(guān)的lncRNA可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境影響肺腺癌預(yù)后。

綜上，本研究確定了6個(gè)與肺腺癌免疫相關(guān)的lncRNA，并發(fā)現(xiàn)其可預(yù)測(cè)肺腺癌患者預(yù)后，有助于指導(dǎo)臨床實(shí)踐。但本研究存在一定的局限性。例如，單因素及多因素COX回歸分析顯示肺腺癌患者M(jìn)分期與其預(yù)后不相關(guān)，這與臨床實(shí)踐不符，可能與M1期患者例數(shù)較少(24例)而M0期患者例數(shù)較多(322例)有關(guān)。