章 甜， 賈思靜， 孫冬雪， 龍奉璽， 唐東昕， 楊 柱

1 貴州中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院， 貴陽 550025； 2 貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腫瘤科， 貴陽 550001

肝癌作為我國常見的一種惡性程度較高的腫瘤，死亡率較高且呈上升趨勢，位居全球癌癥的第三位[1]?，F(xiàn)臨床多采用手術(shù)、放化療等多種方法聯(lián)合治療，但治療效果尚未達(dá)到預(yù)期。且相較于毒副反應(yīng)較大的化學(xué)治療，中醫(yī)藥作為腫瘤治療常用的輔助治療方式，其減毒增效的特點有利于提高患者的治療效果及生存質(zhì)量。

藥對是中醫(yī)臨床醫(yī)師在治療過程中常用的一種獨具特色的藥物配伍方式，其組成相較方劑較為簡單，但藥對皆由“病、證、癥”出發(fā)，精簡配對，亦可發(fā)揮綜合效用，增強療效。本文研究基于國醫(yī)大師劉尚義教授臨床辨治腫瘤的數(shù)據(jù)挖掘分析。藥對“川楝子-延胡索”是劉尚義教授臨床常用的一組行氣、止痛經(jīng)方藥對[2]，二藥既是藥對，亦是名方金鈴子散的組成。金鈴子散出自于金元四大家之一劉完素所著醫(yī)書《素問·病機氣宜保命集》，其中川楝子可疏肝行氣、清肝瀉火；延胡索可行氣活血、祛瘀止痛，兩者配伍具有清肝瀉熱、活血散瘀定痛之效。此外，現(xiàn)代藥理學(xué)研究[3-5]表明川楝子、延胡索均具有良好的抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛作用。但目前研究尚未有完整、明確的藥對“川楝子-延胡索”用于治療肝癌的藥效機制，故開展此次研究提供部分理論基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 搜集、篩選藥對“川楝子-延胡索”的成分及對應(yīng)靶點 分別以“川楝子”“延胡索”為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中檢索搜集中藥成分，以“口服生物利用度(OB)≥30%，化合物的類藥性(DL)≥0.18”為條件篩選藥物有效成分，查找有效成分的對應(yīng)靶點，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫(http：//www.uniprot.org/)將所有作用靶點統(tǒng)一為對應(yīng)基因名稱。

1.2 查找、篩選藥對“川楝子-延胡索”治療肝癌的靶點基因 分別以“hepatic carcinoma”“hepatic cancer”“hepatocellular carcinomas”“l(fā)iver cancer”為關(guān)鍵詞在疾病靶點Genecards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中檢索查找肝癌的相關(guān)基因并導(dǎo)出結(jié)果。在Excel表格中選用兩倍中位數(shù)公式并刪除重復(fù)靶點后篩選出與肝癌關(guān)系更為緊密的基因。最后將藥對的藥物基因、肝癌基因相映射得出交集基因，該交集基因即為藥對治療肝癌的靶點基因。

1.3 構(gòu)建“藥對-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò) 將藥對中“川楝子”“延胡索”篩選后的藥物活性成分及靶點基因?qū)隒ytoscape 3.7.1軟件中，從而構(gòu)建藥對藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 構(gòu)建靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 將交集靶點基因上傳至String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，限定物種為“Homo sapiens”，分析藥對“川楝子-延胡索”治療肝癌的潛在靶點信息及靶點蛋白之間的相互作用關(guān)系，并借助Cytoscape 3.7.1軟件將所得靶點蛋白信息進(jìn)行可視化分析。

1.5 分析靶點通路 為了更進(jìn)一步的分析、明確藥對“川楝子-延胡索”的靶點基因在治療肝癌過程中發(fā)揮的生物學(xué)功能及相關(guān)重要通路，將靶點基因輸入至Metascape數(shù)據(jù)庫(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)進(jìn)行GO富集分析(含生物過程、細(xì)胞組分、分子功能三部分)、 KEGG 信號通路富集分析，并通過易漢博生物信息在線做圖網(wǎng)站Image GP(http://www.ehbio.com/ImageGP/)將分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 藥對“川楝子-延胡索”的成分及對應(yīng)作用靶點 在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以前述方法進(jìn)行檢索、篩選，得出川楝子有效活性成分9個，其中melianone(MOL002047)、Nimbolidin D(MOL002048)、Nimbolin A(MOL002053)無對應(yīng)靶點，予以剔除，故其有效成分為6個，對應(yīng)靶點為181個；延胡索有效活性成分49個，對應(yīng)靶點1097個；兩味中藥共同成分1個，為quercetin(MOL000098)，共同靶點基因154個。成分具體情況見表1。

表1 藥對“川楝子-延胡索”中中藥活性成分詳情

將藥對“川楝子-延胡索”對應(yīng)靶點基因與Uniprot 數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)人類基因進(jìn)行匹配，篩選后得出川楝子對應(yīng)靶點164個，延胡索對應(yīng)靶點961個，共同靶點143個，去重后藥對“川楝子-延胡索”對應(yīng)靶點基因共199個。

2.2 藥對“川楝子-延胡索”治療肝癌的靶點基因 檢索肝癌的相關(guān)基因共42 992個，經(jīng)兩倍中位數(shù)及去重篩選后得出肝癌的相關(guān)基因共4340個；其中與藥對“川楝子-延胡索”對應(yīng)靶點基因相交集的基因共162個。

2.3 “藥對-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò) 對川楝子、延胡索篩選藥物活性成分，交集靶點基因?qū)胫罜ytoscape 3.7.1軟件中構(gòu)建“藥對-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖(附錄1)。該網(wǎng)絡(luò)圖中共含有254個節(jié)點(包括2味中藥、54個化合物、162個潛在靶點基因)，1180條邊。分析該網(wǎng)絡(luò)中相關(guān)節(jié)點的度值可知，中藥活性成分中度值最大的是槲皮素(quercetin，A1)，其次為(S)-金黃紫堇堿[(S)-Scoulerine，YHS7]、異紫堇杷明堿(Isocorypalmine，YHS46)、刺罌粟堿(stylopine、YHS30)、延胡索乙素(Hyndarin、YHS11)，說明該藥對在治療肝癌的過程中發(fā)揮主要作用的可能是以上活性成分。

2.4 藥對“川楝子-延胡索”治療肝癌的靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 將162個交集靶點基因上傳至String數(shù)據(jù)庫以分析蛋白之間的相互作用并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。此外將該分析數(shù)據(jù)以TSV格式導(dǎo)出并保存。通過Cytoscape 3.7.1軟件將該分析數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化分析，得出藥對“川楝子-延胡索”治療肝癌的靶點蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(附錄2)。分析數(shù)據(jù)可知，AKT1靶點蛋白中度值最高(118)，其次為IL6(103)、TP53(100)、VEGFA(95)、TNF(90)、CASP3(88)、JUN(88)、MAPK1(88)、MYC(86)、EGFR(83)，說明藥對在治療肝癌時以上基因發(fā)揮了重要作用。

2.5 藥對“川楝子-延胡索”治療肝癌的靶點基因的GO功能、KEGG信號通路分析 借助Metascape數(shù)據(jù)庫分析162個交集靶點基因，篩選后得出GO富集條目共2606個(P值均<0.01)，包括2321個生物學(xué)進(jìn)程(BP)，主要涉及對有毒物質(zhì)、無機物、創(chuàng)傷愈合的反應(yīng)；細(xì)胞對有機環(huán)狀化合物、有機氮化合物及外界刺激的反應(yīng)；細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)控、細(xì)胞死亡的正調(diào)控；血管生長發(fā)育、凋亡的信號通路等；186個分子功能(MF)，主要涉及蛋白激酶結(jié)合、蛋白酶結(jié)合、磷酸酶結(jié)合、氧化還原酶活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白質(zhì)同聚活性、核受體活性、激素受體結(jié)合等； 99類細(xì)胞組成(CC)，主要涉及膜筏、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、神經(jīng)細(xì)胞體、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、細(xì)胞質(zhì)核周區(qū)、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞頂部、黏著連接、溶質(zhì)液泡、囊泡腔等(圖1)。此外，KEGG分析得出相關(guān)信號通路共351條，其中主要涉及癌癥通路(Pathways in cancer)、AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)、結(jié)直腸癌(Colorectal cancer)、甲狀腺激素信號通路等(圖2)。

圖1 藥對“川楝子-延胡索”治療肝癌的靶點基因的GO功能分析(含BP、MF、CC)

圖2 藥對“川楝子-延胡索”治療肝癌的靶點基因的KEGG信號通路分析

3 討論

隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的發(fā)展，許多研究人員采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析中藥成分、評估藥理作用，并通過可視化分析藥物分子間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系及相關(guān)靶蛋白、通路數(shù)據(jù)，以探討中藥、方劑發(fā)揮療效的可能分子機制[6-8]。如鞏曉杰等[9]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究薏苡仁治療肝癌的有效活性成分；歐陽思露等[10]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析莪術(shù)的抗癌機理；李菁等[11]應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對接探析四逆散治療肝癌的潛在分子機制。因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對于中藥的藥效開發(fā)以及預(yù)測潛在的作用機制具有重要意義。

藥對“川楝子-延胡索”現(xiàn)臨床廣泛應(yīng)用于慢性肝炎、肝硬化、膽囊炎等肝膽疾病，此外亦用于癌癥的治療[12]。研究[13-14]表明，通過半仿生提取技術(shù)處理金鈴子散并將其作用于人宮頸癌HeLa細(xì)胞、人肝癌HepG2細(xì)胞后，均表達(dá)了一定的抗癌作用，且對肝癌細(xì)胞作用更為突出；川楝子粗提取物可通過調(diào)節(jié)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480、小鼠大腸腺癌細(xì)胞CT26的凋亡進(jìn)程以抑制癌細(xì)胞的增殖[15]；延胡索粉末對小鼠H22肝癌具有明顯抑制作用且與其濃度呈一定依賴性[16]。

此次研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析藥對“川楝子-延胡索”中中藥活性成分，構(gòu)建成分、肝癌靶點相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，說明藥對治療肝癌是多個成分、多個靶點共同作用的綜合過程。

通過上述分析發(fā)現(xiàn)藥對中發(fā)揮重要作用的成分可能是槲皮素、(S)-金黃紫堇堿、異紫堇杷明堿、刺罌粟堿、延胡索乙素。槲皮素是多種中藥的共有成分，也是腫瘤研究的熱點成分。槲皮素屬于黃酮類藥物，其可通過調(diào)控細(xì)胞生長周期、降低細(xì)胞代謝活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以抑制肝癌細(xì)胞增殖，從而發(fā)揮抗肝癌作用[17-20]。(S)-金黃紫堇堿、異紫堇杷明堿、刺罌粟堿、延胡索乙素均屬于異喹啉類生物堿，此類生物堿為延胡索中的主要活性成分，藥理研究[21-23]表明其具有抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、抗炎等多種作用。在抗腫瘤作用方面，異喹啉類生物堿可發(fā)揮明顯的抗肝癌效用，其主要機制在于通過不同通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡與自噬，抑制細(xì)胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移，控制腫瘤血管生成[24-25]。

通過藥對“川楝子-延胡索”治療肝癌的靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)可知該網(wǎng)絡(luò)關(guān)系中的主要作用包括AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF、CASP3等靶點。分析以上主要發(fā)揮治療肝癌作用的靶點及作用，可將其總結(jié)為以下幾個方面。(1)炎癥相關(guān)因子介導(dǎo)腫瘤進(jìn)程(IL6、TNF)：IL6是具有多種效應(yīng)的的炎癥細(xì)胞因子，當(dāng)機體出現(xiàn)急性損傷時呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[26]，且參與和調(diào)控了肺癌、肝癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[27-28]。TNF 包括TNFα和TNFβ，是一類能直接殺傷并造成腫瘤細(xì)胞死亡的細(xì)胞因子。其中TNFα在調(diào)控腫瘤的發(fā)展進(jìn)程中具有雙向調(diào)節(jié)作用，既具有抗腫瘤作用亦可促進(jìn)腫瘤生長，而具體表現(xiàn)為何種作用取決于TNFα的濃度。當(dāng)TNFα濃度較高時，可刺激其他相關(guān)炎癥因子的釋放、抑制腫瘤血管新生以最大程度發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)；當(dāng)TNFα濃度較低時可通過NF-κB信號通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移發(fā)生以發(fā)揮促腫瘤作用[29-30]。(2)抑制血管新生：VEGFA 屬于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，可升高血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活、遷移以促進(jìn)血管生成[31]。肝癌血供豐富，新生血管的生成可直接影響其病程發(fā)展與預(yù)后，因此降低VEGF的表達(dá)、抑制血管生成、改善肝癌微環(huán)境可有效控制肝癌的生長、轉(zhuǎn)移[32]。(3)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡(AKT1、TP53、CASP3)：AKT1(即AKT)在PI3K/Akt信號通路中發(fā)揮重要作用，是通路中的關(guān)鍵因子。研究[33]表明，在多種腫瘤中均可發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路對于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、生長具有調(diào)控作用，這與AKT1的磷酸化被異?；罨芯o密關(guān)系。此外，研究[34]表明該信號通路的活化與肝癌的生長有關(guān)，且與肝癌患者臨床病理特征密切相關(guān)。TP53(即P53)是常見的抑癌基因，可抑制腫瘤細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[35]。研究[36]發(fā)現(xiàn)P53容易發(fā)生突變，人類約50%的癌癥均存在P53突變。突變后P53喪失抑癌活性，在腫瘤細(xì)胞增殖中起促進(jìn)作用，且抑制細(xì)胞凋亡，從而加速腫瘤發(fā)展[37]。CASP3(即Caspase 3)是Caspase家族中重要的一員，該家族在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行過程中具有不可或缺的作用[38-39]，且 Caspase 3的激活也標(biāo)志著細(xì)胞的凋亡必然開始[40-41]。而腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，研究[42]表明可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。

GO分子功能闡明藥對發(fā)揮作用主要與細(xì)胞的增殖與凋亡、血管的生長發(fā)育有關(guān)；KEGG通路分析結(jié)果表明藥對治療肝癌過程涉及多個通路，與之相關(guān)的通路包括癌癥通路、AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、NF-κB信號通路等。多項研究[43-48]表明NF-κB信號通路參與調(diào)控腫瘤的增殖、凋亡過程。NF-κB是細(xì)胞中的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在大多數(shù)細(xì)胞中，NF-κB表現(xiàn)為靜息狀態(tài)[49]。在炎癥等刺激下，上游信號通路活化后可激活NF-κB，而激活后的NF-κB可與對應(yīng)的靶序列在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合并調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子等以發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[50-51]。AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路均為其上游通路。在AGE-RAGE信號通路中，AGE與其受體RAGE結(jié)合后可活化NF-κB信號通路，使NF-κB呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，進(jìn)而調(diào)控其下游基因IL6、TNFα的表達(dá)[52]。亦有研究[53-55]表明TNF與TNF受體1結(jié)合激活TNF信號通路后，可刺激細(xì)胞生長因子的表達(dá)以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲，誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)上調(diào)以促進(jìn)肝癌的血管新生從而加速肝癌的惡化，而此過程NF-κB信號通路具有中心主導(dǎo)作用。通路結(jié)果與重要靶點分析相吻合，互相驗證了文中靶點、通路治療肝癌的可能機制。

上述分析說明了藥對“川楝子-延胡索”治療肝癌是多種成分、多個靶點基因與信號通路之間相互影響、共同發(fā)揮作用的過程，其治療過程主要是靶點通過介導(dǎo)相關(guān)通路調(diào)控腫瘤的增殖、凋亡。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：章甜負(fù)責(zé)課題設(shè)計、擬定寫作思路、撰寫論文；賈思靜、孫冬雪負(fù)責(zé)收集數(shù)據(jù)及資料分析；龍奉璽、楊柱負(fù)責(zé)修改論文；龍奉璽、唐東昕指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

附錄1見二維碼

附錄2見二維碼