黃偉雄，安振宇，方 仁，堯金燕，龍 興

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南寧南亞熱帶果樹科學(xué)觀測試驗(yàn)站，廣西 南寧 530007；2.廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007)

【研究意義】番荔枝(AnnonasquamosaLour.)是世界五大熱帶名果之一，在我國廣西、廣東、海南、福建和云南等氣候溫暖地區(qū)均有種植，在區(qū)域特色農(nóng)業(yè)發(fā)展新形勢下其產(chǎn)業(yè)發(fā)展更迅猛。隨著種植面積的逐年增加，番荔枝病害問題也日趨嚴(yán)重，其中根腐病是危害最嚴(yán)重、最難防控的病害之一[1-3]。根腐病多為土壤中寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)、棕?cái)R疫霉(P.palmivora)、鐮刀菌(Fusariumsp.)等多種真菌復(fù)合侵染所引發(fā)的病害，但目前大量病原真菌尚未分離鑒定。番荔枝在我國屬于新興熱帶優(yōu)稀果樹，對其各領(lǐng)域的研究基礎(chǔ)均較薄弱，現(xiàn)有的相關(guān)研究也僅集中于栽培防控技術(shù)方面，田間病害防控尚缺乏相應(yīng)的理論與技術(shù)支撐。本研究團(tuán)隊(duì)開展田間病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，廣西南寧、崇左、百色和玉林等地的番荔枝種植區(qū)均不同程度發(fā)生番荔枝根腐病，部分3齡以上果園發(fā)病率達(dá)20%左右，嚴(yán)重的果園發(fā)病率在45%以上，果農(nóng)的種植效益及產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展受到嚴(yán)重影響?；诟咄繙y序(High-throughput sequencing)技術(shù)可高效、快速、準(zhǔn)確地檢測土壤微生物群落的多樣性，揭示土壤微生物豐度及菌種組成，在探究根際土壤微生物層面已得到廣泛運(yùn)用[4-6]。因此，開展廣西地區(qū)感染根腐病番荔枝根際土壤微生物多樣性分析，對篩選鑒定番荔枝根腐病病原菌、研發(fā)其防治藥劑及促進(jìn)番荔枝產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】根腐病在全球范圍內(nèi)及各種作物上均普遍發(fā)生，嚴(yán)重地區(qū)導(dǎo)致作物欠產(chǎn)甚至絕收，是世界農(nóng)業(yè)的嚴(yán)重病害。鐮刀菌是根腐病致病性最強(qiáng)、最常見的植物病原之一[7]，可引起多種作物發(fā)生病害，在主要糧食作物小麥和玉米[8]及鮮食水果類番荔枝和草莓等作物上均有發(fā)生[9-12]。針對番荔枝根腐病病原菌的鑒定及致病性已有研究報(bào)道，但是關(guān)于其致病病原種類說法不一。Kristensen等[13]研究發(fā)現(xiàn)，根腐病菌侵染會不同程度影響番荔枝根部酶或其他類物質(zhì)的活性和數(shù)量，減弱根系對土壤水分和養(yǎng)分的吸收，發(fā)病初期可導(dǎo)致減產(chǎn)10%～60%，嚴(yán)重時(shí)甚至絕產(chǎn)。莫曉鳳等[14]從攜帶進(jìn)境的番荔枝種苗上發(fā)現(xiàn)根腐病，經(jīng)鑒定該病的病原菌為潮濕鐮刀菌(F.udum)。Fitzel 等[15]從番荔枝樹體中分離到可引起番荔枝根腐病發(fā)生的Pythiumsp.和Phytophthorasp.病菌。王惠哲等[16]、高愛平等[17]研究顯示，尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)也可引發(fā)番荔枝根腐病，該病菌致病性強(qiáng)，較易在土壤板結(jié)、通透性差、排灌不良或疏果不當(dāng)?shù)墓麍@發(fā)生，受侵染后番荔枝根頸腐爛，樹體衰弱致死。Casasnovas等[8]、詹儒林等[9]研究發(fā)現(xiàn)，根腐病是嚴(yán)重危害番荔枝的病害，尤其是普通番荔枝或以普通番荔枝為砧木的植株感病較重，發(fā)病后一般經(jīng)過3～4年整個(gè)果園植株陸續(xù)死亡?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于Illumina測序的宏基因分析已在探究根際土壤微生物層面得到廣泛運(yùn)用，但目前從分子層面對番荔枝根腐病的研究(如轉(zhuǎn)錄組、基因、蛋白等)鮮見報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用高通量測序技術(shù)對番荔枝根際土壤微生物進(jìn)行測序分析，并進(jìn)行序列拼接比對，探究感染根腐病菌番荔枝根際土壤微生物群落的多樣性和分布規(guī)律，為篩選鑒定根腐病病原菌及研發(fā)防控藥劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

感染根腐病和健康番荔枝植株根際土壤樣品采自廣西南寧市武鳴區(qū)寧武鎮(zhèn)雙盧村(東經(jīng)108°08′11.54″，北緯23°07′5.59″，屬亞熱帶季風(fēng)區(qū)，海拔98 m)2齡番荔枝根際。該果園于2019年5月發(fā)現(xiàn)少量番荔枝植株長勢較弱，新葉黃綠，老葉變黃枯萎，夏季整株生長較弱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 土壤樣品及病株根部樣品采集 于2019年8月在果園中選取感染根腐病的番荔枝植株(整株葉片變黃、枝條干縮)，在距離主干10 cm范圍內(nèi)向下挖取10～30 cm土層中表面顏色呈灰色和褐色的主根及側(cè)根根須，將其表面粘附土壤(感病根際土壤)抖落于經(jīng)事先滅菌的錫箔紙上，去除植物殘?bào)w后包好，標(biāo)記為RRD1(Root rot disease 1)，置于液氮中保存。采集好土壤樣品后截取5～8 cm側(cè)根，作為病株根部樣品，置于干冰中保存，用于病原菌分離鑒定；在離已選取病株15 m以上的東西南北4個(gè)方向，各尋找1株癥狀與已選取植株相似的病株，使用與上述相同的方法采集其根際土壤，分別標(biāo)記為RRD2～RRD5，置于液氮中保存；在果園東西南北中5個(gè)方位選取與上述病株臨近的健康植株(新生枝條較多、長勢健壯且相鄰均無發(fā)病癥狀的植株)，以同樣方式采集其根際土壤(健康根際土壤)，標(biāo)記為CK1～CK5。樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，從液氮中取出迅速轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存，送樣時(shí)干冰保存送至廣州基迪奧生物科技有限公司提取DNA，進(jìn)行高通量測序。通過統(tǒng)計(jì)測序生成序列數(shù)、序列長度、GC含量(G和C在堿基總數(shù)中所占比率)、Q20(質(zhì)量值≥20的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的百分比)和Q30(質(zhì)量值≥30的堿基數(shù)占總堿基數(shù)的百分比)進(jìn)行評估分析。

1.2.2 土壤微生物基因組總DNA提取及ITS序列擴(kuò)增 參照Fast DNATM SPIN Kit for Soil試劑盒說明提取土壤微生物基因組總DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，用滅菌的超純水稀釋至1 ng/μL，保存于-80 ℃冰箱備用。分別以ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')為引物對真菌ITS1區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增；以357F(5'-CTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和907R(5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3')為引物對細(xì)菌V3+V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系20.0 μL：5×Fastpfu Buffer 4.0 μL，上、下游引物各0.8 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，F(xiàn)astpfu DNA聚合酶 0.4 μL，BSA 0.2 μL，DNA模板 10 ng。取PCR產(chǎn)物3.0 μL用1.8%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 使用 FLASH v1.2.7，通過overlap對每個(gè)樣品的 reads 進(jìn)行拼接、序列過濾、雙端拼接，得到優(yōu)化序列(Tags)；使用 Trimmomatic v0.33對拼接得到的 Raw tags進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量Tags 數(shù)據(jù)(Clean tags)；使用 UCHIME v4.2鑒定并去除嵌合體序列，得到最終有效數(shù)據(jù)(Effective tags)。將感病根際土樣(RRD1～RRD5)與健康根際土樣(CK1～CK5)進(jìn)行多重比對分析，獲得重合結(jié)果序列，將序列進(jìn)行聚類，并根據(jù)可操作分類單元(OTU)序列組成得到其物種分類；基于OTUs分析結(jié)果，對樣品進(jìn)行分類學(xué)分析，獲得各樣品在界、門、綱、目、科、屬和種分類水平上的群落結(jié)構(gòu)圖、物種聚類熱圖、屬分類水平系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹及分類學(xué)樹狀圖。

1.2.4 病原菌分離及鑒定 采用常規(guī)組織分離法進(jìn)行病原菌分離純化：將病株根部樣品從干冰中取出，用流水洗凈，吸水紙吸干水分后切取根部病健交界處組織，經(jīng)75%酒精消毒后，在10%次氯酸鈉溶液中浸泡10 min，0.1%升汞溶液浸泡40 s，滅菌水漂洗3次后接種在PDA培養(yǎng)基上，25 ℃下培養(yǎng)3～4 d，出現(xiàn)菌落后，挑取菌落邊緣進(jìn)行純化，依據(jù)純化后的菌落特征分類編號，統(tǒng)計(jì)分離物的種類和數(shù)量，4 ℃保存?zhèn)溆谩２≡鷕DNA-ITS序列檢測：利用病原菌rDNA-ITS 序列和翻譯延長因子EF-1a基因序列(引物EF-1a F：5'-ATGGGTAAGGARGACAAGAC-3'和EF-1a R：5'-GGARGTACCAGTSATCA TGTT-3'，反應(yīng)體系同1.2.2)進(jìn)行病原菌分子生物學(xué)鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估結(jié)果

利用Illumina HiSeq測序平臺對番荔枝根際土壤樣品中真菌ITS1區(qū)、細(xì)菌V3+V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增測序，以測序的原始序列片段(PE reads)進(jìn)行拼接及優(yōu)化，再進(jìn)行序列重復(fù)性及嵌合體過濾后得到有關(guān)真菌和細(xì)菌的序列數(shù)(表1)。感病和健康根際土壤樣品中真菌和細(xì)菌的平均序列長度(AvgLen)分別為247和422 bp及250和420 bp；GC含量為42.66%～57.06%；真菌的Q20和Q30均在96.34%以上，細(xì)菌的Q20和Q30均在92.30%以上，測序質(zhì)量良好，均達(dá)到測序拼接要求；真菌有效序列占總測序序列的81.39%以上，細(xì)菌有效序列占總測序序列的72.08%以上。綜上所述，番荔枝根際土壤樣品測序拼接結(jié)果可用于下一步微生物聚類及多樣性分析。

表1 番荔枝根際土壤樣品測序結(jié)果

2.2 番荔枝根際土壤微生物聚類分析結(jié)果

對測序的有效序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果(表2)表明，感病根際土壤樣品中真菌在界、門、綱、目、科、屬和種分類上聚類分布的序列數(shù)分別為68 737、62 577、57 800、51 960、47 103、44 669和35 866個(gè)，細(xì)菌在界、門、綱、目、科、屬和種分類上聚類分布的序列數(shù)分別為 48 432、48 422、48 272、45 663、40 207、31 424和18 943個(gè)；而健康根際土壤樣品中真菌在界、門、綱、目、科、屬和種分類上聚類分布的序列數(shù)分別為60 339、24 350、23 402、22 492、20 915、20 291和16 448個(gè)，細(xì)菌在界、門、綱、目、科、屬和種分類上聚類分布的序列數(shù)分別為30 089、30 089、30 048、29 459、29 223、28 757和26 212個(gè)?？梢姡笾Ω腥靖『笃涓H土壤的真菌數(shù)量明顯增多，細(xì)菌數(shù)量明顯減少。對比曹麗霞等[18]研究認(rèn)為植株感病后病原菌數(shù)量相對上升的觀點(diǎn)，推測引起廣西地區(qū)番荔枝根腐病發(fā)生的病原菌為真菌，但需對感病根際土壤和健康根際土壤樣品進(jìn)行豐度分析和多樣性分析，以進(jìn)一步確定具體的真菌(病原菌)種類。

表2 番荔枝根際土壤樣品各等級OTUs的聚類結(jié)果

2.3 番荔枝根際土壤真菌的Alpha多樣性分析結(jié)果

由表3可知，感病根際土壤真菌的OTU數(shù)量、物種種類、種群多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))和種群豐富度指數(shù)(Chao 1指數(shù)和ACE指數(shù))均顯著低于健康根際土壤(P<0.05，下同)，而物種均勻度指數(shù)(Simpson指數(shù))顯著高于健康根際土壤。可見，感病根際土壤真菌種類較少，但感病根際土壤中各種類真菌的含量較穩(wěn)定且分布較均勻。

表3 番荔枝患病及健康根際土壤真菌的Alpha多樣性

2.4 在不同分類水平上的豐度分析

根據(jù)NCBI中已有微生物物種的分類學(xué)數(shù)據(jù)庫，使用MEGAN軟件將測序得到的物種豐度信息回歸至數(shù)據(jù)庫的分類學(xué)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，對健康和感病根際土壤真菌在種水平進(jìn)行群落組成分析，結(jié)果見圖1。結(jié)合表1～2結(jié)果分析，感病根際土壤真菌測序共獲得79 883 對PE Reads，雙端 拼接、過濾后共產(chǎn)生71 204 個(gè) Clean tags序列，在NCBI中比對分析，發(fā)現(xiàn)在2.2中分別聚類分布于界、門、綱、目、科、屬和種分類上的68 737、62 577、57 800、51 960、47 103、44 669和35 866個(gè)序列歸類后對應(yīng)的真菌隸屬于2界5 門16綱36 目48 科81 屬96 種；在門和綱分類水平，子囊菌門糞殼菌綱真菌占總真菌種數(shù)的48.90%，子囊菌門座囊菌綱真菌占總真菌種數(shù)的16.00%；在種分類水平，F(xiàn).acutatum占總真菌種數(shù)的11.51%，F(xiàn).pseudensiforme占總真菌種數(shù)的7.93%，Rhizoctoniazeae占總真菌種數(shù)的0.15%，F(xiàn).dimerum占總真菌種數(shù)的0.12%，F(xiàn).sp IBL 03157約占總真菌種數(shù)的0.01%，Sclerotiniaceae約占總真菌種數(shù)的0.15%(圖1-A)。

結(jié)合表1～2結(jié)果分析，健康根際土壤真菌測序共獲得79954 對PE Reads，雙端拼接、過濾后共產(chǎn)生6 9475 個(gè) Clean tags序列，在NCBI中比對分析，發(fā)現(xiàn)在2.2中分別聚類分布于界、門、綱、目、科、屬和種分類上的60 339、24 350、23 402、22 492、20 915、20 291和16 448個(gè)序列歸類后對應(yīng)的真菌隸屬于3界7門17綱43目73科113屬160種；在門和綱分類水平，子囊菌門糞殼菌綱真菌占總真菌種數(shù)的48.90%，子囊菌門座囊菌綱真菌占總真菌種數(shù)的15.90%；在種分類水平，F(xiàn).acutatum占總真菌種數(shù)的1.68%(圖1-B)。

綜上所述，感染根腐病番荔枝根際土壤的微生物群落豐富度、多樣性指數(shù)均較健康根際土壤下降，土壤真菌種類較少，均勻度上升，土壤真菌各種類含量分布較均勻；感病根際土樣中F.acutatum含量明顯高于健康根際土壤。

同時(shí)，感病根際土壤中檢測出F.acutatum、F.pseudensiforme、Rhizoctoniazeae、F.dimerum、F.sp IBL 03157和Sclerotiniaceae6種根腐病病菌，而健康根際土壤只檢測出F.acutatum1種根腐病病菌，造成番荔枝感染根腐病是因?yàn)镕.acutatum含量上升還是因其他5種菌種的出現(xiàn)，需對番荔枝根腐病病株根部樣品進(jìn)行組織培養(yǎng)鑒定分析后才能確定。

2.5 病原菌形態(tài)學(xué)觀察和生物鑒定結(jié)果

從圖2可看出，感病番荔枝根際樣品在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)4 d后菌株形成中等量、呈放射狀的氣生菌絲；菌落直徑4.5 cm，菌落平鋪，全緣，呈圓形，白色，氣生菌絲絨狀，后期菌落中央淺黃褐色，菌絲生長的最低、最適和最高溫度分別為5、28和35 ℃；在氣生菌絲上長出的產(chǎn)孢細(xì)胞為菌絲形的單瓶梗，產(chǎn)孢梗長；菌絲膨大體(抱子囊)較多，球形或檸檬形，頂生或間生，小型分生抱子數(shù)量多，單胞，卵形、橢圓形或卵圓形，大型分生孢子月牙形，3～7個(gè)分隔，分隔明顯，頂孢呈錐形，大小為(45～75)μm×(4～5)μm，通過形態(tài)特征可鑒定為鐮刀菌。

采用供試引物對番荔枝根際土壤病原菌菌株進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)測序分析確定 ITS基因片段序列，將獲得的序列與 GenBank 中 BLAST 數(shù)據(jù)庫的核酸序列進(jìn)行同源性比對，結(jié)果(圖3)顯示菌株的rDNA-ITS序列與F.acutatum(登錄號：AY569567.1)同源性達(dá) 99.45%，說明擴(kuò)增出的rDNA-ITS序列(RRD-1)為F.acutatum的片段?？梢姡饛V西地區(qū)番荔枝感染根腐病的土壤病原菌疑似為F.acutatum。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，番荔枝感染根腐病后其根際土壤的真菌數(shù)量明顯增多，細(xì)菌數(shù)量明顯減少；感病根際土壤中檢測出F.acutatum、F.pseudensiforme、Rhizoctoniazeae、F.dimerum、F.sp IBL 03157和Sclerotiniaceae6種根腐病病菌，而健康根際土壤只檢測出F.acutatum1種根腐病病菌，再經(jīng)對患病根際土壤真菌培養(yǎng)及綜合病原形態(tài)特征和ITS 序列比對，發(fā)現(xiàn)菌株的 ITS序列與F.acutatum(登錄號：AY569567.1)同源性達(dá) 99.45%，經(jīng)高通量測序及土壤微生物純化鑒定培養(yǎng)后能說明土壤中含有F.acutatum，且在植株感病前后，菌種含量產(chǎn)生極大改變，初步認(rèn)為引起廣西地區(qū)番荔枝根腐病發(fā)生的病原菌疑為真菌鐮刀屬的F.acutatum。對于這一結(jié)論的驗(yàn)證，后續(xù)仍需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室及大田接種試驗(yàn)、病原菌分離培養(yǎng)和對比鑒定。

Shannon和Simpson指數(shù)可用于衡量群落多樣性，Chao 1和ACE指數(shù)可用于衡量群落豐度[12]。Alpha多樣性可反映單個(gè)樣品內(nèi)部的物種多樣性，稀釋曲線可反映測序數(shù)據(jù)量的合理性[15]。本研究中，感病番荔枝根際土壤微生物的群落豐富度、多樣性指數(shù)均較健康根際土壤下降，真菌種類較少，均勻度上升，土壤真菌各種類含量分布較均勻。

本研究認(rèn)為，真菌鐮刀屬的F.acutatum是引起番荔枝根腐病的致病菌，與曹麗霞等[18]、盧欣石等[19]研究認(rèn)為有些作物的根腐病是以鐮刀菌為主要致病菌的多種病原菌混合侵染所致，其中鐮刀菌的分布較廣、普遍存在于土壤和植物體內(nèi)，甚至在嚴(yán)寒的北極和干旱炎熱的沙漠都可存在的觀點(diǎn)一致。本研究采用Illumina HiSeq高通量測序技術(shù)對番荔枝患病根際土壤及健康根際土壤微生物組成和多樣性進(jìn)行測序分析，與張晶晶等[20]對人參、楊瑞先等[21]對牡丹、周亞男等[22]對藍(lán)莓、楊光柱等[23]對蘋果的研究方法相似。該研究結(jié)果可為探索拮抗根腐病的潛在微生物提供線索，為探入探究番荔枝—根腐病菌互作過程提供方向。

4 結(jié) 論

感染根腐病番荔枝根際土壤微生物的群落豐富度、多樣性指數(shù)均較健康荔枝根際土壤明顯下降，而真菌種類較少，均勻度上升，分布較均勻。經(jīng)病原菌形態(tài)學(xué)觀察和生物比對鑒定，初步確定引起廣西地區(qū)番荔枝根腐病的病原菌可能為真菌鐮刀屬的F.acutatum。