趙 陽，王 艷，林雪丹，羅阿東，陳 霄，李 潔，焦彥朝2，*

(1.六盤水市口岸服務(wù)中心，貴州 六盤水 553000；2.國家果蔬檢測重點實驗室(六盤水)，貴州 六盤水 553000；3.貴陽海關(guān)綜合技術(shù)中心，貴州 貴陽 550081)

菜豆象[Acanthoscelidesobtectus(Say)]屬鞘翅目(Coleoptera)豆象科(Bruchidae)三齒豆象屬(Acanthoscelide)，原產(chǎn)于南美和中美，目前已分布于亞洲、歐洲、非洲、美洲及大洋洲等5大洲。隨著國際經(jīng)濟貿(mào)易的頻繁往來，我國部分豆類產(chǎn)地有菜豆象分布，與我國相鄰的日本、緬甸等國家亦有分布[1-2]。菜豆象主要危害菜豆屬的植物，同時也危害蠶豆、綠豆及豌豆等其他多種豆類。其以幼蟲在豆粒內(nèi)隱蔽蛀食，造成豆粒的品質(zhì)和重量下降，尤其對豆類儲藏期間構(gòu)成較大威脅。研究表明，菜豆象危害不僅影響豆類發(fā)芽率，降低產(chǎn)量，而且在豆類儲藏期間的危害可造成重量損失達60%以上[3]，危害較大，被列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》[4]，在國際上被列為豆類植物的重要檢疫對象之一[5-6]。由于菜豆象傳播范圍廣、適應(yīng)性強、危害嚴重、防治困難，因此該蟲被農(nóng)業(yè)部列入《全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名單》，菜豆、蕓豆和豌豆等豆類植物籽粒列入應(yīng)施檢疫的植物及植物產(chǎn)品名單[7]。根據(jù)《全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物分布行政區(qū)名錄》，其中菜豆象在我國吉林、貴州及云南等3省44個縣(區(qū)、市)均已有疫情發(fā)生，且在貴州省內(nèi)37個縣(區(qū)、市)已有菜豆象危害[8]。

蕓豆也稱菜豆，是菜豆象的高危寄主。蕓豆具有較高的食用營養(yǎng)價值和藥用價值，是貴州傳統(tǒng)的出口土特產(chǎn)，也是出口創(chuàng)匯的農(nóng)副產(chǎn)品，蕓豆出口排貴州農(nóng)產(chǎn)品出口的第4位[9-10]。貴州省是我國蕓豆主產(chǎn)區(qū)之一，是全國第3大蕓豆出口省[11]，蕓豆對當(dāng)?shù)剞r(nóng)民增收具有重要意義。有研究顯示，貴州省菜豆象疫情較為嚴重[12]，畢節(jié)市所轄8個縣(區(qū))均有菜豆象疫情分布，有25萬kg豆類受害[13]，嚴重影響貴州省蕓豆的產(chǎn)量及品質(zhì)。

由于昆蟲早期蟲態(tài)(卵、幼蟲及蛹)的形態(tài)學(xué)鑒定一直都是鑒定工作中的難點，往往需要培養(yǎng)至成蟲才能準確鑒定到種，通過種間細微的形態(tài)差異在口岸進行檢疫檢驗需要至少10 d的檢測周期，不適于口岸快速檢疫的要求[6]。PCR法特異性強、靈敏度高且便捷快速[14]，不受樣本發(fā)育階段的影響，適用于我國進出境植物有害生物檢疫。鑒于此，針對貴州豆類產(chǎn)品的特點，對貴州蕓豆樣品進行隨機抽樣，采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對菜豆象的發(fā)生進行調(diào)查和鑒定，掌握貴州蕓豆中菜豆象疫情情況，以期為有效控制貴州蕓豆菜豆象的發(fā)生，提高有害生物檢疫技術(shù)，保障蕓豆產(chǎn)品出口安全提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品及來源

1.1.1 蕓豆樣品 114份蕓豆樣品采集于貴州蕓豆主產(chǎn)地六盤水、畢節(jié)及主要集散地貴陽等地市場，每份樣品約500 g。其中，貴陽29份，編號GY1～GY29；六盤水26份，編號LPS1～LPS26；畢節(jié)59份，編號BJ1～BJ59；企業(yè)送樣223份，編號為QY1～QY223。

1.1.2 試劑 DNA提取試劑盒MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit，PCR反應(yīng)預(yù)混液Premix Taq(2×)，引物C1、C2，購自Takara公司。

1.1.3 儀器 LXZ-260B270L人工氣候箱，寧波江南儀器廠；SZX16體視顯微鏡，日本OLYMPUS；5345梯度PCR儀，德國Eppendorf；Universal高壓電泳系統(tǒng)，美國BIO-RAD；DOCXRS化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國BIO-RAD。

1.2 方法

1.2.1 昆蟲飼養(yǎng)方法 檢查豆粒上是否有幼蟲注入孔，是否有“小窗”或羽化孔，每份樣品抽取一部分(盡量選取有蟲眼的蕓豆，100 g)放入人工氣候箱。根據(jù)菜豆象的生物學(xué)特性，將人工氣候箱溫濕度調(diào)至菜豆象卵期、幼蟲期最適的發(fā)育溫度30℃及相對濕度70%～80%，進行人工飼養(yǎng)，以獲取昆蟲成蟲樣本[5，15]。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定 對飼養(yǎng)出的昆蟲成蟲，在體視顯微鏡下根據(jù)菜豆象的形態(tài)學(xué)特征進行種類鑒定。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 PCR擴增體系：按照DNA提取試劑盒說明書提取菜豆象成蟲的DNA，利用菜豆象特異性引物(C1：GCCACCTTTCATGGAACTCAA，C2：TGCAAATACAGCTCCTATAGAAAGAACA)[16]進行PCR擴增，其預(yù)期擴增產(chǎn)物大小為192 bp。反應(yīng)總體系為50 μL，其中PCR反應(yīng)預(yù)混液Premix Taq(2×)25 μL、引物的終濃度均為0.2 μmol/L，模板DNA為200 ng，用無菌ddH2O補足50 μL。

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性50 s，50℃退火50 s，72℃延伸1 min，40個循環(huán)；72℃延伸10 min；反應(yīng)結(jié)束后4℃保存。PCR產(chǎn)物的檢測方法：取10 μL PCR產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠和1×TBE緩沖液中電泳50 min(80 V)，GoldView溶液染色20 min后經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)特征

通過體視顯微鏡觀察，成蟲體長2～4.5 mm，頭、前胸背板及鞘翅表皮黑色，鞘翅端部邊緣橘紅色。腹部橘紅色，僅腹板基部有時呈黑色；臀板橘紅色。觸角11節(jié)，其中第1～4節(jié)呈橘紅色絲狀，有時包括第5節(jié)基半部；第5～10節(jié)呈黑色鋸齒狀；末節(jié)端部尖細，呈橘紅色。鞘翅密被黃色毛，在近鞘翅基部、中部及端部有裸色毛斑。后足腿節(jié)腹面近端有1長而尖的大齒，后跟2～3個小齒，大齒的長度約為前2個小齒的2倍，符合菜豆象的形態(tài)學(xué)特征，初步判定為菜豆象[5，15]。

2.2 分子生物學(xué)鑒定

從圖1看出，以可疑菜豆象的成蟲基因組DNA為模板，使用菜豆象、綠豆象和四紋豆象的特異性引物進行擴增，僅菜豆象能夠擴增得到1個分子量為192 bp的特異性條帶，與目標基因分子量大小一致，而綠豆象、四紋豆象及空白對照均無特異性條帶產(chǎn)生，進一步表明在蕓豆樣品中檢出了菜豆象。

注：M為D2000 DNA Marker，1～2為菜豆象，3～4為綠豆象，5～6為四紋豆象，7為空白對照。

2.3 蕓豆中菜豆象的發(fā)生與分布

2.3.1 蕓豆中菜豆象的發(fā)生 在114份產(chǎn)地樣品中菜豆象檢出數(shù)為9份，檢出率為7.9%；企業(yè)送樣的223份蕓豆樣品中菜豆象檢出數(shù)為0份，檢出率為0%；與企業(yè)送樣蕓豆樣品相比，市場來源樣品中存在菜豆象危害的風(fēng)險較大。同時，形態(tài)學(xué)與PCR法菜豆象檢出結(jié)果一致，表明，PCR法可應(yīng)用于檢疫有害生物菜豆象。

2.3.2 菜豆象檢出蕓豆的種類及來源 由表1可見，畢節(jié)市59份蕓豆樣品中檢出菜豆象2份，均來源于畢節(jié)市農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場；貴陽市29份蕓豆樣品中檢出菜豆象7份，其中，6份來源于貴陽市糧油批發(fā)市場，1份來源于超市。菜豆象檢出蕓豆種類覆蓋大蕓豆、紅蕓豆、大白蕓豆和紫花蕓豆等，涉及蕓豆種類較廣；市場銷售的蕓豆仍需進一步追溯其來源地。

表1 菜豆象檢出蕓豆種類及來源

3 結(jié)論與討論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在市場銷售的蕓豆中檢出菜豆象，114份樣品檢出9份，檢出率為7.9%；企業(yè)送樣的蕓豆中未檢出菜豆象。究其原因：一是企業(yè)因為從事多年的農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易，具有較強的檢疫意識；二是蕓豆在企業(yè)銷售前都經(jīng)過人工挑選和熏蒸除害處理，提高了蕓豆品質(zhì)，降低有害生物的攜帶率和感染率。而市場銷售的蕓豆大多數(shù)從種植農(nóng)戶或經(jīng)銷農(nóng)戶手上收購，未經(jīng)過任何加工和除害處理，攜帶有害生物的機率大幅增加。

形態(tài)學(xué)鑒定在昆蟲成蟲種類鑒定中具有簡單、直觀、快捷的優(yōu)勢，但需具有豐富的經(jīng)驗，否則在遇到近緣種或區(qū)別近似種上有可能出現(xiàn)鑒定錯誤。同時，由于昆蟲早期蟲態(tài)的形態(tài)學(xué)鑒定往往準確性不高，因而不適于口岸快速檢疫的要求[6]；而分子生物學(xué)鑒定周期短，且不受昆蟲早期蟲態(tài)的限制[16]，DNA是遺傳信息的載體，從其上獲得的信息既準確又可靠，不會隨昆蟲發(fā)育階段變化而不同，可以彌補形態(tài)學(xué)上難以鑒別區(qū)分種類的缺陷[17-18]。因此，該研究采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法相結(jié)合進行鑒定，結(jié)果表明，2種方法互相驗證，可同時鑒定貴州省蕓豆菜豆象疫情情況；同時也證實，為滿足今后檢疫工作發(fā)展的需要，可使用分子生物學(xué)鑒定方法鑒定處于不同發(fā)育階段菜豆象的蟲害情況，縮短檢疫時間。

市場銷售的檢出菜豆象的蕓豆種類覆蓋大蕓豆、紅蕓豆、大白蕓豆和紫花蕓豆等，涉及蕓豆種類較廣，仍需進一步追溯其來源地，有效控制蕓豆產(chǎn)地菜豆象危害繼續(xù)發(fā)生。

使用快速檢疫菜豆象的方法，可為企業(yè)豆類產(chǎn)品出口提供技術(shù)支撐，促進貴州蕓豆產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。同時應(yīng)加強與相關(guān)部門交流合作，實現(xiàn)資源信息共享，共同做好菜豆象的防控，擴大貴州蕓豆出口。