劉代云 李萌 田盼

摘 要：為解決木聚糖酶國標(biāo)底物短缺，并篩選可用于酶法制備低聚木糖的木聚糖酶，首先以甘蔗渣和櫸木來源的木聚糖替代GB/T 23874-2009《飼料添加劑木聚糖酶活力的測定》中規(guī)定的底物檢測木聚糖酶活力，同時采用木霉和畢赤酵母木聚糖酶酶解不同木聚糖底物和玉米芯木聚糖，應(yīng)用高效液相色譜法對酶解產(chǎn)物組分進行分析，并初步優(yōu)化玉米芯木聚糖酶解條件。結(jié)果表明：與GB/T 23874-2009《飼料添加劑木聚糖酶活力的測定》中規(guī)定的底物檢測結(jié)果相比，櫸木木聚糖（Megazyme）檢測結(jié)果與原底物檢測結(jié)果基本一致;而甘蔗渣木聚糖檢測結(jié)果偏高，但穩(wěn)定性良好，兩者均可替代原底物進行木聚糖酶活力檢測。通過高效液相色譜法分析，畢赤酵母木聚糖酶水解不同底物的木二糖含量較木霉木聚糖酶的高，而木糖含量則相反。利用3種木聚糖酶同步水解玉米芯粉木聚糖，畢赤酵母木聚糖酶水解玉米芯粉木聚糖的產(chǎn)物中90%以上為低聚木糖，其中木二糖占72.54%，木三糖占17.86%，接近木聚糖酶Shearzyme 500L水解產(chǎn)物中的低聚木糖比例，高于木霉木聚糖酶，具有制備低聚木糖的應(yīng)用潛力。畢赤酵母木聚糖酶水解玉米芯木聚糖的最優(yōu)條件為反應(yīng)溫度60℃、pH 4.8，玉米芯底物濃度0.10 g·mL-1，酶解時間24 h，在此最優(yōu)條件下玉米芯木聚糖的水解率可達76%。

關(guān)鍵詞：木聚糖底物;木聚糖酶;低聚木糖;水解率

中圖分類號：TQ 925?? 文獻標(biāo)志碼：A?? 文章編號：0253-2301（2021）07-0074-08

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.07.014

Screening of the Substrates for Xylanase Detection and thePreparation of Corncob Xylooligosaccharide

LIU Daiyun， LI Meng， TIAN Pan

（Yichang Dongyangguang Biochemical Pharmaceutical Co.， Ltd.， Yichang， Hubei 443000， China）

Abstract： In order to solve the shortage of xylanase substrate and screen the xylanase which could be used for the enzymatic preparation of xylooligosaccharides， firstly， the xylanase activity was detected by replacing the substrate specified in GB/T 23874-2009 ″Determination of xylanase activity in feed additives″ with xylanase derived from bagasse and beech. At the same time， The xylanase of trichoderma and pichia pastoris was used to hydrolyze different xylan substrates and corncob xylan by enzyme. The components of the enzymatic hydrolysates were analyzed by HPLC， and the enzymatic hydrolysis conditions of corncob xylan were preliminarily optimized. The results showed that compared with the detection results of the substrate specified in GB/T 23874-2009 ″Determination of xylanase activity in feed additives″， the detection results of beech xylan （Megazyme） were basically consistent with that of the original substrate. The results of bagasse xylan were higher， but the stability was good. Both of them could replace the original substrate for the detection of xylanase activity. By the analysis of HPLC， compared with trichoderma xylanase， the content of xylobiose was higher in the hydrolysis of different substrates by pichia pastoris xylanase， while the content of xylose was opposite. Three kinds of xylanase were used to hydrolyze corncob xylan simultaneously. More than 90% of the products of corncob xylan hydrolyzed by pichia pastoris xylanase were xylooligosaccharide， 72.54% and 17.86% of which was respectively xylobiose and xylotriose. being close to the proportion of xylooligosaccharide in the products hydrolyzed by Shearzyme 500L xylanase and higher than that by trichoderma xylanase， indicating that it had the application potential in the preparation of xylooligosaccharide. The optimal conditions for the hydrolysis of corncob xylan by pichia pastoris xylanase were as follows： reaction temperature of 60℃， pH of 4.8， the concentration of corncob substrate of 0.10 g·mL-1 and hydrolysis time of 24 h. Under these conditions， the hydrolysis rate of corncob xylan could reach 76%.

Key words： Xylan substrate; Xylanase; Xylooligosaccharide; Hydrolysis rate

木聚糖酶是一類可以將木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶，主要包含內(nèi)切β1，4木聚糖酶、外切β1，4木聚糖酶和

β木糖苷酶，其中內(nèi)切木聚糖酶切β1，4糖苷鍵生成低聚木糖，β木糖苷酶水解低聚木糖釋放木糖[1]。木聚糖酶除用于飼料[2-3]、烘焙[4]、造紙[5]等行業(yè)外，其中內(nèi)切木聚糖酶還可用于低聚木糖的制備[6-9]。木聚糖酶來源廣，僅飼料添加劑品種目錄（2013）中木聚糖酶允許使用產(chǎn)生菌種就有7個，而工業(yè)高密度發(fā)酵產(chǎn)生菌以長柄木霉[10-11]和畢赤酵母[1]為主，但兩種菌種發(fā)酵酶活差異較大，組分也存在差異。酶活力可以表征地反應(yīng)木聚糖酶的水解能力，現(xiàn)通用木聚糖酶活力檢測方法為GB/T 23874-2009 《飼料添加劑木聚糖酶活力的測定》[12]，底物為Sigma公司生產(chǎn)的X0627燕麥木聚糖，目前已停止生產(chǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)以燕麥為底物檢測結(jié)果要比樺木的高16%以上[13-14]。表明底物對酶活力檢測結(jié)果有很大影響。由于各廠家使用底物不同，導(dǎo)致檢測結(jié)果存在較大的差異。這對木聚糖酶的開發(fā)、應(yīng)用及推廣造成不利影響。

低聚木糖（XOS）亦稱木寡糖，是由2個9個木糖單元，以β1，4糖苷鍵連接而成的以木二糖和木三糖為主要成分的混合物。XOS2-4指木二糖、木三糖、木四糖之和[15]，木二糖是低聚木糖最主要的活性成分。現(xiàn)低聚木糖主要用酶法水解木聚糖生產(chǎn)，在工業(yè)化生產(chǎn)時所用酶制劑的內(nèi)切木聚糖酶活力應(yīng)盡可能高，而β木糖苷酶活力盡可能低，才能保證酶解產(chǎn)物中有較高的低聚木糖。現(xiàn)有研究大多集中在實驗室規(guī)模，發(fā)酵酶活低[15]，已報告的商業(yè)化產(chǎn)品諾維信Shearzyme 500L可用于水解甘蔗渣制備低聚木糖[6，16]，但價格偏貴，實際應(yīng)用生產(chǎn)成本較高。本研究利用不同來源的木聚糖底物檢測木聚糖酶活性，以篩選國標(biāo)底物的替代物。同時利用畢赤酵母和木霉木聚糖酶水解純度較高的木聚糖底物和玉米芯木聚糖，分析比較2種木聚糖酶的酶解產(chǎn)物組分差異，以篩選適合用于制備低聚木糖的木聚糖酶并優(yōu)化玉米芯木聚糖酶解條件，旨在為生產(chǎn)上提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

木聚糖酶標(biāo)樣：木霉木聚糖酶（10萬U·g-1），畢赤酵母木聚糖酶（20萬U·g-1），宜昌東陽光生化制藥有限公司;木聚糖酶（Shearzyme 500 L），諾維信生物技術(shù)有限公司。底物：甘蔗渣木聚糖（≥85%），上海源葉生物公司（以下簡稱甘蔗渣底物）;櫸木木聚糖（>95%），愛爾蘭Megazyme公司（以下簡稱Megazyme櫸木底物）;櫸木木聚糖（X4252≥90%），美國SigmaAldrich公司（以下簡稱SigmaX4252櫸木底物）。玉米芯木聚糖：經(jīng)處理過的玉米芯粉，其中半纖維素含量占干基70.25%，纖維素含量15.25%[17-18]。

1.2 試驗試劑及儀器

標(biāo)準(zhǔn)品為木二糖（98%）、木三糖（98%），上海麥克林生化科技有限公司生產(chǎn);木糖（98%）、木四糖 （98%），上海源葉生物公司生產(chǎn)。紫外分光光度計 UV2600，日本島津有限公司生產(chǎn);Waters 3489/2695高效液相色譜儀，美國Waters公司生產(chǎn)。

1.3 試驗方法

1.3.1 不同來源木聚糖底物對木聚糖酶活力的影響 木聚糖酶活力采用GB/T 23874-2009《飼料添加劑木聚糖酶活力的測定方法》進行檢測。除使用甘蔗渣和櫸木木聚糖（Megazyme）底物替代原底物櫸木木聚糖（SigmaX4252）檢測木聚糖酶活力外，其余步驟一致。檢測時每個樣品做3個平行樣，以均值為報告酶活。

1.3.2 甘蔗渣木聚糖底物檢測2種木聚糖酶活力穩(wěn)定性 統(tǒng)計底物在不同時間段檢測木霉和畢赤酵母木聚糖酶的酶活數(shù)據(jù)（期間底物已多次配制），計算均值、標(biāo)準(zhǔn)差及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。若相對標(biāo)準(zhǔn)偏差<5%，則認(rèn)為檢測穩(wěn)定性良好，可作為替代物。

1.3.3 木霉和畢赤酵母木聚糖酶酶解不同底物組分分析 按照GB/T 23874-2009《飼料添加劑木聚糖酶活力的測定》中的方法配制100 mg·mL-1的甘蔗渣和櫸木木聚糖底物。將木霉和畢赤酵母木聚糖酶用pH 4.8的乙酸乙酸鈉緩沖液稀釋至200 U·mL-1。取底物和酶各2 mL混合均勻，在50℃下反應(yīng)30 min，煮沸終止反應(yīng)，取樣檢測木糖、木二糖等組分含量

[6，19-21]。

1.3.4 不同木聚糖酶對玉米芯木聚糖酶解的影響 取45 g玉米芯粉至300 g pH 4.8緩沖液中，分別加入玉米芯粉量1.5%的3種木聚糖酶，50℃水浴保溫。在24 h和48 h分別取樣檢測還原糖含量，并用純水稀釋至還原糖含量約10 mg·mL-1，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后HPLC法檢測水解液中產(chǎn)物，對比畢赤酵母和木霉木聚糖酶與Shearzyme 500L的酶解差異。

1.3.5 玉米芯木聚糖酶解條件初步優(yōu)化 （1）底物濃度對玉米芯木聚糖水解率的影響。利用畢赤酵母木聚糖酶進行玉米芯木聚糖酶解試驗，在酶加量1.5%、反應(yīng)溫度50℃、pH 4.8的條件下，研究底物濃度0.10、0.15 g·mL-1對玉米芯木聚糖水解率的影響。（2）反應(yīng)溫度對玉米芯木聚糖水解率的影響。利用酵母木聚糖酶進行玉米芯木聚糖酶解試驗，在酶加量1.5%、底物濃度0.10 g·mL-1、pH 4.8的條件下，研究反應(yīng)溫度50℃、55℃和60℃對玉米芯木聚糖水解率的影響。

1.4 還原糖及水解率的測定

還原糖含量測定參照GB/T 23874-2009《飼料添加劑木聚糖酶活力的測定》方法，取水解液與DNS反應(yīng)，通過木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出還原糖含量。

水解率=還原糖含量加入底物重× 100%

1.5 酶解產(chǎn)物成分分析

高效液相色譜法：采用Waters3489/2695高效液相色譜儀，410示差折光檢測器進行檢測;色譜柱，waters Xbridge BEH Amide? 5 um 4.6 mm×250 mm ;流動相：75%乙腈（0.1%氨水），流速1.0 mL·min-1，進樣量10 uL，檢測器內(nèi)部溫度35℃，柱溫75℃。樣品檢測圖譜中各成分峰面積由儀器工作站計算得到，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品峰面積計算各組分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源木聚糖底物對木聚糖酶活力檢測的影響

利用不同來源的木聚糖底物分別與木霉和畢赤酵母木聚糖酶反應(yīng)，其中Sigma X4252為原行業(yè)通用底物，Megazyme櫸木底物和甘蔗渣底物為候選底物。2種木聚糖酶標(biāo)樣分別用3種不同底物重復(fù)檢測3次，取平均值，檢測結(jié)果見表1。Megazyme櫸木底物檢測結(jié)果與標(biāo)樣酶活基本一致，可用于替換。甘蔗渣木聚糖底物檢測木霉菌和畢赤酵母來源的木聚糖酶結(jié)果比標(biāo)樣酶活分別高1.40和1.15倍。

2.2 甘蔗渣木聚糖底物檢測木聚糖酶活力穩(wěn)定性

由于Megazyme櫸木價格相對較高，試驗對甘蔗渣木聚糖底物的檢測結(jié)果做進一步分析，統(tǒng)計不同時間段2種木聚糖酶標(biāo)樣活力，以驗證甘蔗渣底物替換的可行性。結(jié)果（表2）表明，使用甘蔗渣底物檢測和畢赤酵母木聚糖酶活力均值分別為135 976 U·g-1和 214179 U·g-1，是標(biāo)識酶活的136%和107%，變異系數(shù)在3.5%以內(nèi)。表明使用甘蔗渣底物檢測木聚糖酶雖然酶活力結(jié)果高，但數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好，誤差符合GB/T23879-2009《飼料的測定肌醇》標(biāo)準(zhǔn)允許范圍，按一定比例折算后與國家標(biāo)準(zhǔn)底物檢測結(jié)果基本一致。

2.3 木霉和畢赤酵母木聚糖酶酶解不同底物組分分析

將木霉和畢赤酵母木聚糖酶酶解甘蔗渣和櫸木木聚糖底物的水解液進行組分分析，液相圖譜見圖1～2。從圖1～2可見，木霉木聚糖酶酶解3種底

物的水解組分均比畢赤酵母木聚糖多，而2種木聚糖酶酶解3種底物的水解組分均以甘蔗渣底物多。木霉木聚糖酶酶解3種底物的水解組分主要為木糖、木二糖、木三糖和木四糖，而畢赤酵母木聚糖酶酶解3種底物的水解產(chǎn)物中均未檢出木四糖。畢赤酵母木聚糖酶和木霉木聚糖酶水解3種不同底物中的木糖、木二糖峰面積比也存在差異，畢赤酵母木聚糖酶水解3種不同底物中的木糖、木二糖峰面積比均小于木霉木聚糖酶水解產(chǎn)物，這與畢赤酵母木聚糖酶缺少含有將木二糖進一步水解成木糖的β木糖苷酶有關(guān)

[22-23]。

2.4 不同木聚糖酶對玉米芯木聚糖酶解的影響

利用內(nèi)切木聚糖酶Shearzyme 500L制備低聚木糖已被確認(rèn)有效[6，17]。本研究同時對木霉木聚糖酶、畢赤酵母木聚糖酶和Shearzyme 500L酶解玉米芯木聚糖的還原糖含量及其組分進行分析。從表3可見，木霉木聚糖酶酶解玉米芯木聚糖的還原糖含量最高，反應(yīng)48 h達到100.5 mg·mL-1，高于畢赤酵母木聚糖酶和Shearzyme 500L。從圖3、表4可知，木霉木聚糖酶水解產(chǎn)物主要為木糖，48 h達到70.8 mg·mL-1，占還原糖70%以上;而Shearzyme 500L和畢赤酵母木聚糖酶水解產(chǎn)物木糖含量僅為5.1和7.7 mg·mL-1。Shearzyme 500L和畢赤酵母木聚糖酶水解產(chǎn)物主要為木寡糖（XOS2-4），木寡糖含量分別為51.5 mg·mL-1和75.7 mg·mL-1，占還原糖90%以上，且主要為木二糖。由于不同來源的木聚糖酶成分不同，通過對玉米芯木聚糖酶解產(chǎn)物的組分分析，可以得知木霉木聚糖酶酶系較全，水解更徹底，故最終產(chǎn)物主要是木糖。而Shearzyme 500L和畢赤酵母木聚糖酶主要為內(nèi)切木聚糖酶，水解產(chǎn)物多為木二糖。綜合以上分析表明，畢赤酵母木聚糖酶酶解玉米芯粉水解產(chǎn)物中木寡糖（XOS2-4）含量達到75.7 mg·mL-1，即水解產(chǎn)物中有90%以上為低聚木糖。因此，采用酶法制備玉米芯低聚木糖時，畢赤酵母木聚糖酶的效果更佳。

2.5 玉米芯木聚糖酶解條件優(yōu)化

2.5.1 底物濃度對玉米芯木聚糖水解率的影響 從表5可知，玉米芯木聚糖的酶解產(chǎn)物中還原糖含量在底物濃度0.15 g·mL-1、反應(yīng)時間48 h時達到最大（79.1 mg·g-1），水解率在底物濃度0.10 g·mL-1，反應(yīng)48 h時達到最大（53.5%）。在底物濃度相同條件下，玉米芯木聚糖水解率和水解產(chǎn)物中的還原糖含量均隨著反應(yīng)時間的延長而提高;

而在反應(yīng)時間相同條件下，水解產(chǎn)物的還原糖含量隨著底物濃度的增加而增加，但水解率反而略有下降。水解率隨著底物濃度的增加而下降的原因，可能與其酶促反應(yīng)速率下降有關(guān)，一方面底物濃度的增加以及反應(yīng)體系黏稠性增加，影響了酶、底物和產(chǎn)物的擴散以及酶與底物的接觸，從而降低了酶促反應(yīng)速率;另一方面產(chǎn)物達到一定濃度后會對反應(yīng)起到反饋抑制作用，造成酶促反應(yīng)速率下降。因此，底物濃度以0.10 g·mL-1較適合。

2.5.2 反應(yīng)溫度對玉米芯木聚糖水解率的影響 圖4結(jié)果表明，反應(yīng)溫度由50℃提升至60℃，反應(yīng)24 h后玉米芯木聚糖即可達到最大水解率（55%），按玉米芯中半纖維素純度（72.5%）折算后水解率則達76%，高于文獻報告值（63.1%）。繼續(xù)反應(yīng)至48 h時，水解率并未得到提升，與產(chǎn)物中存在的木糖會顯著降低酶活性從而降低木聚糖的水解率有關(guān)。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，Megazyme櫸木底物檢測木霉和畢赤酵母木聚糖酶酶活結(jié)果與停產(chǎn)的Sigma櫸木底物一致;而甘蔗渣底物檢測木霉和畢赤酵母木聚糖酶活結(jié)果比Sigma櫸木底物高，但其穩(wěn)定性良好，其酶活變異系數(shù)均在3.5%以內(nèi)。因此，Megazyme櫸木底物和甘蔗渣底物均可替換停產(chǎn)的Sigma櫸木底物用于木聚糖酶活力測定。由于Megazyme櫸木價格高，生產(chǎn)上推薦使用甘蔗渣底物用于替換GB/T 23874-2009《飼料添加劑木聚糖酶活力的測定》中規(guī)定的Sigma櫸木底物，但為保證木霉和畢赤酵母木聚糖酶的活力與原底物結(jié)果一致，需分別除以校正系數(shù)1.40和1.15。應(yīng)用3種木聚糖酶酶解玉米芯木聚糖的結(jié)果表明，木霉木聚糖酶水解玉米芯木聚糖的產(chǎn)物以木糖為主，而畢赤酵母木聚糖酶和木聚糖酶Shearzyme 500L酶解玉米芯木聚糖的水解產(chǎn)物成分則以低聚木糖為主，水解48 h低聚木糖比例達到90%以上，且以木二糖和木三糖為主。表明，畢赤酵母木聚糖酶更具有工業(yè)應(yīng)用價值。試驗同時對畢赤酵母木聚糖酶酶解玉米芯木聚糖的條件進行初步優(yōu)化，其最優(yōu)條件為反應(yīng)溫度60℃、pH 4.8和玉米芯底物濃度0.10 g·mL-1，添加底物重量1.5%的畢赤酵母木聚糖酶解24 h，在此最優(yōu)條件下玉米芯木聚糖水解率可達到76%。

酶解過程中水解產(chǎn)物產(chǎn)生的木糖不屬于活性成分，石國良等[6]研究發(fā)現(xiàn)，木糖的積累會降低木聚糖酶活性，造成水解率難于進一步提升。因此，在實際應(yīng)用時需尋找合適的辦法及時去除酶解過程中產(chǎn)生的木糖，從而獲得更高木二糖含量的水解產(chǎn)物。另外，玉米芯木聚糖經(jīng)酶解處理后的水解產(chǎn)物中還含有15%纖維素，其存在會對半纖維素的水解造成不利影響。因此，下一步的研究重點是將可復(fù)配纖維素酶進行同步水解，進一步優(yōu)化酶解條件，尤其是酶的添加量，從而降低應(yīng)用成本。

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（責(zé)任編輯：林玲娜）