趙云青 黃穎楨 劉保財(cái) 陳菁瑛 張武君 俞靜

摘 要：以莆田地區(qū)馬藍(lán)分生組織為材料，采用壓片技術(shù)，探討馬藍(lán)不同取材部位、不同取材時(shí)間、不同預(yù)處理試劑處理、不同解離時(shí)間等對(duì)馬藍(lán)染色體制片的影響，并進(jìn)行核型分析。結(jié)果表明：以根尖分生組織為材料，在上午8：00、8：30取材，用0.1%秋水仙素溶液室溫預(yù)處理0.5 h，用卡諾液固定4 h，然后用1 mol·L-1鹽酸在60℃水浴8 min，卡寶品紅染色8 min，可獲得分散良好，形態(tài)清晰的染色體。核型分析表明，馬藍(lán)染色體為32條，馬藍(lán)的核型公式是2x=2n=32=4sm+28m，核型類型為1 B，不對(duì)稱系數(shù)為59.54%。說明莆田地區(qū)馬藍(lán)在相對(duì)穩(wěn)定的自然環(huán)境中進(jìn)化速度緩慢。

關(guān)鍵詞：馬藍(lán);常規(guī)制片;染色體;核型分析

中圖分類號(hào)：S 567.239? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? 文章編號(hào)：0253-2301（2021）07-0001-09

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.07.001

Technology Optimization of the Preparation of Chromosomes in ?Strobilanthes Cusia

ZHAO Yunqing1，2， HUANG Yingzhen1，2， LIU Baocai1，2， CHEN Jingying1，2*， ZHANG Wujun1，2， YU Jing1，2

（1. Institute of Agricultural Biological Resources， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China;

2. Medicinal Plant Research Center， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： By taking the meristem of ?Strobilanthes cusia ?cultivated in Putian as the material and using the conventional method， the effects of different sampling sites， sampling time， pretreatment with different reagents and dissociation time on the preparation of chromosomes in ?Strobilanthes cusia ?were studied， and the karyotype was analyzed. The results showed that： by taking the root apical meristem as the material， the root apical meristem was sampled at 8：00 and 8：30 a.m.， pretreated with 0.1% colchicine solution at room temperature for 0.5 h， fixed with Carnoy for 4 h， and then bathed with 1 mol·L-1 hydrochloric acid at 60℃ for 8 min， and stained with carbol fuchsin for 8 min， thus the chromosomes with good dispersion and clear shape could be obtained. The karyotype analysis showed that there were 32 chromosomes in ?Strobilanthes cusia. ?The karyotype formula of ?Strobilanthes cusia ?was 2x=2n=32=4sm+28m， the karyotype was 1 B， and the asymmetry coefficient was 59.54%. It indicated that the evolution rate of ?Strobilanthes cusia ?cultivated in Putian was slow in the relatively stable natural environment.

Key words： ?Strobilanthes cusia ; Conventional preparation; Chromosome; Karyotype analysis

馬藍(lán) Baphicacanthus cusia （Nees）Bremek又稱板藍(lán)，為爵床科板藍(lán)屬草本植物，主產(chǎn)地為福建、四川、云南、湖南、江西、貴州、廣東、廣西等。馬藍(lán)根、莖、葉均可入藥，在我國各個(gè)地區(qū)廣泛應(yīng)用。葉或莖葉經(jīng)加工制得的干燥粉末、團(tuán)塊稱為青黛，青黛為福建省道地藥材，具有清熱解毒、涼血消斑、清肝瀉火、定驚的功效，主治溫毒發(fā)斑、血熱吐衄、咽痛口瘡、火毒瘡瘍、咳嗽胸痛，痰中帶血、暑熱驚癇、驚風(fēng)抽搐等。馬藍(lán)干燥根和根莖稱為南板藍(lán)根，具有清熱解毒、涼血消斑的功效，用于溫疫時(shí)毒、發(fā)熱咽痛、溫毒發(fā)斑、丹毒。其干燥莖葉稱為南板藍(lán)葉，具有清熱解毒、涼血止血的功效，主治溫?zé)岵?、高熱頭痛、發(fā)斑、肺熱咳嗽、濕熱瀉痢、黃疸、淋巴結(jié)炎、肝癰、腸癰等[1]。

前人在馬藍(lán)人工栽培[2-4]、藥用成分、加工炮制[5]等方面進(jìn)行了較多研究，研究證明馬藍(lán)主要含有生物堿、萜類、香豆素酚類、甾類、黃酮類、多炔類、皂苷、木脂素等植物次生代謝產(chǎn)物[6]。馬藍(lán)含有的大黃酚具有平喘、止咳、縮短血液凝固時(shí)間、興奮神經(jīng)、麻痹肌肉、利膽、保肝、利尿[7]、抗菌和抗癌的作用，以及免疫抑制、抗炎、降血脂、瀉下[8]及改善糖代謝異常等作用。馬藍(lán)研究中發(fā)現(xiàn)的生物堿類包括吲哚類生物堿（靛玉紅、靛藍(lán)、異靛藍(lán)等）、喹唑酮類生物堿和其他類型生物堿等。生物堿藥理活性多樣[9-10]，靛玉紅具有抗腫瘤作用[11]，是抗白血病的有效成分，對(duì)多種動(dòng)物移植性腫瘤有較強(qiáng)的抑制作用[12]，對(duì)慢性粒細(xì)胞白血病有較好的療效[13]。靛藍(lán)可作為著色劑用于染色，還具有抗炎、殺菌作用。國內(nèi)外學(xué)者對(duì)靛藍(lán)、靛玉紅的物質(zhì)形成機(jī)理等進(jìn)行了相關(guān)研究[14-16]。

近年來馬藍(lán)越來越受到關(guān)注，馬藍(lán)市場需求越來越大，但存在馬藍(lán)產(chǎn)量低、野生資源緊缺、栽培馬藍(lán)種質(zhì)退化、成分不穩(wěn)定等問題。染色體是生物遺傳物質(zhì)的載體，獲得的染色體數(shù)目和核型在物種系統(tǒng)分類、起源與鑒定、親緣關(guān)系分析等方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。高質(zhì)量的染色體制片是進(jìn)行核型分析和原位雜交的保障[17]，染色體核型分析技術(shù)可識(shí)別各個(gè)染色體的特征，有助于基因定位的研究，是細(xì)胞遺傳學(xué)的一項(xiàng)基本技術(shù)，此技術(shù)還可用于染色體工程、細(xì)胞分類學(xué)和植物育種學(xué)、基因組研究等[18-19]，植物基因組研究可闡述物種分類地位、起源進(jìn)化，解析次生代謝物的合成通路，解析環(huán)境適應(yīng)性，闡明重要、特殊表型的調(diào)控和形成機(jī)制，研究結(jié)構(gòu)變異、基因分型等。

染色體制片技術(shù)是指顯示染色體的一般形態(tài)和結(jié)構(gòu)的技術(shù)，染色體制片技術(shù)主要有壓片法和去壁低滲干燥法等。壓片法對(duì)去壁要求較低且材料不易丟失，該法適用于大量材料的倍性鑒定、染色體計(jì)數(shù)、初步的染色體形態(tài)觀察[20-21]。染色體制片技術(shù)成功的關(guān)鍵是獲得大量染色體縮短適宜的分裂細(xì)胞，壓片法還存在壓片力度較難把握，染色體不易分散等難點(diǎn)。目前，馬藍(lán)染色體壓片技術(shù)優(yōu)化僅有吳瑞霞[22]對(duì)常規(guī)壓片技術(shù)中的取材部位、取材時(shí)間、預(yù)處理液、預(yù)處理時(shí)間、解離方法進(jìn)行了優(yōu)化，并對(duì)4個(gè)地點(diǎn)的馬藍(lán)的核型進(jìn)行分析。本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上對(duì)馬藍(lán)染色體壓片技術(shù)進(jìn)行了取材部位、取樣時(shí)間、預(yù)處理液、鹽酸解離時(shí)間、染色液及染色時(shí)間的優(yōu)化，進(jìn)一步精細(xì)優(yōu)化了馬藍(lán)染色體壓片技術(shù)，獲得清晰、分散度良好的染色體制片，并進(jìn)行了核型分析，為馬藍(lán)后續(xù)研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料馬藍(lán) Strobilanthes （Nees）Bremek采集自福建莆田仙游，扦插在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物資源圃，經(jīng)本課題組鑒定為爵床科板藍(lán)屬植物馬藍(lán) Strobilanthes cusia （Nees）Bremek。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同取材部位選擇 取馬藍(lán)半木質(zhì)化枝條采用育苗基質(zhì)進(jìn)行扦插，取樣前，將生根的馬藍(lán)置適當(dāng)?shù)蜏兀?～10℃）暗培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)25℃下處理12 h，重復(fù)2次，提高細(xì)胞分裂指數(shù)。于上午8：00分別取馬藍(lán)植物根尖、莖尖、嫩葉放入預(yù)處理液0.1%秋水仙素中處理0.5 h，取出材料沖洗干凈，置于卡諾氏固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1，V/V）中4℃固定4 h。將固定后的材料投入1 mol·L-1鹽酸溶液中60℃水浴解離8 min[13-15]。解離完后清洗材料3～5次，將材料置于載玻片上，滴清水，用鑷子將材料搗碎后去掉全部大塊組織，在帶有細(xì)小組織的清水上直接滴加卡寶品紅溶液[16]染色8 min。蓋上蓋玻片，濾紙從蓋玻片兩側(cè)吸掉過剩的卡寶品紅溶液后，手指在濾紙外固定住蓋玻片，用鉛筆橡皮頭的先沿著蓋玻片對(duì)角線敲擊，后再細(xì)細(xì)敲擊整個(gè)蓋玻片（1～2 min），使材料成分散均勻，在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.2 不同取樣時(shí)間優(yōu)化 于上午6：00至11：30每隔0.5 h取1次根尖，約2 mm，放入預(yù)處理液0.1%秋水仙素中處理0.5 h。預(yù)處理完后續(xù)操作同1.2.1。

1.2.3 不同預(yù)處理液處理 于上午8：00取馬藍(lán)植物根尖放入表1預(yù)處理液中進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理完后續(xù)操作同1.2.1。

1.2.4 解離時(shí)間優(yōu)化 于上午8：00取馬藍(lán)植物根尖放入預(yù)處理液0.1%秋水仙素中處理0.5 h，取出材料沖洗干凈，置于卡諾氏固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1，V/V）中4℃固定4 h。將固定后的材料投入1 mol·L-1鹽酸溶液中60℃水浴解離4、6、8、10 min[23-25]。解離完后續(xù)操作同1.2.1。

1.2.5 染色液及染色時(shí)間優(yōu)化 于上午8：00分別取馬藍(lán)植物根尖放入預(yù)處理液0.1%秋水仙素中處理0.5 h，取出材料沖洗干凈，置于卡諾氏固定液（乙醇∶冰醋酸=3∶1，V/V）中4℃固定4 h。將固定后的材料投入1 mol·L-1鹽酸溶液中60℃水浴解離8 min[23-25]。解離完后清洗材料3～5次，將材料置于載玻片上，滴清水，用鑷子將材料搗碎后去掉全部大塊組織，在帶有細(xì)小組織的清水上滴加醋酸洋紅或卡寶品紅溶液[26]染色6 min，后續(xù)操作同1.2.1。選取效果佳的染色液分別染色4、6、8、10 min，后續(xù)操作同1.2.1。

1.2.6 馬藍(lán)染色體核型分析的方法 用NIKON NiUF2正置顯微鏡觀察，NISElements D版軟件拍照系統(tǒng)拍照，在顯微鏡下對(duì)處于分裂中期的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。選擇30個(gè)染色體分散且形態(tài)較好的細(xì)胞進(jìn)行染色體數(shù)目統(tǒng)計(jì)，其中85%以上細(xì)胞具有恒定一致的染色體數(shù)，即可認(rèn)為是該植物的染色體數(shù)目[17]。核型分析方法根據(jù)李懋學(xué)等[17]的標(biāo)準(zhǔn)劃分。

臂比 （r）=長臂（S）/短臂（L）; 染色體相對(duì)長度=染色體長度/染色體組總度×100%;

按Arano[27]的方法，核型不對(duì)稱系數(shù)=長臂總長/全組染色體總長×100%，比值越大越不對(duì)稱。按Levan等[28]方法根據(jù)臂比值確定著絲點(diǎn)的命名。

核型分類：按Stebbins[29]的方法，根據(jù)臂比值大于2的染色體百分比和最長染色體與最短染色體之比來判定核型類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬藍(lán)染色體制片壓片法技術(shù)優(yōu)化

2.1.1 不同取材部位對(duì)馬藍(lán)染色體制片效果的影響 于上午8：00取馬藍(lán)的根尖、莖尖及嫩葉，從圖1可知，不同取材部位對(duì)馬藍(lán)染色體制片效果影響較大，3種材料細(xì)胞核區(qū)最大的為根尖，其次為莖尖及嫩葉。根尖可獲得較多的分裂相，嫩葉及尖分裂相細(xì)胞較少，染色質(zhì)濃縮，未見可用于染色體分析的制片。從細(xì)胞形態(tài)來看，根尖細(xì)胞背景干凈，染色體較分散，利于染色體計(jì)數(shù)及后期核型分析，可作為最佳染色體核型處理部位。取樣前，將生根的馬藍(lán)扦插秒置適當(dāng)?shù)蜏兀?～10℃）暗培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)25℃下培養(yǎng)12 h，重復(fù)2次，此方法可顯著提高細(xì)胞分裂指數(shù)。

2.1.2 不同取材時(shí)間對(duì)馬藍(lán)染色體制片效果的影響 以根尖為材料，于6：00～11：30每隔0.5 h取樣1次，共取樣12次，不同取樣時(shí)間獲得的染色體制片效果見圖2。由圖2可知，6：00（A1）取樣材料未獲得分裂相，染色體計(jì)數(shù)及觀察。6：30（B2）、7：30（C2）取樣可獲得較多分裂相，但染色體有重疊，雖然可用于染色體計(jì)數(shù)，但不利于后期染色體核型分析。8：00（E2）、8：30（E2）取樣獲得的染色體分散，形態(tài)清晰，可用于染色體計(jì)數(shù)及后期形態(tài)觀察。取樣時(shí)間為9：00、9：30、10：00、11：00時(shí)獲得的染色體制片見圖G2～I(xiàn)2，取材細(xì)胞處于分裂期后期，可以進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)等觀察，但染色體較密集、濃縮，不利于核型分析。10：30（I2）、11：30（J2）取樣獲得的染色體制片可獲得分裂相，但染色體較聚集，有重疊，不利于核型分析。綜合分析適宜進(jìn)行馬藍(lán)染色體分析的根尖取樣時(shí)間為上午8：00（E2）、8：30（F2），可獲得染色體分散良好、清晰的制片。

2.1.3 不同預(yù)處理試劑對(duì)馬藍(lán)染色體效果的影響 預(yù)處理是否適宜是染色體制片技術(shù)最關(guān)鍵的操作步驟。試驗(yàn)采用6種不同預(yù)處理液對(duì)馬藍(lán)根尖進(jìn)行預(yù)處理，不同預(yù)處理液對(duì)染色體制片效果影響見圖3，結(jié)果表明0.1%秋水仙素溶液中室溫預(yù)處理0.5 h效果最好，見圖B3，細(xì)胞背景干凈，染色體縮縊程度合適，分散適宜且清晰，易于統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)及進(jìn)行核型分析;0.2%秋水仙素溶液（C3）中室溫預(yù)處理0.5 h及0.1%秋水仙素與8羥基喹啉混合液（D3）室溫處理0.5 h效果較好，細(xì)胞背景較干凈，染色體較清晰，可用于染色體計(jì)數(shù)，但有重疊，不利于后期染色體形態(tài)觀察及核型分析;飽和對(duì)二氯苯溶液處理后制片效果見圖E3，細(xì)胞背景較干凈，染色體有分散，但重疊部分較多;8羥基喹啉處理后的制片效果如圖F3，細(xì)胞背景干凈，可見分裂相，但是染色體濃縮，無法進(jìn)行后續(xù)觀察;0.05%秋水仙素處理后未觀察到分裂中期染色體，無法進(jìn)行染色體后續(xù)觀察。本研究還在前期預(yù)試驗(yàn)中先用0.05%秋水仙素溶液4℃處理24 h，再用冰水混合物處理24 h，未觀察到分裂相，單獨(dú)用冰水混合物處理24 h也未得到分裂相。綜上所述試驗(yàn)中篩選出最適合的預(yù)處理液為0.1%秋水仙素溶液，在室溫下對(duì)馬藍(lán)根尖預(yù)處理0.5 h可獲得染色體形態(tài)清晰、易于計(jì)數(shù)及觀察的制片。

2.1.4 不同解離時(shí)間對(duì)馬藍(lán)染色體制片效果的影響 壓片中組織的解離主要用鹽酸，使細(xì)胞壁之間的中層果膠物質(zhì)以及部分細(xì)胞質(zhì)分散，而使細(xì)胞易于分散，同時(shí)也可使細(xì)胞壁軟化而易于壓片。試驗(yàn)采用1 mol·L-1鹽酸溶液60℃水浴解離4、6、8及10 min，比較不同解離時(shí)間對(duì)馬藍(lán)細(xì)胞染色體制片的影響。結(jié)果如圖4，解離浴4、6 min后獲得的制片細(xì)胞未分散，染色體較小，無法進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)及后期染色體觀察，而解離10 min時(shí)細(xì)胞分散，但細(xì)胞壁破裂，出現(xiàn)2～3個(gè)細(xì)胞染色體混合的現(xiàn)象，解離8 min后獲得的制片細(xì)胞分散程度適宜，細(xì)胞壁完整，染色體清晰，觀察效果最佳。因此，馬藍(lán)染色體制片最佳解離方式為1 mol·L-1鹽酸溶液在60℃水浴中解離8 min，可獲得細(xì)胞分散適宜，染色體清晰，易于觀察及計(jì)數(shù)的制片。

2.1.5 不同染色液及卡寶品紅染色時(shí)間對(duì)馬藍(lán)染色體染色效果的影響 本研究先采用醋酸洋紅和卡寶品紅溶液兩種染色液分別染色4、6、8及10 min，然后進(jìn)行染色效果比較結(jié)果見圖5。由圖5可知，卡寶品紅染色液可將染色體染為紅色，利于進(jìn)行染色體觀察，而醋酸洋紅未獲得理想染色效果，總之卡寶品紅染色液染色效果優(yōu)于醋酸洋紅染色液。因醋酸洋紅進(jìn)行染色后染色體顏色均不明顯，獲得的制片雜質(zhì)較多，不利于觀察，故后期未進(jìn)行不同染色時(shí)間的比較，僅進(jìn)行卡寶品紅不同染色時(shí)間的效果比較?？▽毱芳t不同染色時(shí)間效果見圖6、由圖6可知，卡寶品紅溶液染色6 min時(shí)獲得的染色體顏色偏淡，個(gè)別染色體尾部不明顯，不利于染色體核型分析;卡寶品紅溶液染色8 min后獲得的染色體較清晰，易于分辨，利于染色體觀察;染色10 min獲得的染色體顏色偏深，雖然染色體也較清晰，但整體視覺效果略差。綜上馬藍(lán)染色體制片最佳染色處理為卡寶品紅染色8 min，可節(jié)約時(shí)間，同時(shí)獲得染色體清晰、利于觀察的制片。

2.2 馬藍(lán)染色體核型分析

2.2.1 染色體數(shù)目 核型分析主要以染色體相對(duì)長度、臂比等為依據(jù)。選擇30個(gè)細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，選擇形態(tài)清晰、分散良好的染色體進(jìn)行核型分析。結(jié)果表明馬藍(lán)染色體數(shù)目為28～32條，其中27個(gè)細(xì)胞的染色體數(shù)為32條，超過總數(shù)的85%，綜上馬藍(lán)染色體的數(shù)目為2n=32。

2.2.2 染色體核型特征 獲得的馬藍(lán)染色體核型參數(shù)及形態(tài)如表2及圖7，結(jié)果表明，馬藍(lán)染色體核型公式為2x=2n=32=4sm+28m，其中包含了4個(gè)亞中部著絲點(diǎn)染色體（sm），28個(gè)中部著絲粒染色體（m）。染色體相對(duì)總臂長3.428%～10.285%，最長與最短染色體長度比值為3.00，臂比值范圍為1.013～1.988，沒有臂比值大于2的染色體，核型不對(duì)稱系數(shù)為1B型。核型不對(duì)稱系數(shù)為59.54%。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)從馬藍(lán)染色體制片壓片法的優(yōu)化著手，對(duì)馬藍(lán)染色體制片取材的選擇、預(yù)處理方法、預(yù)處理時(shí)間、解離時(shí)間、染色液選擇與染色時(shí)間等方面進(jìn)行篩選，獲得馬藍(lán)染色體制片壓片技術(shù)。結(jié)果表明上午08：00、08：30取馬藍(lán)根尖0.1%秋水仙素室溫預(yù)處理0.5 h，然后用1 mol·L-1鹽酸溶液在60℃水浴中解離8 min，卡寶品紅染液染色8 min，可獲得染色體清晰、分散度良好的制片。制片過程中預(yù)處理時(shí)間影響染色體的形態(tài)，處理時(shí)間過短會(huì)出現(xiàn)染色體拖尾現(xiàn)象，而時(shí)間過長染色體會(huì)凝縮過度。在取材方面李懋學(xué)等[17]認(rèn)為凡能進(jìn)行細(xì)胞分裂的植物組織或單個(gè)細(xì)胞都可用于染色體觀察，但在植物生長發(fā)育的過程中，其分生組織或細(xì)胞分裂活動(dòng)，除有自身發(fā)育的階段性外，還受外界環(huán)境條件的影響，需要充分掌握其機(jī)構(gòu)及生長發(fā)育規(guī)律，了解具體植物的生長發(fā)育特性，創(chuàng)造適宜的環(huán)境條件才能準(zhǔn)確獲得制備優(yōu)良染色體的材料。本試驗(yàn)通過變溫處理[22]及不同取材部位分析，確認(rèn)獲得馬藍(lán)染色體優(yōu)良染色體的取材部位為根尖。壓片時(shí)蒿若超等[30]改良的壓片技術(shù)是先用鑷子將材料搗碎后，再將蓋玻片放置于上方，筆者在制片過程中將材料壓碎后去除全部大塊組織，可減少雜質(zhì)，獲得的染色體更清晰。

吳瑞霞[22]研究中對(duì)不同地點(diǎn)的馬藍(lán)進(jìn)行核型分析，其中福州本地栽培馬藍(lán)的核型類型為3B，染色體數(shù)量為32條，南平茫蕩山馬藍(lán)的核型類型為2B，染色體數(shù)量為32條。本試驗(yàn)中材料取自福建莆田的馬藍(lán)核型類型為1B，染色體數(shù)量為32條。Arano[28]認(rèn)為，當(dāng)核型不對(duì)稱系數(shù)低于60%時(shí)，核型對(duì)稱性較高;反之則較低。一般來講核型進(jìn)化的基本趨勢是由對(duì)稱向不對(duì)稱發(fā)展的，系統(tǒng)演化上處于比較古老和原始的植物，大多具有較對(duì)稱的核型，而不對(duì)稱的核型常見于衍生、特化以及比較進(jìn)化的植物類群中[31]。對(duì)稱程度越高，其染色體變異越小，進(jìn)化程度越低，相反則染色體變異越大，進(jìn)化程度越高，由此莆田的馬藍(lán)類型偏原始。但馬藍(lán)核型類型不同可能因?yàn)檫x用的品種、生長環(huán)境而形成差異，而染色體數(shù)量受品種、生長環(huán)境影響較小，形成差異的可能性也小。

致謝：本試驗(yàn)中得到福建農(nóng)林大學(xué)潘大仁老師的悉心指導(dǎo)，在此表示衷心感謝。

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