邢文群，路雙，張宏凱，賈爭艷，秦建軍，曲金榮

食管癌由于早期癥狀不明顯，確診時大部分患者已發(fā)展為中晚期食管癌，治療效果較差，目前手術(shù)切除仍然是局部食管癌治療的金標(biāo)準(zhǔn)[1]。以往研究發(fā)現(xiàn)，食管癌的分化程度是其生存及預(yù)后的獨立危險因素，食管癌的分化程度又可以反映其生物學(xué)行為之間的差異[2,3]，因此術(shù)前對食管癌病理分級進(jìn)行預(yù)測，可有效指導(dǎo)患者的臨床治療及反映其生物學(xué)行為。動態(tài)對比增強(qiáng)MRI(Dynamic contrast-enhanced MRI,DCE-MRI)通過使用對比劑可以可視化血管完整性，從而監(jiān)測組織中的腫瘤變化[4,5]，惡性腫瘤由于血管生成迅速，因此比正常血管具有更高的滲透性。對比劑被注入血管時，會從毛細(xì)血管漏入組織，在組織內(nèi)暫時改變T1弛豫時間。這些DCE-MRI定量參數(shù)來自于信號強(qiáng)度-時間曲線，相對容易計算[6]。魯亞南等[7]研究發(fā)現(xiàn)，食管癌DCE-MRI定量參數(shù)與食管癌病理分級呈正相關(guān)。外周循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)反映腫瘤細(xì)胞從癌灶逃逸通過血液循環(huán)[8]，相關(guān)文獻(xiàn)研究證實，CTCs為食管癌預(yù)后不良的獨立危險因素[9-11]，前期研究發(fā)現(xiàn)ADC值聯(lián)合CTCs可以很好地預(yù)測食管癌的病理分級[12]。文獻(xiàn)研究已經(jīng)證實食管癌DCE-MRI定量參數(shù)和CTCs值可以在一定程度上反映食管癌病理分級[13,14]，但是關(guān)于食管癌DCE-MRI定量參數(shù)及循環(huán)腫瘤細(xì)胞與食管癌病理分級之間的關(guān)系尚未明確。本研究旨在探討食管癌MRI定量參數(shù)DCE-MRI和CTCs與食管癌病理分級之間的相關(guān)性，并分析有效參數(shù)對低分化食管鱗癌的診斷效能。

材料與方法

1.病例資料

搜集2016年10月-2018年10月在本院就診且符合納入及排除標(biāo)準(zhǔn)的患者。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)活檢病理確診為食管癌；②入院前未進(jìn)行任何抗腫瘤治療；③均進(jìn)行食管MRI檢查及臨床CTCs探測，且在上述檢查后兩周內(nèi)行食管癌根治術(shù)。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：①活檢病理為非食管鱗癌；②食管癌的MRI圖像質(zhì)量較差，影響疾病診斷及臨床要求；③勾畫食管癌病變最大層面ROI總面積<10 mm2。④食管、胃交界處病變或存在食管占位以外其他惡性病變。本研究共搜集75例患者，排除6例非食管鱗癌、5例圖像質(zhì)量差和2例病變最大層面較小難以勾畫ROI者，最終納入62例食管鱗癌患者。本研究通過河南省腫瘤醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(2015ct068)，檢查前告知患者簽署知情同意書。

2.檢查方法

MRI檢查采用Siemens 3.0T MR掃描儀(MAGNETOM Skyra，Siemens Healthcare,Erlangen,Germany)，18通道體部線圈和內(nèi)置32通道的脊柱線圈。患者禁食6 h，掃描前15～20 min肌注鹽酸消旋山莨菪堿注射液，以此來緩解食管蠕動，確認(rèn)患者無青光眼、幽門梗阻、尿潴留、前列腺肥大等鹽酸消旋山莨菪堿注射相關(guān)禁忌癥[15]，且簽署用藥風(fēng)險的知情同意書。掃描前患者常規(guī)訓(xùn)練呼吸，取仰臥位，足先進(jìn)。常規(guī)掃描屏氣T2WI冠狀面、矢狀面及T2抑脂序列，確定病變具體位置后，小范圍針對病變進(jìn)行膈肌導(dǎo)航的應(yīng)用刀鋒采集技術(shù)的快速自旋回波T2WI(T2-TSE-BLADE )掃描。自由呼吸放射狀K空間填充方式的容積內(nèi)插體部檢查(radial volumetric interpolated breath-hold examination，Radial VIBE)序列開始掃描20 s后注入對比劑Gd-DTPA，針對病變位置，垂直于食管掃描。常規(guī)掃描MRI序列及掃描參數(shù)：T2WI抑脂序列，層厚5 mm，TR 6315.45 ms，TE 96.00 ms，矩陣226×384，視野264 mm×384 mm；屏氣T1WI正反相位，層厚3 mm，TR 2.72 ms，TE 0.95 ms，矩陣224×384，視野264 mm×384 mm；T2-TSE-BLADE序列，層厚3 mm，TR 5602.02 ms，TE 97.00 ms,矩陣256×256，視野240 mm×240 mm；擴(kuò)散加權(quán)成像(diffusion weighted imaging，DWI)序列，層厚5 mm，TR 4000.00 ms，TE 54.00 ms，矩陣88×128，視野261 mm×380 mm，b值分別為50、700 s/mm2。DCE-MRI檢查采用Radial VIBE序列，層厚 2.5 mm,TR 3.87 ms，TE 1.78 ms，翻轉(zhuǎn)角12°，矩陣288×288，視野380 mm×380 mm。

3.圖像處理及分析

由兩位具有6年及16年食管磁共振診斷經(jīng)驗的醫(yī)師對MRI圖像質(zhì)量進(jìn)行評分：1分代表MRI圖像具有明顯的偽影，不能區(qū)分食管壁各層結(jié)構(gòu)；2分代表MRI圖像具有中度偽影，不能準(zhǔn)確分辨出食管壁各層結(jié)構(gòu)；3分代表MRI圖像有輕度偽影，基本可評估食管壁各層結(jié)構(gòu)；4分表示MRI圖像好，沒有偽影，可分辨出食管壁各層結(jié)構(gòu)；5分為MRI圖像非常好，沒有偽影，可清晰分辨出食管壁各層結(jié)構(gòu)[16]。將DCE-MRI圖像導(dǎo)入GE Omni-Kinetics軟件(GE Medical，China)，選擇明顯的胸主動脈替代食管動脈獲取動脈輸入功能(arterial input function，AIF)。利用Tofts模型得到DCE-MRI藥代動力學(xué)參數(shù)，包括容量轉(zhuǎn)移常數(shù)(volume transfer constant，Ktrans)、速率常數(shù)(rate constant，Kep)、血管外細(xì)胞外間隙容積比(extravascular extracellular volume fraction，Ve)、血漿分?jǐn)?shù)(plasma volume fraction，Vp)、對比劑最大濃度值(max concentration，MAX Conc)、時間信號曲線最大斜率值(MAX Slope)、增強(qiáng)后時間信號曲線下面積(area under curve,AUC )(圖1)。

圖1 胸中段低分化食管鱗癌患者，男，48歲，a～c圖中的暖色區(qū)域強(qiáng)化部分為腫瘤所在位置。a)Ktrans參數(shù)圖；b)Kep參數(shù)圖；c)Ve參數(shù)圖；d)橫軸面MRI增強(qiáng)圖像。

4.循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離和富集

入組患者術(shù)前空腹采集5mL靜脈血，置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中(4℃)。CTCs的分離和富集采用CanPatrol TM CTCs (SurExam,廣州,中國)二代技術(shù)聯(lián)合RNA原位雜交(RNA-ISH)[13]。RNA-ISH是在分支DNA(bDNA)的基礎(chǔ)上使CTCs呈現(xiàn)不同的表型。分支DNA主要是運用雞尾酒法在42℃，20 min運用于信號的擴(kuò)增。標(biāo)記出上皮細(xì)胞(EpCAM和CK8/18/19)和間質(zhì)細(xì)胞(vimentin和TWIST1)的特異性標(biāo)志物，將CTCs分為上皮型(E+，僅上皮型探針陽性，表示為僅紅色熒光信號)、混合型(E+/M+，上皮型探針和間質(zhì)型探針均表現(xiàn)陽性，表示為同時出現(xiàn)紅色和綠色熒光)、間質(zhì)型(M+，間質(zhì)型探針陽性，表示為僅出現(xiàn)綠色熒光)[17,18](圖2)。

5.病理結(jié)果分析

病理結(jié)果由兩位具有5年以上診斷經(jīng)驗的病理科醫(yī)師共同閱片，并按照WHO食管癌病理分級結(jié)果進(jìn)行分級，將食管鱗癌分為高分化(G1)、中分化(G2)、低分化(G3)，相關(guān)文獻(xiàn)證實低分化食管鱗癌患者的預(yù)后及其生存期均較中分化及高分化患者差[19]。

6.統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0、MedCalc 18.11和GraphPad Prism 7(GraphPad Software Inc,San Diego,CA)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Bland-Altman分析兩位磁共振診斷醫(yī)師所得DCE-MRI參數(shù)值的一致性，計算其組內(nèi)相關(guān)系數(shù)(intraclass correlation coefficient，ICC)，ICC>0.75被認(rèn)為一致性較好。采用Spearman秩相關(guān)分析比較病理分級與DCE-MRI參數(shù)值、CTCs值的相關(guān)性及兩者之間的相關(guān)性;r值為0.00～0.30表示兩者之間無相關(guān)性，r值為0.30～0.50表示相關(guān)性較低，r值為0.50～0.70表示具有中度相關(guān)性，r值>0.70表示具有較好的相關(guān)性[20]。采用Kruskal-WallisH檢驗及單因素方差分析比較不同病理分級間DCE-MRI參數(shù)值、CTCs總數(shù)及各亞型數(shù)目的差異。采用受試者工作特征(receiver operating characteristics，ROC)曲線評價DCE-MRI參數(shù)值、CTCs總數(shù)及其各亞型數(shù)目對低分化食管鱗癌的診斷及預(yù)測能力，采用Z檢驗比較有效參數(shù)的AUC。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.患者臨床資料

62例食管鱗癌患者均直接進(jìn)行食管癌根治術(shù)，其中男47例，女15例，年齡38～77歲，平均(61.24±8.51)歲。術(shù)后大病理提示，高分化食管鱗癌5例，中分化38例，低分化19例。

2.DCE-MRI定量參數(shù)在不同病理分級組間的差異

2位放射科診斷醫(yī)師分別對DCE-MRI圖像進(jìn)行質(zhì)量評分，圖像質(zhì)量評分一致性較好(表1)。2位磁共振診斷醫(yī)師所得DCE-MRI定量參數(shù)的組內(nèi)相關(guān)性較好，所得ICC為0.875。

表1 食管鱗癌DCE-MRI圖像質(zhì)量的評分結(jié)果

CTCs總數(shù)、M+ CTCs及DCE-MRI定量參數(shù)與食管鱗癌病理分級均呈正相關(guān)(P值均<0.05)，DCE-MRI各參數(shù)間與CTCs及其亞型之間的相關(guān)性r<0.4，相關(guān)性差，但不是耦合關(guān)系，不會相互影響其對于食管癌病理分級的預(yù)測(圖3)。不同病理分級間的CTCs總數(shù)及間質(zhì)型CTCs差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；DCE-MRI參數(shù)中Ktrans、Kep、VP、AUC及Max Slope在不同病理分級間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但Ve在食管鱗癌不同病理分級間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2、3)。G1組間質(zhì)型、混合型及CTCs總數(shù)低于G3組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；G3組與G2組的CTCs及其亞型之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；G1與G2組的E+ CTCs、M+ CTCs、CTCs總數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。G3組的Ktrans、Kep、Vp、Max Conc、AUC、Max Slope均高于G2組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但是在G1與G2組之間各參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；G1組Ktrans、Kep及Max Conc低于G3組，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 DCE-MRI和CTCs及其亞型之間相關(guān)性熱圖，r值均<0.4，兩者相關(guān)性差。 圖4 ROC曲線顯示DCE-MRI有效參數(shù)及間質(zhì)型CTCs聯(lián)合因素的AUC高于Ktrans 、間質(zhì)型CTCs的AUC。

表3 不同病理分級間食管鱗癌CTCs的組間差異性分析

表2 不同病理分級間食管鱗癌DCE-MRI定量參數(shù)的組間差異性分析

3.DCE-MRI定量參數(shù)及CTCs診斷低分化食管鱗癌效能

DCE-MRI參數(shù)診斷低分化食管鱗癌的ROC曲線分析結(jié)果顯示，Ktrans(AUC=0.820，P<0.001)、Kep(AUC=0.744，P<0.001)、Vp(AUC=0.745，P<0.001)、Max Conc(AUC=0.718，P<0.001)、AUC(AUC=0.711，P=0.006)、Max Slope(AUC=0.695，P=0.004)中Ktrans的診斷效能最佳。通過分析CTCs總數(shù)及其亞型診斷低分化食管鱗癌的ROC曲線，可知M+ CTCs(AUC=0.673，P<0.05)對于診斷低分化食管鱗癌有一定價值，CTCs總數(shù)診斷低分化食管鱗癌的效能較差(P>0.05)。采用二元logistic回歸分析聯(lián)合DCE-MRI有效因素(Ktrans、Kep、Vp、Max Conc、AUC、Max Slope)及間質(zhì)型CTCs診斷低分化食管鱗癌的效能(AUC=0.913，P<0.001)，診斷敏感度和特異度分別為86.0%、84.2%，優(yōu)于任意單一因素的診斷效能(表4、5，圖4)。聯(lián)合因子計算公式如下：聯(lián)合因子=Marker1+ Marker2*Marker2B值/Marker1B值+……Marker n*Marker nB值/Marker1B值。

表4 食管鱗癌DCE-MRI參數(shù)、CTCs及有效參數(shù)聯(lián)合因素對低分化食管鱗癌的診斷效能

表5 食管鱗癌DCE-MRI定量有效參數(shù)及M+ CTCs單一因素的診斷效能

討 論

1.DCE-MRI定量參數(shù)及CTCs對不同病理分級的診斷價值

本研究結(jié)果顯示DCE-MRI定量參數(shù)及CTCs與食管鱗癌病理分級呈正相關(guān)，腫瘤分化程度越低，惡性程度越高，其值越高，且組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；術(shù)前DCE-MRI定量有效參數(shù)聯(lián)合間質(zhì)型CTCs可以有效預(yù)測食管鱗癌的病理分級。

獲取動態(tài)增強(qiáng)磁共振圖像時，將示蹤劑或?qū)Ρ葎┳⑷胙埽S著對比劑濃度的改變，測量的目標(biāo)組織的磁共振信號強(qiáng)度也隨之改變。因此，DCE-MRI定量參數(shù)可提供組織內(nèi)部解剖及功能信息[21-26]。DCE-MRI除了提供解剖功能之外還能描述器官功能，因此在灌注相關(guān)研究中得到了廣泛應(yīng)用[24]。DCE-MRI可通過定量參數(shù)反映腫瘤微環(huán)境的灌注和血管的通透性。本研究結(jié)果顯示，低分化食管鱗癌的Ktrans、Kep、Vp、Max Conc、AUC、Max Slope均高于中分化食管鱗癌，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此DCE-MRI定量參數(shù)可以反映腫瘤的血流灌注情況，這和以往的研究結(jié)果一致[27],原因可能為腫瘤的分化程度越低，惡性程度越高，腫瘤新生血管越多，但腫瘤新生血管內(nèi)皮不完整，且血管基底膜通過物質(zhì)速率增加[28]，因此對比劑進(jìn)入血管間隙的總量和速率增加，Ktrans值升高；Kep表明該物質(zhì)從細(xì)胞外和血管外空間(extravascular extracellular space，EES)返回血漿的速度，惡性程度高的腫瘤Kep升高[29];這與李琳琳等[14]的研究結(jié)果一致，其認(rèn)為Ktrans、Kep可以有效反映食管鱗癌的病理分級；魯亞南等[7]認(rèn)為，DCE-MRI定量參數(shù)Ktrans、Kep與食管癌病理分級相關(guān)，分化程度越低，其值越高，且其預(yù)測低分化食管鱗癌的AUC分別達(dá)0.941和0.809，但本研究中Ve值不能反映食管鱗癌的病理分級，與其研究結(jié)論不同，原因可能為Ve代表血管外細(xì)胞外間隙容積比，其不僅受血管外空間的影響，血流速度也會影響Ve的結(jié)果，因此我們可以將結(jié)果的不一致性歸因于Ve的復(fù)雜性[30]。惡性腫瘤異常血管的增多伴隨著物質(zhì)轉(zhuǎn)運速率的增加，腫瘤內(nèi)血管外的對比劑濃度最大值Max Conc隨之增大；對比劑濃度增大，惡性腫瘤增強(qiáng)后達(dá)峰時間就會縮短，相應(yīng)增強(qiáng)后的時間信號曲線下面積(AUC)及時間信號曲線最大斜率值Max Slope增大，這和羅紅兵等[28]在乳腺癌中的研究結(jié)果一致。

CTCs以單細(xì)胞或團(tuán)簇形式從腫瘤組織逃逸進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)[31]。相關(guān)研究證實CTCs可以預(yù)測食管鱗癌放療的效率和預(yù)后，在腫瘤復(fù)發(fā)和治療反應(yīng)評估中發(fā)揮重要作用[32]。本研究結(jié)果顯示M+ CTCs和CTCs總數(shù)與食管鱗癌病理分級呈正相關(guān)，中/低分化組食管鱗癌的CTCs高于高分化組，腫瘤分化程度低，惡性程度高，CTCs值越高，其存在轉(zhuǎn)移的可能性越大，生存及預(yù)后越差,與劉濤等[33]的研究結(jié)論一致，即上皮型CTCs及混合型CTCs與食管鱗癌病理分級、T分期及N分期顯著相關(guān)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。吳波等[34]也研究發(fā)現(xiàn)，CTCs與食管癌病理分級顯著相關(guān)，食管癌分化程度影響循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性與否。趙振坤等[35]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞的陽性與否與腫瘤病理分級密切相關(guān)。因此探測CTCs的數(shù)目及檢測其變化值，可以在腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移前及早觀測到微轉(zhuǎn)移，調(diào)整治療方案，以改善患者的預(yù)后。

2.DCE-MRI定量參數(shù)及CTCs對低分化食管鱗癌的診斷效能

本研究結(jié)果顯示，腫瘤Ktrans>1.621/min時，其診斷低分化食管鱗癌的效能優(yōu)于M+ CTCs,由此可見食管DCE-MRI定量參數(shù)可以在分子水平上更早地顯示腫瘤組織的超微結(jié)果，且優(yōu)于臨床CTCs效能。本研究結(jié)果顯示,聯(lián)合DCE-MRI有效參數(shù)+間質(zhì)型CTCs診斷低分化食管鱗癌的效能優(yōu)于單一因素的診斷效能。王準(zhǔn)等[36]也研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合食管癌DWI及Sirtuin1(SIRT1)蛋白可以有效預(yù)測食管癌的輻射抵抗。將影像學(xué)檢查結(jié)果和臨床相關(guān)檢測結(jié)果相結(jié)合，可更早、更準(zhǔn)確地預(yù)測腫瘤的病理分級。

本研究存在以下局限性：①本研究僅入組了食管鱗癌患者，未選擇其他類型食管惡性腫瘤，目前世界范圍內(nèi)食管癌主要類型是食管鱗癌，我國主要病理類型為食管鱗癌，占全部食管癌患者的90%，因此本研究僅選擇食管鱗癌患者；②本研究通過胸主動脈獲取AIF，而沒有選擇食管動脈，是由于食管動脈太細(xì)，因此可能存在一定偏倚；③入組患者需同時具備DCE-MRI及CTCs資料，且均需進(jìn)行食管癌根治術(shù)，因此本研究樣本量較少。

綜上所述，DCE-MRI定量參數(shù)、M+ CTCs與食管鱗癌的病理分級相關(guān)，且DCE-MRI定量參數(shù)值對低分化食管鱗癌的診斷效能優(yōu)于M+ CTCs，兩者之間是獨立不相關(guān)的，聯(lián)合兩者有效因素診斷低分化食管鱗癌的效能優(yōu)于任意單一因素。