孫靜 趙榮華 包蕾 郭姍姍 張廣平 耿子涵 時(shí)宇靜 宋玲 高云航 李曉璐 崔曉蘭

摘要 目的：研究熱毒寧注射液不同給藥途徑對(duì)幼齡小鼠副流感病毒肺炎的藥理作用，為臨床用藥提供參考。方法：幼齡ICR小鼠按體質(zhì)量等級(jí)隨機(jī)分組，包括正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、熱毒寧注射給藥對(duì)照組，熱毒寧?kù)F化吸入給藥20 min、10 min、5 min和2.5 min組。采用副流感病毒感染幼齡小鼠致肺炎模型，通過(guò)肺指數(shù)、肺指數(shù)抑制率、肺組織病毒載量、肺部病理評(píng)分等指標(biāo)評(píng)價(jià)熱毒寧注射液不同給藥方式治療幼齡小鼠副流感病毒肺炎的藥理作用。結(jié)果：熱毒寧?kù)F化吸入給藥4個(gè)劑量組均可不同程度降低小鼠肺指數(shù)及病毒載量，減輕肺組織病理?yè)p傷;其中霧化吸入給藥20 min組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：熱毒寧?kù)F化吸入給藥20 min對(duì)副流感病毒感染所致小鼠病毒性肺炎具有顯著治療作用，且優(yōu)于注射給藥組。

關(guān)鍵詞 副流感病毒;肺炎;幼齡小鼠;熱毒寧注射液;霧化吸入給藥;病毒載量;給藥方式;肺指數(shù)

Study on Pharmacological Effects of Reduning Injection with Different Administration Methods on Parainfluenza Virus Pneumonia in Immature Mice

SUN Jing1，ZHAO Ronghua1，BAO Lei1，GUO Shanshan1，ZHANG Guangping1，GENG Zihan1，SHI Yujing1，SONG Ling1，GAO Yunhang1，LI Xiaolu2，CUI Xiaolan1

（1 Biosafety Laboratory，Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2 Department of Cardiology，Beijing Hospital，Beijing 100730，China）

Abstract Objective：To study the pharmacological effects of Reduning Injection on parainfluenza virus pneumonia by different means of administration in immature mice，and to provide the reference for clinical medication.Methods：Young ICR mice were randomly grouped according to body weight class，including a normal group，a model group，a positive control group，and a Reduning Injection administration control group.Reduning atomized inhalation administration 20 min，10 min，5 min and 2.5 min groups.The parainfluenza virus was used for infection model of pneumonia in young mice.The lung index，lung index inhibition rate，lung tissue viral load，lung pathology score and other indicators were used to evaluate pharmacological effects of the different administration methods of Reduning Injection in treating parainfluenza virus pneumonia in young mice.Results：All the 4 groups of Reduning aerosol inhalation administration could reduce the lung index，viral load，alleviate the pathological damage of lung tissue.Compared with the model control group，there were significant differences（P<0.05） between the aerosolized inhalation administration group for 20 min.Conclusion：Reduning aerosol inhalation administration for 20 minutes has a significant therapeutic effect on viral pneumonia in mice caused by parainfluenza virus infection，and is better than the injection administration group.

Keywords Parainfluenza virus; Pneumonia; Immature mice; Reduning Injection; Aerosol inhalation administration; Viral load; Administration methods; Lung index

中圖分類(lèi)號(hào)：R254文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.16.011

小兒副流感病毒肺炎是由人副流感病毒感染引起的肺部炎癥，是人類(lèi)呼吸道感染性疾病的重要病因之一，尤其在5歲以下兒童中易引起下呼吸道感染，致病性?xún)H次于呼吸道合胞病毒。北方地區(qū)易發(fā)于冬、春寒冷季節(jié)，南方則夏、秋季多發(fā)，主要通過(guò)空氣中的飛沫經(jīng)呼吸道傳播[1-2]。副流感病毒首次在日本仙臺(tái)1名兒童死者體內(nèi)分離，故又稱(chēng)仙臺(tái)病毒，是一種單鏈RNA病毒，屬副黏病毒屬，一般呈球形，有包膜。在健康成年人中感染后癥狀較輕，可出現(xiàn)感冒和喉嚨疼痛等癥狀，但由于兒童的免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善，故感染后可引起嚴(yán)重的下呼吸道感染，如氣管或支氣管炎、肺炎，甚至伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥。目前尚無(wú)針對(duì)副流感病毒的疫苗或特異性治療手段[3-4]。

熱毒寧注射液組方包括青蒿、金銀花和梔子3味中藥，具有清熱、疏風(fēng)、解毒的功效，臨床主要用于治療外感風(fēng)熱所致的感冒、咳嗽及上呼吸道感染、急性支氣管炎等，臨床療效確切[5-6]。本研究通過(guò)建立幼齡小鼠副流感病毒肺炎模型，評(píng)價(jià)熱毒寧注射液霧化吸入及靜脈注射2種給藥方式對(duì)模型肺指數(shù)、病毒載量、肺間質(zhì)病變及支氣管病變的藥理作用，為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取3～4周齡ICR小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量（14.00±1.00）g，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006。所有動(dòng)物在2級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房?jī)?nèi)飼養(yǎng)，壓力-20 Pa，溫度20 ℃，相對(duì)濕度50%，動(dòng)物自由進(jìn)食飲水。實(shí)驗(yàn)中所有操作均遵循NIH及北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定，經(jīng)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)（倫理審批號(hào)：2017D008）。

1.1.2 藥物 熱毒寧注射液（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：170134）;利巴韋林顆粒（四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：160622）。

1.1.3 試劑與儀器 One Step TB GreenTM PrimeScriptTM RT-PCR Kit Ⅱ（TaKaRa公司，日本，批號(hào)：RR086A）;蘇木精染色液（北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：0527A17）;伊紅（北京化工廠，批號(hào)：20150915）;切片石蠟56～58 ℃（上海華永石蠟有限公司，批號(hào)：20170421）;A2型生物安全柜（Thermo公司，美國(guó)，型號(hào)：MSC1.8）;小動(dòng)物口鼻暴露塔（DSI公司，美國(guó)，型號(hào)：Buxco）;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司，美國(guó)，型號(hào)：7500）。

1.1.4 毒株 人副流感病毒HPIV-3，購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將幼齡ICR小鼠按照體質(zhì)量等級(jí)隨機(jī)分為8組，包括正常組、模型組、陽(yáng)性藥對(duì)照組（利巴韋林）、熱毒寧原途經(jīng)對(duì)照組（注射給藥），熱毒寧?kù)F化給藥20 min、10 min、5 min、2.5 min不同劑量組。除正常組外，其余各組小鼠輕度麻醉后滴鼻感染人副流感病毒HPIV-3。

1.2.2 給藥方法 感染當(dāng)天熱毒寧各劑量組分別霧化吸入給藥20 min、10 min、5 min、2.5 min，熱毒寧注射給藥組尾靜脈注射給藥，0.1 mL/10 g，1次/d，連續(xù)4 d。于第5天稱(chēng)重后，小鼠脫頸椎處死，稱(chēng)量肺組織，按照以下公式計(jì)算肺指數(shù)及其抑制率。肺指數(shù)=小鼠肺重/小鼠體質(zhì)量;肺指數(shù)抑制率=（模型組肺指數(shù)-給藥組肺指數(shù)）/（模型組肺指數(shù)-正常組肺指數(shù)）×100%[7-8]。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 病毒載量檢測(cè)（RT-PCR法） 小鼠肺組織稱(chēng)重后，取部分分裝置于-80 ℃低溫冰箱中保存;實(shí)驗(yàn)前將小鼠肺組織置于研缽，倒入少量液氮研磨成粉，每個(gè)樣本加入1 mL Trizol Reagent，室溫放置20 min后，4 ℃，6 000×g離心10 min，取上清加入0.2 mL氯仿室溫孵育2～3 min，4 ℃，6 000×g離心15 min后，取上清加異丙醇，混勻，室溫孵育30 min，4 ℃，6 000×g離心10 min，棄上清，75%乙醇洗沉淀，棄上清，通風(fēng)櫥內(nèi)干燥5～10 min，DEPC水溶解沉淀，-80 ℃保存?zhèn)溆?。小鼠GAPDH基因[9]：上游5′-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3′;下游5′-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3′;副流感病毒基因[10]：上游5′-GGGCGGCATCTGTAGAAATC-3′;下游5′-CGGAAATCAC GAGGGATGG-3′。

1.2.3.2 肺組織病理學(xué)檢測(cè) 小鼠肺組織稱(chēng)重后，固定于10%甲醛溶液中，3 d后取出進(jìn)行取材。橫切肺左葉含左主支氣管一塊，厚度為3～5 mm。將組織塊脫水、透明化后，浸蠟包埋，切成厚度約為3 μm的石蠟切片，采用蘇木精及伊紅染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察，按照表1中的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熱毒寧不同給藥途徑對(duì)副流感病毒肺炎小鼠肺指數(shù)的影響 副流感病毒HPIV-3感染可引起小鼠肺指數(shù)顯著升高，熱毒寧?kù)F化吸入給藥的4個(gè)劑量組均能在一定程度上降低人副流感病毒HPIV-3感染后小鼠肺指數(shù)，其中霧化吸入20 min組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），肺指數(shù)抑制率為45.05%;熱毒寧?kù)F化吸入給藥的4個(gè)劑量組的肺指數(shù)抑制率呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。熱毒寧?kù)o脈注射組一定程度上可降低小鼠肺指數(shù)，但與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），且抑制率低于霧化吸入各劑量組。見(jiàn)表2。

2.2 熱毒寧不同給藥途徑對(duì)副流感病毒肺炎小鼠肺組織中病毒載量的影響 PCR結(jié)果顯示，模型組小鼠肺組織中副流感病毒載量顯著升高，熱毒寧?kù)F化給藥的4個(gè)劑量組均能夠在一定程度上降低小鼠肺組織中副流感病毒載量，其中高劑量組病毒載量與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），病毒載量抑制率是34.57%，熱毒寧?kù)o脈給藥組作用不顯著。見(jiàn)表3。

2.3 對(duì)副流感病毒肺炎小鼠病理變化的影響 鏡下觀察模型對(duì)照組小鼠肺組織病理變化以間質(zhì)性肺炎為主，表現(xiàn)為小支氣管和小靜脈周?chē)馨图?xì)胞、中性粒細(xì)胞和大單核細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁腫脹、變性、塌陷，肺泡腔擴(kuò)大變圓。小支氣管上皮細(xì)胞變性壞死，上皮細(xì)胞脫落，嚴(yán)重者可見(jiàn)支氣管腔內(nèi)中性粒細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞、纖維素、黏液和壞死崩解的細(xì)胞碎片;熱毒寧?kù)F化吸入不同時(shí)間組均可不同程度減輕人副流感病毒HPIV-3感染所致小鼠肺間質(zhì)病變及支氣管病變，其中霧化吸入20 min組肺間質(zhì)病變?cè)u(píng)分與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）;霧化吸入20 min、10 min、5 min組支氣管病變?cè)u(píng)分與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01，P<0.05）;熱毒寧?kù)o脈注射組可顯著減輕肺組織支氣管病變，但對(duì)肺間質(zhì)病變無(wú)顯著作用。霧化吸入20 min組改善副流感病毒肺炎肺組織病理?yè)p傷總體作用優(yōu)于注射給藥組。見(jiàn)表4、表5及圖1。

3 討論

霧化吸入療法是用霧化裝置將藥物分散成微小的霧滴或微粒，使其懸浮于氣體中，進(jìn)入呼吸道及肺部而發(fā)揮局部或全身治療作用。由于肺組織血流量大，毛細(xì)血管豐富，肺部給藥后藥物吸收迅速，故霧化吸入給藥具有起效快、用量少、局部藥物濃度高，而全身不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，且其成本低，使用方便，適用于兒童、老人及重癥患者等，廣泛用于呼吸、血液、神經(jīng)、運(yùn)動(dòng)、內(nèi)分泌等系統(tǒng)的疾病治療中，療效顯著[11-12]。中藥?kù)F化吸入療法在臨床上廣泛應(yīng)用于治療肺炎、支氣管炎等呼吸道疾病，相比于注射給藥，其給藥方式更便捷，安全性更高，且療效明顯優(yōu)于靜脈注射[13-16]。在臨床治療中，霧化吸入給藥途徑已成為治療兒童呼吸道疾病的常用方法。

熱毒寧注射液由青蒿、金銀花和梔子3味中藥組成，方中以青蒿為君藥，發(fā)揮清熱涼血、透散肌表之功效;金銀花為臣藥，擅清熱解毒、透散表邪;佐藥梔子，具有解毒、清熱、涼血、清泄心肺胃之功效。該藥在兒科臨床應(yīng)用中常采用霧化吸入給藥途徑，用于治療小兒病毒性肺炎、小兒手足口病、小兒急性支氣管炎等，已取得較好的臨床療效[17-20]。本研究結(jié)果顯示，熱毒寧?kù)F化吸入給藥20 min可顯著降低小鼠肺指數(shù)及肺組織中病毒載量，顯著改善肺間質(zhì)病變及支氣管病變，且總體療效優(yōu)于靜脈注射給藥組。

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（2020-11-20收稿 責(zé)任編輯：吳珊）