趙倩倩,高紅波,仇凱,劉冰,吳剛*,張宇凌,徐彤彤,屠振華

1(食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,教育部食品營養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,天津,300457) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015)3(全國食品發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)化中心,北京,100015) 4(食品行業(yè)生產(chǎn)力促進(jìn)中心,北京,100006)

鋁瓶包裝由于其具有質(zhì)量輕、成本低、密封性好、導(dǎo)熱性能高、耐受高溫、可回收、有良好的機(jī)械強(qiáng)度和裝飾性能等優(yōu)勢,廣泛應(yīng)用于飲料等食品工業(yè)中[1-2]。然而,食品工業(yè)中使用鋁瓶包裝的主要問題是產(chǎn)生腐蝕。因此,常在與食品直接接觸的鋁瓶包裝內(nèi)表面上涂有機(jī)聚合物涂層,以在鋁瓶包裝和食品之間提供保護(hù)[3]。目前常用的涂料主要有環(huán)氧酚醛樹脂、丙烯酸樹脂、酚醛樹脂、乙烯基樹脂等[4],然而,用于包裝的保護(hù)性內(nèi)涂層中的某些成分可能會從包裝材料遷移到食品中,這些成分可能是起始物質(zhì)、添加劑、降解產(chǎn)物等[5-7]。研究發(fā)現(xiàn)食品接觸材料中,可能存在醛類(甲醛、乙醛等)[8]、芳香族伯胺[9]、酚類[10-11]、重金屬[12]等有害化學(xué)物質(zhì),在食品的保藏過程中,這些化學(xué)物質(zhì)可能會從食品接觸材料遷移到食品中,當(dāng)其遷移量超過一定的閾值時(shí),可能直接危害人體的健康。為保證食品接觸材料的安全,歐盟發(fā)布了(EU)10/2011,其中規(guī)定甲醛、乙醛的遷移量不得超過15和6 mg/kg。我國也發(fā)布了食品接觸材料相關(guān)標(biāo)準(zhǔn),如GB 9685—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》、GB 31604.1—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品遷移試驗(yàn)通則》等,其中GB 9685—2016規(guī)定了甲醛和乙醛遷移限量分別為15和6 mg/kg。

人們接觸醛類物質(zhì)會引起惡心、頭痛、咳嗽和眼睛、鼻子和喉嚨發(fā)炎等癥狀,從而在短期內(nèi)影響健康[13]。甲醛已被公認(rèn)為具有致突變性和致癌性[14]。乙醛是乙醇產(chǎn)生的內(nèi)源性代謝物,也被認(rèn)為是一種普遍存在的化合物,雖然沒有證據(jù)表明其對人體有致癌性,但是,它是一種強(qiáng)墮胎藥,且對大鼠有致畸作用[15]。目前,對于食品及食品相關(guān)產(chǎn)品中甲醛、乙醛的測定方法主要有分光光度法[16]、電化學(xué)法[17]、氣相色譜[18]、液相色譜法[19]等。目前,我國GB 31604.48—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品接觸材料及制品 甲醛遷移量的測定》中,關(guān)于甲醛遷移量的測定方法是分光光度法,雖然此法操作簡單,但檢出限低,且容易產(chǎn)生假陽性；SN/T 3385—2012《食品接觸材料 高分子材料 聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)樹脂及其制品中乙醛的測定 頂空氣相色譜法》中關(guān)于乙醛的測定方法是頂空氣相色譜法,此法重現(xiàn)性和準(zhǔn)確性不夠好,并且只能單獨(dú)檢測乙醛。電化學(xué)方法由于操作繁瑣,效率不高,在甲醛的檢測方面應(yīng)用較少[20]。

目前,對于鋁瓶包裝中甲醛、乙醛同步檢測和遷移規(guī)律的研究較少,本文建立了高效液相色譜法同步測定鋁瓶包裝中甲醛、乙醛遷移量方法,并對衍生條件進(jìn)行優(yōu)化,選擇體積分?jǐn)?shù)分別為4%的乙酸、10%、20%、50%的乙醇為食品模擬物研究了鋁瓶中甲醛、乙醛在不同溫度和時(shí)間下的遷移規(guī)律,為鋁瓶等金屬容器中甲醛、乙醛遷移量的測定以及食品接觸材料相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AD型高效液相色譜-紫外檢測器,日本島津儀器有限公司；AL204型電子天平,梅特勒-托利多儀器；BSP-250型生化培養(yǎng)箱,上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；鋁瓶(內(nèi)涂層為熱固性環(huán)氧酚醛涂料),容積500 mL,由國內(nèi)某企業(yè)提供。

甲醛標(biāo)準(zhǔn)品(10 000 mg/L)、乙醛標(biāo)準(zhǔn)品(1 000 mg/L),上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH),西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；磷酸(分析純),北京化工廠；冰乙酸(分析純),天津市大茂化學(xué)試劑廠；乙腈、無水乙醇(色譜純),北京諾其雅盛生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 遷移實(shí)驗(yàn)

根據(jù)GB 31604.1—2015,選擇相應(yīng)的食品模擬物以及浸泡條件對樣品進(jìn)行預(yù)處理。選擇體積分?jǐn)?shù)分別為4%乙酸、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇共4種食品模擬物來分別模擬酸性食品(pH<5)、非酸性食品(pH≥5)、乙醇含量≤10%的含酒精飲料、20%<乙醇含量≤50%的含酒精飲料開展遷移實(shí)驗(yàn)。為研究鋁瓶包裝在不同溫度和時(shí)間條件下甲醛、乙醛的遷移規(guī)律,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為3 組(每組做3個(gè)平行樣),將預(yù)處理好的樣品分別在20、40、60 ℃的恒溫箱中進(jìn)行保溫試驗(yàn),分別在0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d進(jìn)行取樣并測試[18]。為了防止甲醛、乙醛的揮發(fā),保溫過程中,保持鋁瓶密封,取樣前冷卻至室溫。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及試劑配制

甲醛、乙醛混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液:分別準(zhǔn)確移取100 μL甲醛標(biāo)準(zhǔn)品、1 mL乙醛標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中,加純水定容,配制100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

甲醛、乙醛混合標(biāo)準(zhǔn)工作液:分別準(zhǔn)確移取甲醛、乙醛混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液10、20、50、100、200 μL于10 mL容量瓶中,加純水定容,配制甲醛、乙醛混合標(biāo)準(zhǔn)工作液質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L。

DNPH溶液的配制:準(zhǔn)確稱取0.30 g DNPH于100 mL棕色容量瓶中,加入5 mL磷酸溶液,用乙腈定容,質(zhì)量濃度為3 mg/mL。

1.2.3 衍生反應(yīng)

分別吸取1.00 mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液及樣品溶液于10 mL具塞比色管中,分別加入2.0 mL 3 mg/mL的DNPH衍生化試劑,立即蓋好塞子后搖勻,放置在60 ℃恒溫水浴中加熱30 min使其衍生化,冷卻至室溫后,用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾,濾液待高效液相色譜分析。

1.2.4 色譜條件

色譜柱:Venusil C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(水)=60∶40；流速0.8 mL/min；檢測波長365 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)與分析

利用島津LC Solution軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,使用Origin 2019軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

本文選擇了流動(dòng)相分別為V(乙腈)∶V(水)=80∶20、70∶30、60∶40、55∶45對流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察。在V(乙腈)∶V(水)=60∶40時(shí),甲醛-PNPH、乙醛-PNPH能達(dá)到很好分離,分離度好,峰形左右對稱,保留時(shí)間較短,結(jié)果如圖1所示,因此,本試驗(yàn)最終選擇V(乙腈)∶V(水)=60∶40為流動(dòng)相。

圖1 甲醛-DNPH、乙醛-DNPH 色譜圖Fig.1 Chromatograms of formaldehyde-DNPH and acetaldehyde-DNPH

2.2 衍生條件的選擇

2.2.1 衍生劑濃度的選擇

在酸性條件下甲醛和乙醛與衍生劑(DNPH)在水浴中衍生,生成苯腙類物質(zhì)。在衍生過程中,衍生劑的濃度低會導(dǎo)致部分甲醛、乙醛沒有與衍生劑反應(yīng)完全,造成檢測結(jié)果偏低,因此,衍生劑的加入量直接影響著衍生效果。因此,在其他試驗(yàn)條件不變的情況下,選擇1、2、3、4、5 mg/mL質(zhì)量濃度的衍生劑分別與甲醛、乙醛進(jìn)行衍生反應(yīng)來考察衍生劑濃度對檢測結(jié)果的影響。如圖2-a所示,當(dāng)衍生劑的質(zhì)量濃度在1～3 mg/mL時(shí),甲醛-DNPH、乙醛-DNPH峰面積隨著衍生劑濃度的增大而增大；當(dāng)衍生劑的質(zhì)量濃度在3～5 mg/mL時(shí),甲醛、乙醛衍生物峰面積隨著衍生劑濃度的增大而基本保持不變,因此本試驗(yàn)選擇3 mg/mL為衍生劑最佳質(zhì)量濃度。

2.2.2 衍生化水浴溫度的選擇

在衍生過程中,水浴溫度的選擇對衍生反應(yīng)有著重要的影響。因此,在其他試驗(yàn)條件不變的情況下,選擇水浴溫度分別為40、50、60、70、80 ℃條件下衍生劑與甲醛、乙醛進(jìn)行衍生,來考察衍生溫度對檢測結(jié)果的影響。為了防止甲醛、乙醛的揮發(fā),用封口膜將蓋好塞子的比色管密封。如圖2-b所示,當(dāng)衍生化水浴溫度在40～60 ℃時(shí),甲醛-DNPH、乙醛-DNPH峰面積隨著水浴溫度的增大而增大;衍生化水浴溫度在60～80 ℃時(shí),甲醛、乙醛衍生物峰面積隨著水浴溫度的增大而減小,主要是因?yàn)闇囟冗^高會導(dǎo)致甲醛、乙醛衍生物不穩(wěn)定而發(fā)生分解,這與趙貞等[22]的研究結(jié)果一致,因此本試驗(yàn)選擇60 ℃為最佳水浴溫度。

2.2.3 衍生化水浴時(shí)間的選擇

在衍生的過程中,當(dāng)水浴時(shí)間不夠時(shí),衍生反應(yīng)不完全,會造成檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。因此,在其他試驗(yàn)條件不變的情況下,選擇衍生劑與甲醛、乙醛分別衍生10、20、30、40、50 min來考察衍生時(shí)間對檢測結(jié)果的影響。如圖2-c所示,當(dāng)水浴衍生時(shí)間在10～30 min時(shí),甲醛-DNPH、乙醛-DNPH峰面積隨著衍生時(shí)間的延長而增大;衍生時(shí)間30～50 min時(shí),甲醛、乙醛衍生物峰面積隨著水浴衍生時(shí)間的延長而基本保持不變,因此本試驗(yàn)選擇30 min為最佳水浴衍生時(shí)間。

2.2.4 衍生化加酸量的選擇

衍生的過程中需要在酸性條件下進(jìn)行,加酸量也會直接影響檢測結(jié)果。因此,在其他試驗(yàn)條件不變的情況下,選擇加入3、4、5、6、7 mL的磷酸溶液來配制衍生試劑,使甲醛、乙醛與其衍生來考察加酸量對檢測結(jié)果的影響。如圖2-d所示,在進(jìn)行衍生時(shí),當(dāng)加酸量在1～3 mL時(shí),甲醛-DNPH、乙醛-DNPH峰面積隨著加酸量的增大而增大;當(dāng)加酸量在3～5 mL時(shí),甲醛、乙醛衍生物峰面積隨著加酸量的增大而基本保持不變,因此本試驗(yàn)在配制衍生劑時(shí)加入5 mL磷酸為最佳加酸量。

綜上所述,甲醛、乙醛的最佳衍生條件：衍生劑質(zhì)量濃度3 mg/mL、水浴溫度60 ℃、水浴時(shí)間30 min、加入5 mL磷酸。

a-衍生劑質(zhì)量濃度；b-衍生溫度；c-衍生時(shí)間；d-加酸量圖2 甲醛、乙醛衍生條件優(yōu)化Fig.2 Optimization of the derivation conditions of formaldehyde and acetaldehyde

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限、定量限

分別用不同的食品模擬物配制標(biāo)準(zhǔn)溶液,繪制不同食品模擬物下甲醛和乙醛標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,得到線性回歸方程和檢出限、定量限,以3倍信噪比來計(jì)算檢出限,以10倍信噪比來計(jì)算定量限。如表1所示。結(jié)果表明,甲醛、乙醛在質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性關(guān)系和檢出限及定量限Table 1 Linear relationship，limit of detection and limit of quantitative

2.4 回收率與精密度

為了驗(yàn)證該方法測量結(jié)果的準(zhǔn)確性,選取食品模擬物4%乙酸、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇分別進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。分別在上述食品模擬物中添加甲醛、乙醛混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,添加質(zhì)量濃度分別為0.25、0.50、1.00 mg/L,經(jīng)衍生后進(jìn)行色譜分析,每個(gè)樣品平行6 次,結(jié)果見表2。甲醛、乙醛的回收率在80.22%～107.41%,重復(fù)測定6次的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)<6.57%。說明該方法準(zhǔn)確,可靠,能夠?qū)崿F(xiàn)鋁瓶包裝中甲醛、乙醛的遷移量的準(zhǔn)確檢測。

表2 樣品加標(biāo)回收率與精密度Table 2 Standard recovery and precision of samples

2.5 特定遷移量的測試

根據(jù)GB 31604.1—2015中特定遷移實(shí)驗(yàn)條件的規(guī)定,預(yù)期使用條件是在室溫或低于室溫條件下貯存180 d,選擇升溫加速條件為60 ℃、10 d,因此,利用本文建立的測定方法對60 ℃下保溫10 d的4%乙酸、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇4種食品模擬物中甲醛、乙醛的遷移量進(jìn)行了檢測,每個(gè)樣品做3次平行,測定結(jié)果的平均值見表3。

表3 特定遷移量的測定結(jié)果 單位：mg/kg

鋁瓶向4%乙酸、10%乙醇、20%乙醇、50%乙醇食品模擬物中遷移出甲醛含量依次為3.78、0.81、1.17、1.83 mg/kg,鋁瓶在4%乙酸食品模擬物中遷移出乙醛含量為0.21 mg/kg,鋁瓶在其他食品模擬物中未遷移出乙醛,且遷移出的甲醛、乙醛含量均未超過GB 9685—2016中甲醛、乙醛的限量值?？傮w上鋁瓶中甲醛的遷移量遠(yuǎn)高于乙醛,這主要是由于鋁瓶內(nèi)涂層為熱固性環(huán)氧酚醛涂料,甲醛是環(huán)氧酚醛涂料的起始物質(zhì),其含量比乙醛高。在相同的溫度和時(shí)間下,對于不同食品模擬物,甲醛、乙醛的遷移量存在一定差異。鋁瓶中甲醛向不同食品模擬物中遷移量由大到小依次為:4%乙酸溶液>50%乙醇溶液>20%乙醇溶液>10%乙醇溶液,鋁瓶在4%乙酸食品模擬物中遷移出乙醛,在其他3種食品模擬物中未遷移出乙醛,這可能是因?yàn)榧兹?、乙醛?%乙酸溶液中的溶解度高于乙醇溶液,且隨著乙醇溶液濃度的增加,甲醛、乙醛的溶解度更高。根據(jù)相關(guān)理論,接觸介質(zhì)對該類化合物的溶解度越大,傳質(zhì)阻力越小,擴(kuò)散能力越強(qiáng)。

2.6 不同溫度下甲醛、乙醛向食品模擬物中的遷移規(guī)律

根據(jù)GB 31604.1—2015規(guī)定,實(shí)驗(yàn)條件20 ℃、10 d可替代冷凍貯存30 d以上,40 ℃、10 d可替代冷藏貯存30 d以上,60 ℃、10 d可替代室溫或低于室溫條件下貯存180 d以上,較高溫度或較長時(shí)間下的測試結(jié)果可代替較低溫度或較短時(shí)間下的測試結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)選擇20、40和60 ℃作為升溫加速實(shí)驗(yàn)條件來研究甲醛、乙醛的遷移規(guī)律。

不同溫度下,鋁瓶中甲醛向4種食品模擬物中的遷移規(guī)律如圖3所示,鋁瓶中乙醛向4%乙酸食品模擬物中的遷移規(guī)律如圖4所示。在同一模擬物中,隨著貯存溫度的升高,甲醛或乙醛的遷移量逐漸增加,且遷移量大小次序?yàn)?0 ℃>40 ℃>20 ℃,即溫度越高遷移量越大、遷移速率越高。根據(jù)阿倫尼烏斯方程[23]和Fick第二擴(kuò)散定律[24],溫度上升分子運(yùn)動(dòng)增加,遷移過程中的擴(kuò)散系數(shù)增加,甲醛或乙醛分子的自由能增加,擴(kuò)散活化能降低,使其更容易克服涂層分子間的相互作用力,甲醛、乙醛更容易遷移到食品模擬物中。由圖3-b～d、圖4可知,同一溫度條件下,隨著遷移時(shí)間的增加,在初始階段,鋁瓶中甲醛、乙醛的遷移量呈現(xiàn)快速上升的趨勢,達(dá)到某個(gè)時(shí)間點(diǎn)之后,甲醛或乙醛遷移量的上升速率變慢,并逐漸達(dá)到平衡。這主要是由物質(zhì)的擴(kuò)散理論所決定,在初始階段,可遷出物質(zhì)不斷向食品模擬物中擴(kuò)散,使它們在涂層中的含量不斷下降,在食品模擬物中的含量不斷增加；隨著貯存時(shí)間的延長,涂層和食品模擬物中可遷出物質(zhì)的擴(kuò)散逐漸達(dá)到平衡,遷移量也逐漸保持不變。

圖4 不同溫度和時(shí)間下乙醛向4%乙酸食品 模擬物中遷移規(guī)律Fig.4 Migration pattern of acetaldehyde into 4% acetic acid food simulators at different temperatures and times

此外,除4%乙酸遷移的甲醛之外,遷移溫度越高,甲醛或乙醛的遷移量越容易達(dá)到平衡,主要原因是溫度升高,擴(kuò)散速度增加。而對于4%乙酸食品模擬物,鋁瓶在60 ℃遷移10 d時(shí),甲醛的遷移量并未達(dá)到平衡,隨著遷移時(shí)間的延長有繼續(xù)增加的趨勢。有研究表明,短期儲藏的傳統(tǒng)遷移試驗(yàn)(如60 ℃、10 d)并不能用于預(yù)測長期儲藏的食品[25]。因此4%乙酸模擬物條件下,60 ℃、10 d的遷移試驗(yàn)?zāi)芊耦A(yù)測長期儲存的食品還需要進(jìn)一步研究。

a-4%乙酸;b-10%乙醇;c-20%乙醇;d-50%乙醇圖3 不同溫度和時(shí)間下甲醛向不同模擬物中遷移規(guī)律Fig.3 Formaldehyde migrates to different simulants under different temperatures and times

3 結(jié)論

本研究建立了同時(shí)測定鋁瓶包裝中甲醛、乙醛的高效液相色譜法。該方法在測定范圍內(nèi),線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)R2>0.999,檢出限為0.000 8～0.007 8 mg/L,加標(biāo)回收率為80.22%～107.41%,精密度為0.17%～6.57%。該方法操作簡單快速,能夠用于鋁瓶包裝中甲醛、乙醛遷移量的測試與研究。鋁瓶向不同模擬物中遷移出的甲醛、乙醛含量均未超過GB 9685—2016中甲醛、乙醛的限量值要求,且在相同條件下,鋁瓶中甲醛的遷移量遠(yuǎn)高于乙醛。鋁瓶在4%乙酸食品模擬物中遷移出乙醛而在其他食品模擬物中未遷移出乙醛。隨著溫度的升高和保溫時(shí)間的延長,除4%乙酸食品模擬物遷移的甲醛之外,鋁瓶中甲醛、乙醛的遷移量逐漸升高直至達(dá)到平衡。本研究結(jié)果將為鋁瓶中甲醛、乙醛的遷移量的測定方法以及食品接觸材料相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供參考。