喬榮更，張紅星，謝遠(yuǎn)紅，金君華，劉 慧

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院/食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 102206)

白色念珠菌(Candidaalbicans)是口腔中最常見的致病性真菌，當(dāng)局部微環(huán)境改變或者口腔菌群失衡時，白色念珠菌就會轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【痧つつ钪榫』蛳到y(tǒng)性念珠菌病[1]。若治療不及時，會有癌變的風(fēng)險，而目前主要采用的抗生素療法不僅會破壞口腔菌群的正常生態(tài)，還會導(dǎo)致耐藥性問題，因此選擇安全有效的治療手段具有重要的意義[2]。

在自然界中，乳酸菌廣泛存在各種發(fā)酵食品中，尤其是泡菜，是一種公認(rèn)的益生菌[3]。乳酸菌作為活的微生物，當(dāng)在人體中達(dá)到一定數(shù)量時，會對人體健康有益[4]。據(jù)報道，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌和白色念珠菌共培養(yǎng)后能有效抑制白色念珠菌的生長[5]。本研究旨在為應(yīng)用益生菌防治口腔白色念珠菌提供基礎(chǔ)，為后續(xù)在中國生產(chǎn)研發(fā)相關(guān)產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和儀器

1.1.1 材 料 白色念珠菌(Candidaalbicans) ATCC10231：購自美國典型菌種保藏中心，所用培養(yǎng)基為酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基；泡菜樣品采樣自四川大涼山農(nóng)家泡菜，所用培養(yǎng)基為乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基?，F(xiàn)均保存于北京農(nóng)學(xué)院食品質(zhì)量與安全北京實驗室-81 ℃菌庫中。

乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基制備參見文獻(xiàn)[6]。酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基：2 g胰蛋白胨、1 g酵母浸粉、2 g葡萄糖，溶于100 mL去離子水，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min，其固體培養(yǎng)基每100 mL含1.5 g瓊脂粉。

1.1.2 儀 器 細(xì)菌基因DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司。0.22 μm無菌過濾器，Merck MiLLipore公司；牛津杯(內(nèi)徑6.5 mm，外徑8.0 mm)，北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開發(fā)公司。DL-CJ-1N超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾濱儀器制造有限公司；pHS-3B便攜式酸度計，上海雷磁儀器廠；游標(biāo)卡尺，杭州易宏制造有限公司。

BIOFUGE STRATOS臺式冷凍離心機(jī)、Thermo Scientific；PTC-200型PCR儀，BIO-RAD公司；掃描電鏡SU8100、透射電鏡HT7800(80KV)，日立高新技術(shù)公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸菌的篩選 采用涂布平板法[7]：稱取5 g泡菜樣品放入無菌均質(zhì)袋中，加入45 mL無菌生理鹽水拍打混勻后，梯度稀釋，分別吸取稀釋倍數(shù)為10-3、10-4、10-5、10-6的泡菜樣品100 μL，涂布于含2.5% CaCO3的乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基平板上，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。挑取長勢良好，溶鈣圈明顯的菌落，通過平板劃線法反復(fù)分離純化，菌株編號為SD26，甘油保藏于-80 ℃冰箱。

1.2.2 乳酸菌的鑒定 將菌株SD26進(jìn)行革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗，并對其生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定。試驗結(jié)果對照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》進(jìn)行菌種的初步判定[8]。

根據(jù)細(xì)菌基因DNA提取試劑盒說明操作提取菌株SD26基因DNA，以基因DNA為模板進(jìn)行16S RNA基因的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物使用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)。其中PCR反應(yīng)體系：DNA 1 μL，27F 1 μL，1492R 1 μL，Premix Ex Taq 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，34次循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送去DNA測序(上海生工生物工程有限公司)。測序序列結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中用Blast軟件搜索近似序列，將所測得的序列和從基因庫中獲得的相關(guān)種屬的16S RNA基因序列進(jìn)行比對。

1.2.3 抑菌活性測定 采用牛津杯法[9]，取100 μL活菌數(shù)為107CFU/mL的白色念珠菌于平板內(nèi)，倒入適量加熱熔化的酵母浸出粉胨葡萄糖固體培養(yǎng)基，搖晃均勻，待其冷卻凝固后，在平板內(nèi)適當(dāng)?shù)拈g隔依次放入牛津杯，然后取菌株SD26上清液100 μL添加至牛津杯孔內(nèi)，并用等量的乳酸細(xì)菌液體培養(yǎng)基做陰性對照；質(zhì)量濃度為20 mg/mL的抗真菌藥物咪康唑、氟康唑和克霉唑做陽性對照。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h后測定抑菌圈直徑，3個重復(fù)。

1.2.4 白色念珠菌生長曲線的測定 白色念珠菌生長曲線的測定分為2組。取活菌數(shù)為107CFU/mL的白色念珠菌100 μL接種于5 mL酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中，震蕩均勻。試驗組添加菌株SD26上清液5 mL，對照組不添加菌株SD26上清液。置于37 ℃搖床180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔0、4、8、12、16、20和24 h取樣，測定其OD600 nm，3個重復(fù)，繪制白色念珠菌的生長曲線。

1.2.5 白色念珠菌最小抑菌活菌數(shù)的測定 參照郭夏蕾等[10]的研究方法，并進(jìn)行改進(jìn)，將菌株SD26上清液，調(diào)到3.2×109CFU/mL，然后2倍稀釋至菌液濃度1.6×109、8.0×108、4.0×108、2.0×108CFU/mL，用牛津杯法對活菌數(shù)為3.0×107CFU/mL的白色念珠菌做抑菌試驗。其中，最小抑菌活菌數(shù)以有抑菌圈的最小活菌數(shù)值為準(zhǔn)。

1.2.6 菌株SD26上清液對白色念珠菌細(xì)胞形態(tài)的影響 取生長至對數(shù)期的白色念珠菌菌液，分為2組，以1×104CFU/mL的接種量接到5 mL酵母浸出粉胨葡萄糖液體培養(yǎng)基中振蕩均勻。試驗組向其中加入菌株SD26上清液5 mL，搖勻。對照組不加菌株SD26上清液。放入37 ℃搖床180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h。于4 ℃，1000×g離心10 min，棄上清，將離心管里的沉淀轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管內(nèi)，沿管壁緩緩加入1 mL新預(yù)冷的2.5%戊二醛，置于4 ℃冰箱固定后掃描電鏡掃描菌體表面結(jié)構(gòu)和透射電鏡觀察白色念珠菌的細(xì)胞形態(tài)與內(nèi)部構(gòu)造。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，數(shù)值均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Duncan多重比較檢驗，以P<0.05表示差異顯著。采用Origin8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的篩選

從泡菜樣品中成功篩選分離出1株乳酸菌，稀釋倍數(shù)為10-4時其溶鈣圈見圖1，平板劃線菌落形態(tài)見圖2。

2.2 乳酸菌的鑒定

該篩選菌株革蘭氏染色為紫色，呈陽性。其細(xì)胞形狀為桿狀，接觸酶和氧化酶為陰性，無芽孢形成。其理化試驗結(jié)果見表1，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。根據(jù)該菌種的細(xì)胞形態(tài)、生理生化特征、16S RNA基因序列等數(shù)據(jù)綜合分析，參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》，鑒定結(jié)果為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)SD26。

表1 篩選菌株的理化試驗Tab.1 Physical and chemical tests for screening strains

2.3 抑菌活性測定結(jié)果

由牛津杯法測得菌株SD26及抗真菌藥物咪康唑、氟康唑和克霉唑?qū)Π咨钪榫囊志钚砸妶D4。菌株SD26對白色念珠菌的抑菌活性最大，抑菌圈直徑大于25 mm。而在相同質(zhì)量濃度20 mg/mL下，抗真菌藥物克霉唑?qū)Π咨钪榫囊志χ睆矫黠@大于咪康唑和氟康唑，但均與菌株SD26的抑菌圈直徑存在顯著差異(P<0.05)。

2.4 白色念珠菌生長曲線的測定結(jié)果

對照組無菌株SD26上清液作用的白色念珠菌在24 h內(nèi)其OD600 nm呈逐漸上升趨勢；而試驗組經(jīng)菌株SD26上清液作用的白色念珠菌在24 h內(nèi)其OD600 nm均趨于零水平。由此表明植物乳桿菌菌株SD26上清液能顯著抑制白色念珠菌的生長(圖5)。

2.5 白色念珠菌最小抑菌活菌數(shù)的測定結(jié)果

植物乳桿菌SD26對白色念珠菌的最小抑菌活菌數(shù)可以在某種程度上反映白色念珠菌對植物乳桿菌的敏感性，同時也能反映植物乳桿菌對白色念珠菌的抑菌效果。植物乳桿菌SD26對活菌數(shù)為3.0×107CFU/mL的白色念珠菌的最小抑菌活菌數(shù)為4.0×108CFU/mL (表2)。

表2 植物乳桿菌菌株SD26對白色念珠菌的最小抑菌活菌數(shù)Tab.2 The minimum inhibitory viable number of SD26 against Candida albicans

2.6 菌株SD26上清液對白色念珠菌細(xì)胞形態(tài)的影響

菌株SD26上清液對白色念珠菌細(xì)胞形態(tài)的影響如圖6所示。經(jīng)掃描電鏡對白色念珠菌菌體表面觀察發(fā)現(xiàn)，試驗組和對照組中白色念珠菌菌體表面有明顯的差異性。對照組正常生長狀態(tài)的白色念珠菌菌體表面光滑、無褶皺、無破損現(xiàn)象；而試驗組經(jīng)菌株SD26上清液處理24 h后的白色念珠菌菌體大部分細(xì)胞表面變得粗糙、凹凸不平、扭曲變形，甚至有黏絲狀物質(zhì)出現(xiàn)，菌體表面有褶皺并伴隨空洞現(xiàn)象。

經(jīng)透射電鏡對白色念珠菌菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組正常生長的白色念珠菌菌體細(xì)胞膜與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)完整、均一，胞漿均勻，致密；而試驗組經(jīng)菌株SD26上清液處理24 h后的白色念珠菌菌體細(xì)胞膜破損，細(xì)胞壁變薄，細(xì)胞內(nèi)部胞質(zhì)分散，出現(xiàn)空洞，導(dǎo)致內(nèi)容物流出致死。

綜上，植物乳桿菌SD26對白色念珠菌在細(xì)胞水平上有破壞作用。

3 討 論

近年來，因白色念珠菌導(dǎo)致的口腔真菌感染率在不斷增加，而目前主要采用的抗真菌藥物普遍存在抗菌譜窄、不良反應(yīng)強(qiáng)、生物利用度差和易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)，因此尋找安全、高效和不易產(chǎn)生耐藥性的抗真菌替代方法已成為目前研究的熱點(diǎn)[11]。而采用益生菌乳桿菌干預(yù)口腔致病菌的方法，即可以改善口腔微生態(tài)環(huán)境，又可以讓有益菌成為優(yōu)勢菌維持口腔健康。

在泡菜中廣泛存在乳酸菌且具有食品安全性，因而人們常常從泡菜中篩選分離乳酸菌菌株。杜曉華等[12]從四川發(fā)酵泡菜中篩選得到1株植物乳桿菌；周光燕[13]從發(fā)酵泡菜汁樣品中分離得到8株植物乳桿菌；陳靜等[14]從泡菜中分離得到4株乳酸桿菌。而本研究從四川大涼山農(nóng)家泡菜中成功篩選分離出1株乳酸菌，經(jīng)相關(guān)鑒定該菌株為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) SD26。有研究表明，乳酸菌在生長代謝中能產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素、過氧化氫等物質(zhì)，抑制口腔致病菌的生長繁殖，從而保護(hù)口腔健康[15]。本研究中植物乳桿菌菌株SD26對白色念珠菌的抑菌圈直徑可達(dá)26 mm，顯著大于抗真菌藥物咪康唑、氟康唑和克霉唑，證實了乳酸菌菌株生長代謝產(chǎn)生的物質(zhì)對口腔致病菌的抑制作用。秦蘇佳等[16]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌CCFM8724與致齲雙菌變異鏈球菌和白色念珠菌共培養(yǎng)后，白色念珠菌的生物膜結(jié)構(gòu)明顯變得松散，對其生物膜結(jié)構(gòu)造成十分顯著的破壞。而本研究是將植物乳桿菌SD26與白色念珠菌共培養(yǎng)測定其OD值，與對照組相比，試驗組白色念珠菌的OD600 nm值在24 h趨于零水平，表明植物乳桿菌SD26對白色念珠菌的生長有破壞。王楊等[17]通過研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白色念珠菌細(xì)胞膜受到破壞和損傷時，會增加其菌體細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致其細(xì)胞內(nèi)[K+]、[Ca2+]等離子流失和DNA、RNA等大分子的泄漏，最終引起菌體死亡。本研究通過電鏡試驗觀察到經(jīng)植物乳桿菌SD26作用后的白色念珠菌菌體表面出現(xiàn)凹陷，菌體出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞壁殘缺，細(xì)胞上出現(xiàn)破洞現(xiàn)象。推測植物乳桿菌SD26對白色念珠菌的抑菌機(jī)制是破壞菌體細(xì)胞膜的完整性。

本研究從四川大涼山農(nóng)家泡菜中成功篩選分離出1株乳酸菌，經(jīng)相關(guān)研究鑒定為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) SD26。將該植物乳桿菌SD26對口腔白色念珠菌進(jìn)行抑菌研究，初步發(fā)現(xiàn)其抑菌機(jī)理可能是破壞了白色念珠菌細(xì)胞膜的完整性。