王超， 高雨婷， 劉子瑤， 李濤， 王晶哲， 劉璐， 謝巖， 孫曉春

(江蘇大學醫(yī)學院， 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)最新發(fā)布的2020年全球癌癥負擔數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌新發(fā)病例高達226萬例，超過肺癌的220萬例，成為全球第一大癌[1]。隨著乳腺癌手術、化療、放療、內(nèi)分泌治療、免疫治療及多種聯(lián)合治療策略的應用，乳腺癌患者的生存期明顯延長[2-4]。然而，仍有許多乳腺癌患者最終出現(xiàn)復發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥。

微小RNAs(microRNAs, miRNAs)是一類微小、內(nèi)源性調(diào)節(jié)多種生物作用的非編碼RNA，參與細胞分化、器官發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等多種生物學過程[5]。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在多種腫瘤中存在異常表達，并且在腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥性以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)進程中起重要作用[6-8]。miR-200家族在癌癥中的異常表達及其參與EMT進程已得到充分研究。在浸潤性乳腺癌中，miR-200與E-鈣黏蛋白水平顯著相關[9]；miR-200家族成員的過表達導致E-鈣黏蛋白表達上調(diào)，并通過靶向轉(zhuǎn)錄因子ZEB1和鋅指結(jié)構(gòu)E-bok-結(jié)合同源框2(ZEB2)抑制EMT進程[10]；miR-145可以通過直接調(diào)節(jié)N-鈣黏蛋白和ZEB2表達抑制胃癌EMT進程[11]。

研究表明，miR-376c-3p在胃癌[12]、肝細胞癌[13]、神經(jīng)母細胞瘤[14]和口腔鱗癌[15]等多種腫瘤中呈異常表達。miR-376c-3p在抑制胃腫瘤生長及腫瘤相關基因表達中具有重要作用，其在胃癌中表達下調(diào)，可靶向SYF2從而抑制胃癌細胞的增殖和遷移[12]。過表達hsa-miR-376c-3p可促進胃癌細胞凋亡和G1期阻滯[16]。miR-376c-3p通過靶向同源框B7(HOXB7)抑制人口腔鱗癌細胞增殖、侵襲、遷移和凋亡[15]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-376c-3p在三陰性乳腺癌中表達下調(diào)[17]，但其在乳腺癌中的作用并不明確。因此，本研究中檢測其在乳腺癌中的表達水平以及生物學功能，并結(jié)合生物信息學探討其分子調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系、主要試劑及儀器

人乳腺上皮細胞系MCF-10A購于上海富衡細胞庫；人乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-231購于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。MEGM(瑞士Lonza/Clonetics公司)；H-DMEM(美國Gibco公司)；胎牛血清(以色列BI公司)；胰酶(美國Sigma公司)；Trizol及LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)；PowerUpTMSYBRTMGreen實時熒光定量PCR試劑盒、熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；鏈霉素、青霉素、蛋白質(zhì)裂解液RIPA、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、兔抗人E-鈣黏蛋白抗體以及兔抗人波形蛋白抗體均購自上海碧云天公司；兔抗人谷氨酸受體相互作用蛋白1(GRIP1)抗體(美國SAB公司)；兔抗人GAPDH抗體(美國CST公司)；HRP標記羊抗兔IgG(上海愛必信公司)。CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標儀(美國Biotek公司)；化學發(fā)光凝膠成像分析系統(tǒng)(美國GE公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)和細胞轉(zhuǎn)染

在MEGM中加入100 ng/mL霍亂毒素配制成MCF-10A完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人乳腺上皮MCF-10A細胞。

用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的H-DMEM，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞。取生長狀態(tài)良好的MCF-7和MDA-MB-231細胞常規(guī)消化，用無雙抗的H-DMEM完全培養(yǎng)基重懸制成單細胞懸液，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度為1×105/mL，在6孔板中加入2 mL細胞懸液，置于37 ℃恒溫、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；次日待貼壁細胞融合度達到70%左右時根據(jù)LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。

實驗設陰性對照、miR-376c-3p mimic組，每組3個復孔。在EP管中用125 μL無血清培養(yǎng)基稀釋7.5 μL的LipofectamineTM3000，在另外EP管中用125 μL無血清培養(yǎng)基稀釋100 pmol miR-376c-3p mimic或陰性對照RNA序列；將稀釋的mimic或陰性對照RNA序列加入至稀釋的LipofectamineTM3000中，室溫孵育10～15 min；加入到含有1.75 mL無雙抗完全培養(yǎng)基的人乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細胞中輕柔搖勻。轉(zhuǎn)染6 h左右，根據(jù)細胞情況進行換液，進行后續(xù)實驗。

1.3 qRT-PCR檢測乳腺上皮和乳腺癌細胞中miR-376c-3p表達水平

按照Trizol試劑說明書提取總RNA，用紫外分光光度儀測定所提RNA濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后以cDNA為模板進行PCR擴增引物，并以U6作為內(nèi)參，實驗設3個復孔，重復3次。所用引物由上海生工生物設計并合成，具體序列如下，miR-376c-3p：上游5′-CGCGCG AACATAGAGGAAATT-3′，下游5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3；U6：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。qRT-PCR反應條件：50 ℃ 尿嘧啶-DNA糖基化酶激活2 min；95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)。通過2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。

1.4 平板克隆實驗檢測乳腺癌細胞克隆能力

MCF-7和MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染6 h后，常規(guī)消化收集，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至500個/孔接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)3～4 d換液；培養(yǎng)10～14 d，PBS洗2～3次，4%多聚甲醛固定細胞30 min；PBS洗2～3遍；結(jié)晶紫染色15 min；PBS洗2～3遍；拍照計數(shù)并統(tǒng)計分析。

1.5 劃痕實驗檢測乳腺癌細胞遷移能力

MCF-7和MDA-MB-231細胞在6孔板轉(zhuǎn)染后，待細胞融合度達到90%以上時，用200 μL槍頭在6孔板中劃3條直線，再用無血清培養(yǎng)液漂洗直到無漂浮的細胞為止，置于倒置顯微鏡下觀察并隨機選取3個視野拍照(0 h)，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.6 Transwell遷移實驗檢測乳腺癌細胞遷移能力

在MCF-7和MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染48 h后，常規(guī)消化收集細胞，計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至5×105/mL，在Transwell下室內(nèi)加入800 μL含10%胎牛血清的H-DMEM完全培養(yǎng)基，在Transwell上室內(nèi)加入100 μL細胞懸液，于37 ℃、5% CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)16～24 h；吸干上室內(nèi)液體，用棉簽輕柔除去上室內(nèi)未遷移細胞，于4%多聚甲醛中固定30 min；結(jié)晶紫染色30 min；于顯微鏡下隨機觀察5個視野，并進行計數(shù)和統(tǒng)計。

1.7 生物信息學分析

通過Starbase網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/)對miR-376c-3p進行檢索，預測其靶基因；然后將預測到的靶基因作為研究對象，使用OncoLnc在線生存分析網(wǎng)站(http://www.oncolnc.org/)對TCGA數(shù)據(jù)庫中浸潤性乳腺癌(breast invasive carcinoma，BRCA)進行生存分析，根據(jù)GRIP1表達水平中位數(shù)將BRCA患者分為GRIP1高表達組與GRIP1低表達組。

1.8 蛋白質(zhì)印跡實驗檢測GRIP1、E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達水平

在MCF-7和MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)染48 h后，PBS洗2～3遍，加入200 μL RIPA裂解液(RIPA ∶PMSF=100 ∶1)裂解細胞，收集細胞裂解液，全程冰上操作；4 ℃，12 000×g離心15 min，取上清液，并用BCA蛋白濃度檢測試劑盒定量濃度；根據(jù)濃度加入上樣緩沖液，100 ℃熱變性10 min，分裝于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?0 μg蛋白行10% SDS-PAGE分離蛋白，80 V電泳30 min，待溴酚藍顯示于下層膠后將電壓調(diào)至110 V，適時終止電泳；然后，以300 mA濕轉(zhuǎn)120 min至PVDF膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別加入兔抗人GRIP1抗體、兔抗人E-鈣黏蛋白抗體、兔抗人波形蛋白抗體、兔抗人GAPDH抗體(內(nèi)參)，均1 ∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，每次10 min；HRP標記羊抗兔二抗(1 ∶5 000稀釋)室溫孵育2 h；TBST洗膜3次，每次10 min；加入ECL曝光液顯影、拍攝并計算灰度值。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 miR-376c-3p在乳腺癌細胞中呈低表達

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與人正常乳腺上皮MCF-10A細胞相比，miR-376c-3p在乳腺癌MCF-7細胞(t=19.460，P<0.01)和MDA-MB-231細胞(t=34.940，P<0.01)中的表達水平顯著降低(圖1)。

圖1 qRT-PCR法檢測miR-376c-3p在不同乳腺細胞系中的表達水平

2.2 miR-376c-3p過表達抑制乳腺癌細胞增殖

qRT-PCR結(jié)果顯示，miR-376c-3p mimic組乳腺癌MCF-7細胞(t=-15.542，P<0.01)和MDA-MB-231細胞(t=-12.072，P<0.01)miR-376c-3p表達顯著上調(diào)(圖2)。平板克隆形成實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-376c-3p mimic組MCF-7細胞(t=4.492，P<0.05)和MDA-MB-231細胞(t=9.055，P<0.01)克隆形成的集落數(shù)量明顯減少(圖3)，提示miR-376c-3p能夠顯著抑制乳腺癌細胞的增殖能力。

圖2 qRT-PCR法檢測miR-376c-3p mimic轉(zhuǎn)染效率

圖3 miR-376c-3p對乳腺癌細胞克隆形成能力的影響

2.3 miR-376c-3p過表達抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲能力

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-376c-3p mimic組MCF-7細胞(t=9.999，P<0.01)以及MDA-MB-231細胞(t=9.773，P<0.01)的遷移細胞數(shù)顯著減少(圖4)。劃痕實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-376c-3p mimic組MCF-7細胞(t=6.042，P<0.01)和MDA-MB-231細胞(t=5.257，P<0.01)劃痕愈合率顯著降低(圖5)。

圖4 miR-376c-3p對乳腺癌細胞遷移能力的影響(×100)

圖5 miR-376c-3p對乳腺癌細胞劃痕愈合率的影響(×40)

2.4 miR-376c-3p靶向GRIP1調(diào)控乳腺癌細胞EMT相關蛋白的表達

通過生物信息學Starbase網(wǎng)站預測發(fā)現(xiàn)miR-376c-3p與GRIP1存在相互結(jié)合位點(圖6)；生存分析結(jié)果顯示，GRIP1高表達組BRCA患者的總體生存期明顯縮短(Cox系數(shù)=0.214，P<0.05)，GRIP1高表達與患者預后不良有關(圖7)。

圖6 miR-376c-3p與GRIP1相互結(jié)合位點

圖7 GRIP1表達與BRCA總體生存期的關系

蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，miR-376c-3p mimic組乳腺癌細胞GRIP1蛋白表達水平顯著降低(MCF-7細胞t=10.240，MDA-MB-231細胞t=4.913，P均<0.05)；與此同時，EMT相關蛋白E-鈣黏蛋白表達水平明顯增高(MCF-7細胞t=12.440，MDA-MB-231細胞t=6.444，P均<0.01)，波形蛋白表達顯著降低(MCF-7細胞t=12.360，MDA-MB-231細胞t=9.023，P均<0.01)。見圖8。由此可見，miR-376c-3p可能通過靶向GRIP1抑制乳腺癌細胞EMT進程。

圖8 蛋白質(zhì)印跡實驗檢測乳腺癌細胞中相關蛋白的表達水平

3 討論

研究表明，miRNAs是腫瘤惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)控因子[18]。本研究中miR-376c-3p在乳腺癌細胞中表達下調(diào)，且下調(diào)水平與乳腺癌細胞的惡性程度相關，與之前報道一致[16]。由此提示，miR-376c-3p可能作為乳腺癌新的診斷分子標志物，其表達下調(diào)極有可能參與調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。為探討miR-376c-3p在乳腺癌中的生物學功能，本研究利用miR-376c-3p mimic轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7以及MDA-MB-231細胞，結(jié)果顯示外源性過表達miR-376c-3p可以顯著抑制乳腺癌細胞的生長。此外，Transwell遷移實驗以及細胞劃痕實驗顯示，上調(diào)乳腺癌細胞中miR-376c-3p表達可以顯著抑制細胞的遷移能力。由此表明，在乳腺癌進展中，miR-376c-3p可以作為腫瘤抑制因子抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移能力。然而，在肝細胞癌中miR-376c-3p可能發(fā)揮致癌作用促進腫瘤進展[13]，這可能與腫瘤的異質(zhì)性以及不同的分子調(diào)控機制有關。

miRNAs可通過靶向mRNAs序列的3′-非翻譯區(qū)廣泛參與多種基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程，進而影響細胞的生物學功能。為進一步分析miR-376c-3p在乳腺癌中的調(diào)控機制，本研究通過在線生物信息學網(wǎng)站預測到GRIP1是miR-376c-3p的潛在靶基因；進一步實驗發(fā)現(xiàn)，miR-376c-3p靶向GRIP1基因調(diào)控GRIP1蛋白表達，同時影響乳腺癌EMT相關蛋白的表達水平，進而調(diào)控乳腺癌的生物學行為。通過生存分析發(fā)現(xiàn)，GRIP1表達水平與乳腺癌患者生存期呈顯著負相關，然而，其在乳腺癌中的作用并未明確。此前有報道稱，GRIP1可以通過與14-3-3蛋白間相互作用，從而調(diào)控神經(jīng)元物質(zhì)運輸[19]。研究表明，14-3-3蛋白在多種腫瘤中呈異常表達[20]，與乳腺癌轉(zhuǎn)移風險密切相關[21-22]，有望成為提示乳腺癌患者總生存期和無復發(fā)生存期的預后生物標志物[23]。然而，GRIP1是否可以通過14-3-3蛋白進而影響乳腺癌的進展及作用機制尚未明確，仍需深入研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明miR-376c-3p可能作為腫瘤抑制因子通過靶向GRIP1調(diào)控乳腺癌細胞的增殖、遷移以及EMT進程。但是，本研究僅在體外乳腺癌細胞中進行，仍需在臨床樣本中研究miR-376c-3p對乳腺癌的診斷價值。此外miR-376c-3p與GRIP1在乳腺癌中的生物學功能以及相關信號轉(zhuǎn)導通路的激活還有待于后續(xù)進一步研究。